大豆α-生育酚的遗传与QTL分析
大豆α-生育酚的遗传与QTL分析
摘要：【目的】通过对大豆α-生育酚进行遗传和QTL分析，研究其遗传机制，定位其主效QTL，为高α-生育酚含量的大豆品种选育奠定遗传学基础。【方法】以栽培大豆晋豆23为母本、山西农家品种大豆灰布支黑豆（ZDD02315）为父本杂交衍生的447个RIL作为供试群体构建遗传图谱，试验群体及亲本分别于2011年、2012年和2015年夏季在河南省农业科学院原阳试验基地种植，冬季在海南省三亚南繁基地种植。田间试验采取随机区组设计，2次重复。从6个环境中每个家系选取15.00 g籽粒饱满，大小一致的大豆种子，利用高效液相色谱法定性、定量测定样品中的α-生育酚含量。采用主基因+多基因混合遗传分离分析法和WinQTLCart 2.5复合区间作图法，对大豆α-生育酚含量进行主基因+多基因混合遗传分析和QTL定位。【结果】基于主基因+多基因混合遗传分离分析法，α-生育酚受4对主基因控制，遗传基因分布在双亲中。4对主基因间加性效应值中3对为正值，表明这些基因来源于母本晋豆23；1对为负值，表明该对基因来源于父本灰布支黑豆；4对主基因之间相互作用的上位性效应表现为正值和负值的各有3对，说明不同基因间上位性效应对α-TOC的影响方向并不完全一致。环境因素引起的变异为0.13%—4.05%。表明α-TOC主要受4对主基因影响，受环境因素影响较小。采用WinQTLCart 2.5复合区间作图（CIM）共检测到17个影响α-生育酚的QTL，分布于第1、2、5、6、8、14、16、17共8条染色体中，单个QTL的贡献率8.35%—35.78%，QTL主要表现为加性效应。qα-D1a-1同时在2011年原阳、2012年原阳和三亚、2015年原阳4个环境下检测到，且均定位在第1染色体Satt320—Satt254标记区间19.79 cM处，解释的表型变异分别为12.55%、12.01%和11.89%、12.61%，加性效应值0.119-0.132，增加α-TOC含量的等位基因来自母本晋豆23；qα-A2-1同时在2011年原阳和三亚、2015年原阳3个环境下检测到，且均定位在第8染色体Sat_129—Satt377标记区间44.53 cM处，解释的表型变异分别为23.18%和22.56%、23.01%，加性效应值-0.195—-0.180，增加α-TOC含量的等位基因来自父本灰布支黑豆。qα-D1a-1和qα-A2-1 2个QTL能够稳定遗传。【结论】α-生育酚最适遗传模型符合4MG-AI，即4对具有加性上位性效应的主基因遗传模型。其遗传主要受4对主基因影响，受环境因素影响较小。检测到α-生育酚的2个稳定主效QTL，Satt320—Satt254和Sat_129—Satt377是共位标记区间。
关键词：大豆；α-生育酚；主基因+多基因；遗传；QTL
0 引言
【研究意义】大豆维生素E是脂溶性维生素，参与生物体内信号转导、基因表达调控、抗低温胁迫等多种代谢途径，具有提高机体免疫力、抗不育、抗癌及预防心血管疾病的作用。天然维生素E中，只有α-生育酚能被人体很好地吸收和代谢，而且α-生育酚的生物活性高，因此维生素E主要以α-生育酚含量为指标。近年来，天然维生素E以每年10%的需求增长，但是，中国国内产量较少，生产几乎被美国、德国、日本等国家垄断。因此，选育富含高α-生育酚的大豆品种有重要意义。【前人研究进展】目前，α-生育酚QTL定位研究主要集中在玉米、油菜、大麦、向日葵和芥菜，大豆α-生育酚的遗传机制和QTL定位较少。Dwiyanti等用SSR标记对大豆F2和F3群体中α-生育酚含量进行了遗传分析，发现K连锁群对α-生育酚含量影响较大。Shaw等利用Bayfield×Shire重组自交系群体（RIL），检测到6个控制α-生育酚的QTL，分别定位在第1、2、4、5、12和20染色体上。Li等利用Bayfield×Hefeng 25大豆RIL群体检测到4个控制α生育酚的QTL，分别定位在第2、6、8和20染色体上。张红梅等利用Essex×ZDD2315大豆RIL群体分别检测到2个和4对控制大豆α-生育酚的加性和互作QTL。【本研究切入点】目前，关于大豆α-生育酚QTL被检测到的报道较少，由于遗传背景和环境条件的不同，表现稳定的更少，大豆α-生育酚分子标记辅助育种受到限制。【拟解决的关键问题】本研究以晋豆23×灰布支黑豆衍生的447个RIL为试验材料，利用WinQTLCart2.5复合区间模型分析方法，对大豆α-生育酚进行QTL定位分析；采用主基因+多基因混合遗传分离分析方法，分析α-生育酚含量遗传规律，为高α-生育酚含量的大豆品种选育奠定遗传学基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料与设计
供试材料为山西省农业科学院经济作物研究所配制的晋豆23×灰布支黑豆杂交组合。该组合包含447个家系的重组自交系群体，即每一F2单株衍生成F2家系，每一F2家系再选株建成家系，至2011年是F14代。亲本晋豆23和灰布支黑豆分别来自山西省栽培大豆和农家品种。试验群体及亲本分别于2011年、2012年和2015年夏季在河南省农业科学院原阳试验基地种植，冬季在海南省三亚南繁基地种植。田间试验采取随机区组设计，2次重复，行长4.0 m，行距0.4 m。按照大田模式进行田间管理，四周分设保护行，一播全苗。
1.2 α-生育酚含量测定及数据分析
分别从6个环境下每个重复、每个家系各选取15.00 g大小一致、籽粒饱满的大豆种子，用旋风磨（Retsch ZM100，Φ = 1.0 mm，Rheinische，Germany）磨粉。取样粉碎后的豆粉样品2.5 g，加入30 mL无水乙醇混合均匀，再加入5 mL浓度10%抗坏血酸溶液和10 mL氢氧化钾溶液，用恒温水浴皂化30 min；然后提取皂化液，采用100 mL正己烷分3次进行，弃去水层；最后，用无水硫酸钠过滤提取液，在旋转蒸发瓶中旋转蒸发，将残留液用氮气吹干，再用2.5 mL甲醇溶液进行溶解，通过0.45 μm滤膜，4℃保存备用。
利用高效液相色谱技术（high performance liquid chromatography，HPLC），采用外标法对α-生育酚异构体进行定量分析。色谱柱为DIKMA公司产品，色谱柱填料为symmetry，钻石C18，5 μm，柱规格为250.0 mm×4.6 mm；荧光检测器激发波长290 nm，发射波长330 nm；选用甲醇为流动相，流速1.5 mL·min-1。柱温40℃，进样量20 μL，检测时间10 min。以α-生育酚（Alpha tocopherol，以下简称α-TOC）峰面积代入回归方程进行定量分析。α-生育酚含量的计量单位是：mg·(100 g)-1
利用SAS V9.2软件的PROC ANOVA程序对6种环境下α-生育酚含量进行联合方差分析和描述统计。遗传变异系数GCV（100%）=σg/μ×100。其中σg为遗传方差的标准差；μ为群体平均数，均由试验数据估计。遗传率h2 = σg2/[σg2+(σge2/n)+ (σ2/rn)]，其中：σg2为遗传方差；σge2为基因型×年份（环境）方差；σ2为误差方差；r为重复数；n为年份数。
1.3 遗传连锁图谱的构建与QTL分析
利用Mapmaker/Exp 3.0构建连锁图谱，图谱总长度2 047.6 cM。包括27个连锁群、227个SSR标记，平均图距8.8 cM（该图谱在在H（Chr.12）染色体出现了1个间隙，在K（Chr.9）、F（Chr.13）和J（Chr.16）3条染色体上均出现了2个间隙，形成了27个连锁群）。经与Song等整合的图谱相比对，标记排序相对一致。引物信息、标记试验过程及作图过程见参考文献。
QTL定位软件为WinQTLCart 2.5，命名方式参照McCouch等方法。定位采用软件中复合区间作图法（CIM）Zmapqtl方法的Model 6，设置该窗口之外的5个标记作为余因子、步移速度2 cM，向前回归法全基因组扫描，以确定各性状QTL数目及其在染色体上的位置。选取临界阈值LOD=2.5（0.05显著水平），检测各环境下的QTL效应。当LOD≥2.5时，认为该位置上QTL存在，临近位点间图距小于5 cM时，认定为同一个QTL。
1.4 数量性状主基因+多基因混合遗传模型分析
采用主基因+多基因混合遗传分离分析法中极大似然法和IECM估算晋豆23×灰布支黑豆及其衍生的RIL各世代、各成分分布的参数，，通过AIC准则和一组适合性测验，选择最适遗传模型；利用每一个成分的分布参数通过最小二乘法估计相应的遗传参数。主基因遗传率hmg2 (%) = σmg2/σp2，多基因遗传率hpg2 (%) = σpg2/σp2，环境遗传率he2 (%) = σe2/σp2。各遗传方差间的关系为σp2 = σmg2+σpg2+σe2。其中：σp2为群体表型方差；σmg2为主基因遗传方差；σpg2为多基因遗传方差；σe2为多环境遗传方差。
2 结果
2.1 大豆α-生育酚含量的表型分析
表1和图1列出了亲本和RIL群体中α-生育酚含量的表型变异情况。原阳和三亚2个地点3年试验中α-生育酚亲本差分别为-0.68和-0.72、-0.70和-0.64、-0.71和-0.79，平均差分别为-0.70和-0.72。经t值检测，双亲均值在各年度、各地点均差异显著。2个亲本在后代分离群体中表现出较大的分离程度，不同环境下，RIL群体的最小值和最大值之间差异明显，存在较大幅度超亲分离，表明亲本间位点互补，大豆α-生育酚遗传基因分布在双亲中，通过杂交可以得到超亲分离的株系。α-生育酚含量呈现出近似正态的连续分布。同一性状同一地点不同年份间遗传变异系数差别不大。α-生育酚3年间2点的遗传率为62.03%—77.35%。表2为3年联合方差分析结果。α-生育酚基因型在组分间存在显著差异，其余变异包括不同环境之间、重复间、年份×地点、年份×基因、地点×基因、年份×地点×基因差异不显著，表明大豆α-生育酚含量的表达主要受基因的影响，环境影响较小。
表1 RIL群体大豆α-生育酚含量表型变异
Table 1 Phenotypic variation of α-TOC contents of soybean seed in RIL population
**表示在0.01水平差异极显著；t值=双亲均值差异显著性(t值)
** significance at the 0.01 levels; t value=Significant test for difference in parents means (t value)
表2 大豆种子α-生育酚含量方差分析
Table 2 Variance analysis of α-TOC contents in soybean seeds
*表示在0.05水平差异显著
*significance at the 0.05 levels
：灰布支黑豆α-生育酚含量α-TOC content of Huibuzhiheidou；：晋豆23 α-生育酚含量α-TOC content of Jindou23
图1 不同环境RILs群体α-生育酚含量分布图
Fig. 1 Distribution of α-TOC among the two parents and the RILs population across six environments
2.2 α-生育酚的主基因+多基因混合遗传分析
分别选用2011年、2012年和2015年各环境下试验数据的平均值进行主基因+多基因混合遗传分析，根据AIC值和适合性测验（表3），α-TOC最适遗传模型符合4MG-AI，即4对具有加性上位性效应的主基因遗传模型。4对主基因间加性效应值中3对为正值，表明基因来源于母本晋豆23；1对为负值，表明基因来源于父本灰布支黑豆；4对主基因之间相互作用的上位性效应表现为正值和负值的各有3对，说明不同基因间上位性效应对α-TOC的影响方向并不完全一致。3年6个环境中均表现出较大的遗传力，达到95.95%—99.87%，没有检测到多基因效应。环境因素引起的变异为0.13%—4.05%，效应值较小。说明α-TOC的遗传主要受4对主基因影响，环境影响较小。
表3 α-生育酚最适模型及遗传参数估计结果
Table 3 Analysis of the best models and genetic parameters for α-TOC
2.3 大豆α-生育酚的QTL定位
根据WinQTLCart 2.5的定位结果，共在8个连锁群上检测到17个α-生育酚的QTL（表4，图2），分别位于A1（Chr.5）、A2（Chr.8）、B2（Chr.14）、C2（Chr.6）、D1a（Chr.1）、D1b（Chr.2）、D2（Chr.17）和J_2（Chr.16）染色体上，解释的表型变异范围为8.35%—35.78%。位于A1（Chr.5）染色体Satt545—Satt511标记区间的qα-A1-1，表型贡献率为35.78%，解释的表型变异最大。其中，qα-D1a-1同时在2011年原阳、2012年原阳和三亚、2015年原阳4个环境下检测到，且均定位在D1a（Chr.1）染色体Satt320—Satt254标记区间19.79 cM处，解释的表型变异分别为12.55%、12.01%和11.89%、12.61%，说明这是一个能够稳定遗传的QTL。加性效应值0.119—0.132，增加α-TOC含量的等位基因来自母本晋豆23；同时，在qα-D1a-2和qα-D1a-3均被定位在D1a（Chr.1）染色体上，但2个QTL位置相距较远，应该不是同一个QTL，说明D1a（Chr.1）染色体上可能存在多个与α-TOC相关的基因。qα-A2-1同时在2011年原阳和三亚、2015年原阳3个环境下检测到，且均定位在A2（Chr.8）染色体Sat_129—Satt377标记区间44.53 cM处，解释的表型变异分别为23.18%和22.56%、23.01%，说明这是一个能够稳定遗传的QTL。加性效应值-0.195—-0.180，增加α-TOC含量的等位基因来自父本灰布支黑豆。加性效应值正负表现不一，加性效应值为正，说明该QTL对大豆α-生育酚含量起正向作用，等位基因来自于母本晋豆23；加性效应值为负，说明说明该QTL对大豆α-生育酚含量起负向作用，等位基因来自于父本灰布支黑豆。
3 讨论
3.1 大豆α-生育酚的遗传机制
本研究采用混合遗传模型分离分析方法研究大豆α-生育酚在河南省和海南省2个地点3个年份共6个环境中的遗传；采用WinQTLCart 2.5软件中CIM方法进行QTL定位分析。研究表明，α-生育酚的遗传最适遗传模型符合4MG-AI，即4对具有加性上位性效应的主基因遗传模型。3年6个环境中的遗传力达95.95%—99.87%，环境因素引起的变异仅为0.13%—4.05%。说明α-TOC的遗传主要受到4对主基因影响，受环境因素影响较小。同时，本研究在8条染色体中检测到17个α-生育酚的QTL。2种分析结果相比较，发现QTL定位数目与遗传模型预测的数目并不完全一致。2011年原阳和2012年三亚各检测出4个QTL，与α-生育酚最适遗传模型4MG-AI一致，但是其余环境中检测出的QTL数目为2—3个，与遗传模型预测的数目不统一。出现这种现象的可能原因有：1）与QTL定位图谱有关。与标准图谱相比较，本研究选用的图谱本身还需要进一步完善；2）与混合遗传模型有关。本研究选用的是4对主基因+多基因混合遗传模型，该模型只分析了主基因间无连锁的情况，简化了主基因间的连锁作用。同时，该遗传模型成分分布数和待估参数比较多，分析过程受到限制，估算结果的准确性有待提高；3）控制α-生育酚含量的表达在时空上存在差异。因此，对于α-生育酚含量的遗传机理研究，在本研究的基础上尚需进一步深化。
表4 α-生育酚QTL位置及其参数
Table 4 QTL positions and its parameters for α-TOC
图2 检测到的QTL及加性效应QTL在连锁群上的分布
Fig. 2 Distribution of main QTLs and additive QTLs on linkage groups
3.2 大豆α-生育酚含量的QTL分析及与前人定位结果的比较
为了提高QTL定位的精度，通常采取多年多点数 据分析方法，增大QTL检测强度，进而挖掘出表现稳定的QTL。本研究分析了3年2个地点共6个环境中α-生育酚含量，4个环境下在D1a（Chr.1）染色体Satt320—Satt254标记区间19.79 cM处均检测到qα-D1a-1，3个环境下在A2（Chr.8）染色体Sat_129—Satt377标记区间44.53 cM处均检测到qα-A2-1，表明qα-D1a-1和qα-A2-1为α-生育酚的稳定主效QTL，与之相对应的2个区间也是相对准确可靠。下一步研究将对该共位标记区间实施精细定位，通过将关联的目标区间内的主效QTL剖分为几个连锁的多效性QTL，搜索可能的候选基因，为高α-生育酚含量分子标记辅助育种奠定基础。
生物的遗传和进化过程中，广泛存在多因一效和一因多效现象。这两种基因作用方式从不同角度共同促进生命活动的发现。多因一效促成了生物多样性。不同的生物过程参与到同一种表型上，降低了单因素所带来的局限性，出现了多态性。一因多效将多种过程联系起来，共同参与基因表达过程，形成一系列生物轴，一方面促进行为的统一性，一方面形成正负反馈，避免生理生化过程的失稳。本研究发现，在8个连锁群上共检测到17个α-生育酚的QTL，加性效应值正负均有表现，这些等位基因一方面来自于母本晋豆23，一方面来自于父本灰布支黑豆，推测多因一效可能存在于α-生育酚的形成过程。同时也发现，本研究中稳定表达的与α-生育酚含量相关标记Sat_129和Satt377，在以往研究中，Sat_129与影响大豆生育期脂肪含量和染料木素的基因位点位于同一区域；与影响大豆染料木苷、生育期和耐涝性基因位点位于同一区域；Satt041与影响大豆侧根数、Satt267与影响大豆茸毛和侧根数的基因位点位于同一区域。表明控制这些性状的基因可能存在一因多效现象。这些基因位点之间是否存在表达调控机制并通过QTL间的上位性反映出来的？不同研究中这些发挥作用的位点又如何影响到α-生育酚的差异呢？需要进行深入研究与探讨。
与以往研究相比，尽管各研究选用的群体、图谱和环境条件不同，仍有一部分α-生育酚定位结果相吻合。与Shaw等相比较，均定位在A1、D1a和D1b染色体上，且在A1染色体上均定位在Satt545标记处；与Li等相比较，均定位在B2、C2和D1b染色体上；与张红梅等相比较，均定位在A1和C2染色体上；与李海燕等相比较，均定位在A2、C2和D1b染色体上。但是，本研究中检测出的qα-D1a-1和qα-A2-1 2个稳定主效QTL，前人研究中虽然在这两条染色体上均检测出α-生育酚QTL，但是均不再同一个标记区间，分析其原因可能受到定位群体、定位图谱、遗传背景或环境差异等诸多因素影响。除此之外，本研究中定位出的其他QTL，均未见公开报道。
3.3 遗传图谱对QTL定位的影响
遗传图谱的构建在基因定位与图位克隆、遗传多样性及遗传标记辅助选择育种等方面都具有重要意义。遗传图谱的应用价值，与图谱的饱和度、标记数量的多少、标记在图谱上定位的准确性、标记在图谱上分布的均匀程度等有关。一个基本的连锁框架图要求标记间平均间距不超过20 cM。主基因定位时，其平均距离要求在10—20 cM或更小。如果连锁群标记较少，图谱上标记的密度较低，会对QTL的检出效率造成影响，可能检测不到效应值较小的QTL，影响定位的准确性。同时，从另一角度分析，此时依然能够被检测到的QTL，可能是效应较大的主效QTL，对数量性状基因的图位克隆和分子标记辅助选择更具实际价值。但是，因为前者降低了QTL定位的准确性，其价值与提高LOD的阈值来检测主效QTL相比依然不可同日而语。本研究图谱是由海南省热带农业资源开发利用研究所方宣钧研究员提供的（论文中致谢部分有说明），图谱总长度2 047.6 cM，平均图距8.8 cM，总体上看图谱平均间距尚能满足定位要求。下一步工作中，希望能进一步提高图谱分子标记密度和图谱饱和度，不断提高定位结果的精准度。尽管如此，利用该图谱定位了一批大豆数量性状的QTL，在国内外期刊发表，研究结果仍然具有一定的理论和现实意义。
本研究所得定位结果与前人相比，多个QTL定位均在相同的染色体上，但定位的标记区间不尽相同，定位位置是否重叠尚不能确定。因为，不同研究中选用的图谱不尽相同，图谱不尽完善，所定位的标记区间是否重叠还需要随着研究手段和使用图谱的不断进步和完善逐步得到验证。Li等认为，由于作图群体所用亲本不同，长期的遗传演化过程中，亲本材料染色体结构会发生变异，相同序列所处的区段在不同的亲本中发生改变，导致在不同的研究者之间即便采用相同的分子标记构建的连锁图谱之间，分子标记在连锁群上的排列顺序也不尽相同。分子标记用于遗传图谱构建是遗传学领域的重大进展之一，随着新的标记技术的发展，图谱上标记的密度也将越来越高。目前的工作可以为将来更加精细的定位提供参考
目前，国内外研究中，QTL定位结果精细程度依然不足。下一步科学研究工作的方向可以通过对大豆α-生育酚性状进行QTL精细作图定位，重点跟踪研究多环境、多分析方法均能检测到的QTL区域，发掘控制α-生育酚的功能基因。
4 结论
α-生育酚最适遗传模型符合4MG-AI，即4对具有加性上位性效应的主基因遗传模型。其遗传主要受4对主基因影响，受环境因素影响较小。检测到α-生育酚的2个稳定主效QTL，Satt320—Satt254和Sat_129—Satt377是共位标记区间。
致谢：本研究连锁图谱和群体材料由海南省热带农业资源开发利用研究所方宣钧研究员和山西省农业科学院经济作物研究所刘学义研究员提供，在此表示感谢。
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