魔芋低聚糖对高脂饮食小鼠脂代谢的影响
魔芋低聚糖对高脂饮食小鼠脂代谢的影响魔芋低聚糖对高脂饮食小鼠脂代谢的影响周中凯1，赵亚丽1,2，杨星月1,2（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2.军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300041）摘 要： 本实验以雄性昆明小鼠为研究对象，将其随机分为正常饲料组、高脂饮食组和低聚糖干预高脂饮食组，将质量分数3%的魔芋低聚糖添加到高脂饲料中，研究魔芋低聚糖对高脂饮食小鼠的体质量、肝指数、血脂及氧化应激水平的调节作用，并采用聚合酶链式反应法测定相关基因表达情况，对机理进行初步探讨。结果表明：在高脂饮食中添加魔芋低聚糖可显著降低小鼠的体质量、肝质量，并有效改善血脂组分，可以抑制小鼠体内丙二醛的生成，这可能与其具有显著提高机体抗氧化能力有关；低聚糖干预显著上调肉碱棕榈酰转移酶的mRNA表达，表明脂肪分解代谢加快；显著上调低密度脂蛋白受体的mRNA表达，可以降低血浆低密度脂蛋白胆固醇水平。综上所述，魔芋低聚糖的干预可以有效降低肥胖所带来的危险。关键词：魔芋低聚糖；高脂饮食；血脂；氧化应激魔芋中存在大量的多糖，结构显示为魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）。KGM具有良好的吸水性、成膜性、增稠性、可塑性、乳化性、结构性、保水性和赋形性等多种性质，其独特的流变和凝胶性使它在功能性食品等领域被广泛应用。另外营养学研究表明，KGM具有良好的减肥、降脂和润肠通便作用。但由于KGM相对分子质量较高、黏度大，因此在食品工业上的应用受到限制。因此，将魔芋中的大分子降解为中小分子，如魔芋低聚糖（konjac oligosaccharides，KOS）产品，不仅可以大大降低其黏度，还可以极大程度提高其在食品中的应用范围，特别是生成的低聚糖类产品也是活性较强、生理功能显著的一类产品。因此本研究以低聚糖为干预原料来证实其功效。1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0以及Graph Pad 5 进行统计分析。采用Kaplan-Meier法计算OS及TTR，组间比较采用log-rank检验；生存资料单因素分析采用Cox比例风险回归模型，有统计学意义的因素纳入Cox多因素模型进行分析。检验水准(α)为0.05。关于魔芋低聚糖的功效已经有了一些研究：杨艳燕等研究了魔芋二糖或三糖异构体的低聚糖对小鼠血糖能力和抗氧化能力的影响；谭扬等研究了魔芋低聚糖的通便功能；陈黎等研究魔芋低聚糖的降脂作用。控制KGM非彻底降解可获得不同聚合度的魔芋葡甘低聚糖，不同分子质量的魔芋低聚糖其功效也有所不同。本实验用解淀粉芽孢杆菌发酵制得的酶液水解鲜魔芋，得到魔芋低聚糖水溶液，将其离心、喷雾后制得魔芋低聚糖粉末，将其加入高脂饲料以研究其功效。1 材料与方法1.1 动物、材料与试剂SPF级雄性健康昆明小鼠，体质量（22±2）g，由中国人民解放军军事医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK-（军）2012-0004。白魔芋购于陕西省安康市岚皋县。小鼠基础饲料购于中国人民解放军军事医学院实验动物中心，高脂饲料配方：63.8%（质量分数，下同）基础饲料、15%猪油、10%蔗糖、1%胆固醇、0.2%胆酸钠、10%蛋黄粉。干预饲料配方：60.8%基础饲料、3%魔芋低聚糖、15%猪油、10%蔗糖、1%胆固醇、0.2%胆酸钠、10%蛋黄粉。总胆固醇（total cholesterol，TC）试剂盒、甘油三酯（triglyceride，TG）试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）试剂盒、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）试剂盒、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒 南京建成生物科技有限公司；动物组织总RNA提取试剂盒北京天根生化科技有限公司；反转录（r e v e r s e transcription，RT）及RT-聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒 美国Thermo公司；引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列见表1。表1 引物序列Table1 Primer sequences used for RT-PCRhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/1119a30fe9e7903d83867760134b71ac.jpg&q=30 基因名称 引物序列（5’-3’）产物长度/bp β-actin F：GGGTCAGAAGGACTCCTATG 99 R：GTAACAATGCCATGTTCAAT Cpt1a F：CTCCGCCTGAGCCATGAAG 178 R：CACCAGTGATGATGCCATTCT PPARα F：TTTCACAAGTGCCTGTCTGTCG 109 R：TCTTCAGGTAGGCTTCGTGGAT LDL-R F：CAGGCAGCAGGAACGAGTTC 158 R：GGAGTCAGGAATGCATCGGC
1.2 仪器与设备Step one plus定量PCR仪 美国ABI公司；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS） 美国布鲁克道尔顿公司；MK-3酶标仪 美国Thermo公司；智能培养箱 宁波赛福实验仪器有限公司；XMTD-204数显式电热恒温水浴锅天津市欧诺仪器表有限公司；TGL-16M高速台式冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。1.3 方法1.3.1 魔芋低聚糖的制备魔芋洗净、去皮、切片，称质量后用打浆机打浆制成浆液（魔芋和蒸馏水的料液比为1∶10，打浆时间30 s），将浆液装入锥形瓶中加酶（酶活力2 509 U/mL，酶与浆液的体积比1∶100），该酶为解淀粉芽孢杆菌发酵制得），将浆液放在磁力搅拌器上搅拌30～40 min直至均匀，在45 ℃条件下放入水浴摇床180 r/min振荡4 h后，4 000 r/min离心20 min，取上清液，将上清液放入高压灭菌锅灭酶（121 ℃，20 min），取出冷却至室温后过3层粗棉布除去沉淀的纤维类物质，收集滤液喷雾干燥（进风温度180 ℃，出风温度80～90 ℃）制得粉末，收集置于干燥器中备用。魔芋低聚糖粉末外观呈粉状，白色，无臭无味。KOS经过酶解、分离、精制等工序，基本脱去非多糖成分，魔芋低聚糖纯度在90%以上，其他为少量单糖，基本无其他成分（如蛋白质等成分）的检出；经MALDI-TOF-MS检测出魔芋低聚糖m/z为744。1.3.2 动物实验饲养条件：温度（2 0～2 5）℃，相对湿度50%～55%，正常采光，动物实验符合国家《实验动物管理条例》。随机将小鼠分为3 组：正常饲料组（NC）、高脂饮食组（MC）、低聚糖干预高脂饮食组（KOS），每组12 只。第1周：适应性喂养，各组小鼠均进食正常饲料；第2～5周：NC组进食正常饲料，KOS组、MC组均进食高脂饲料；第6～9周：NC组进食正常饲料，KOS组进食干预饲料，MC组进食高脂饲料。所有小鼠均自由进食、饮水。1.3.3 指标检测1.3.3.1 血清样本的采集实验结束后，将小鼠禁食12 h后，眼球取血，血样于室温静置2 h，5 000 r/min离心10 min后，取上层血清置于－80 ℃贮存备用。1.3.3.2 肝指数、体脂比的测定在经济全球化和市场经济条件下，要想保证国有企业的稳定发展，并在发展中逐渐提高自身的竞争力，就需要国有企业内部的管理者认识到内部控制与防范财务风险对企业发展的意义，并找出企业在发展中面临的各种问题，及时制定相应的问题解决措施，优化企业的内部控制管理，加强企业的财务风险防范力度。小鼠处死后立即解剖，取出肝脏、脂肪，用滤纸吸干表面水分后称其湿质量，分别根据式（1）、（2）计算肝指数和体脂比。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/995f0b4113cea750ccc12e9f9eee6947.jpg
1.3.3.3 血清指标的测定TC、TG、LDL-C、HDL-C、T-AOC、T-SOD、GSH-Px、MDA水平严格按照试剂盒的相关说明测定，每个样品重复测3 次，取平均值。1.3.4 小鼠肝脏中脂代谢相关基因mRNA转录水平的测定小鼠总RNA提取采用动物组织总RNA提取试剂盒，用DNA酶去除基因组DNA。用Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒合成单链cDNA，反应条件为37℃反应15 min，85 ℃反应5 s并于4 ℃条件下储存。聚合酶链式反应采用Step one plus定量PCR仪进行，20 μL反应体系包含0.4 μmol/L前引物和后引物、1 μg cDNA、10 μL SYBR Ⅱ荧光染料和0.4 μL ROX参比荧光染料。热循环条件为95 ℃预变性30 s，之后95 ℃反应5 s，60 ℃反应34 s，交替进行40 个循环，每个循环结束仪器测定记录荧光强度。β-actin基因作为内参基因，mRNA相对表达量用2-ΔΔCt法计算。1.4 数据统计分析数据结果以http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/2470610807b83b9f5a7007c63738b675.png±s表示，采用SPSS 19软件对分析结果进行数据统计，采用ANOVA进行邓肯氏（Duncan）差异分析，P＜0.05表示有显著差异。2 结果与分析2.1 膳食对小鼠体质量的影响各组小鼠1～9 周体质量如图1所示，其中6～9 周为干预时间。本实验采用两段式喂养方式：2～5周建模期，以高脂饲料喂养小鼠（MC组小鼠和KOS组小鼠）以得到肥胖小鼠，2～5 周高脂饮食的小鼠体质量并无显著差异。第6周开始用KOS对高脂小鼠进行干预。第6～9周，MC组小鼠体质量明显高于NC组小鼠，这说明高脂饮食可以诱导小鼠体质量增加。而进行KOS干预（6～9周）后，KOS组小鼠体质量趋于平稳，随着时间的延长，KOS组小鼠的体质量与MC组小鼠体质量差异愈来愈大。这说明低聚糖干预对高脂饮食小鼠体质量的增加有抑制作用。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/a6b50d6f7fff314de84aafa5a8faf7a1.jpg&p=736x378&q=30 图1 各组小鼠第1～9周体质量变化
Fig.1 Body mass changes of mice during the experiment
2.2 膳食对小鼠肝指数和体脂比的影响表2 各组小鼠肝指数、体脂比和血糖水平
Table2 Liver index, fat to body mass ratio and blood glucose in each grouphttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/889a0ff884e1141e4517d76245185fc2.jpg&q=30 注：同列肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。组别 肝指数/% 体脂比/% 血糖值/（mmol/L）NC 3.85±0.56ab 2.70±0.46b 8.58±0.96a KOS 3.35±0.21b 3.20±0.88b 8.67±053a MC 4.66±0.84a 4.88±1.08a 9.58±0.86a
肝指数是动物的一项重要生理指标。当肝脏出现补偿增生时，表明肝脏的解毒负担也相应增加。由表2可知，KOS组小鼠的肝指数显著低于MC组小鼠，且接近于NC组小鼠，说明魔芋低聚糖可以抑制高脂饮食小鼠肝脏的增大，有利于预防脂肪肝等疾病的发生。肾周脂肪和附睾脂肪，占动物机体脂肪总含量的一定比例，所以通常利用肾周脂肪和附睾脂肪占体质量的百分比（体脂比）来反映小鼠的肥胖状况。十二年后，曹 叡 驾崩，临终前将八岁的太子托付给宗室曹爽和实权派大臣司马懿，魏国政治局势也进入了最为诡遹 的状态。以自然(吃水水深之比、流向和流速、风向和风速、能见度)、地理(航道宽度与船长之比、航道弯曲度)、交通(船舶密度、交通秩序、交通流速度)、船舶(当事船舶对环境的响应效率)、船员(当事驾驶台人员控制船舶的能力)为风险评价因素，以每隔0.5 h的不同时域为研究对象，应用熵权物元分析方法进行计算，确定不同时域下各因素对该水域的风险关联度大小。计算步骤如下：实验结束后，各组小鼠体脂比由高到低依次为：MC组、KOS组、NC组。MC组的小鼠体脂比显著高于NC组小鼠（P＜0.05），这说明长期的高脂饮食会造成机体内脂肪的过多累积。而低聚糖干预后，KOS组小鼠的体脂比显著低于MC组，这说明低聚糖干预有效降低了小鼠体内脂肪的积累。在正常情况下，机体具有维持一定血糖水平的能力，以维持正常的糖脂代谢。高脂饲料会导致小鼠血糖水平升高，如果血糖水平持续升高会导致许多健康问题，比如糖尿病、心血管疾病等。在本实验中，KOS组小鼠血糖水平低于MC组，但两者并无显著性差异。2.3 膳食对小鼠血脂水平的影响表3 各组小鼠血脂水平
Table3 Blood lipid levels in each group mmol/Lhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/6b9875412e84345638db0777f14ef0a6.jpg&q=30 组别 TG浓度 TC浓度 HDL-C浓度 LDL-C浓度NC 1.51±0.17b 2.65±0.21c 3.29±0.51ab 0.44±0.09c KOS 1.36±0.26b 3.33±0.50b 3.64±0.74a 0.72±0.20b MC 1.89±0.20a 4.32±0.74a 2.49±0.85b 1.03±0.28a
由表3可知，与NC组相比，MC组小鼠TC、TG、LDL-C浓度显著增加（P＜0.05），HDL-C浓度显著降低，说明高脂饮食会导致小鼠脂代谢紊乱。与MC组相比，KOS组小鼠的TC、TG、LDL-C浓度显著降低，HDL-C浓度显著提高，说明低聚糖干预对高脂饮食的小鼠有降低高血脂症的作用。2.4 膳食对小鼠氧化应激水平的影响表1 各组小鼠氧化应激水平
Table1 Levels of oxidative stress in each grouphttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/a165ed5600239e224b7c23529dc92e5c.jpg&q=30 组别 T-AOC/（U/mL）T-SOD活力/（U/mL）MDA浓度/（nmol/L）GSH-Px活力/（μmol/L）NC 4.85±0.46b 308.48±22.24a 6.40±1.05b 329.60±16.06a KOS 6.50±0.81a 277.84±19.22b 8.85±1.20a 336.50±11.52a MC 5.63±0.67ab 233.00±26.41c 9.67±1.21a 303.47±23.64b
如表4所示，与NC组相比，小鼠长期进食高脂饲料导致高脂饮食小鼠T-SOD、GSH-Px活力显著降低（P＜0.05），MDA水平升高。对小鼠进行低聚糖干预后，小鼠的氧化应激状态有所改善。KOS组小鼠的T-AOC、T-SOD、GSH-Px水平与MC组相比显著升高，MDA水平降低。这说明魔芋低聚糖干预对由高脂饮食引起的氧化应激有抑制作用。2.5 膳食对小鼠LDL-R、CPT、PPARα mRNA表达水平的影响http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/6385535beb64566b7396e8c781d4eb45.jpg&p=612x696&q=30
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/ca51622b6f5f99c837d339430f5dc480.jpg&p=624x352&q=30 图2 各组小鼠LDL-R（A）、CPT（B）、PPARα（C）mRNA的相对表达量
Fig.2 mRNA expression levels of LDL-R （A）, CPT （B）, and PPARα （C）in liver
如图2所示，与正常小鼠相比，高脂饮食会导致小鼠肝脏内低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDL-R）、肉碱棕榈酰转移酶（carnitinepalmitoyltransferase 1a，CPT）、过氧化物酶增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）的mRNA表达显著降低，而魔芋寡糖干预后小鼠肝脏内LDL-R、CPT的mRNA表达上调，而PPARα的mRNA表达与MC组并无显著性区别。3 讨 论近年来，寻找安全高效的食品活性成分来代替药物防治慢性代谢疾病成为科学研究的热点。低聚糖因其发热值极低（很少能转化为脂肪），可改善脂代谢，降低血脂和胆固醇。在本实验中，在高脂饮食饲料中添加质量分数3%的魔芋低聚糖，通过对小鼠的体质量、肝指数、血脂及氧化应激水平等指标的测定，探索魔芋低聚糖对小鼠脂代谢及氧化应激的影响。实验结果表明，高脂饮食可以使小鼠体质量明显上升，说明高脂饮食可以导致小鼠体内脂肪的积累。与NC组相比，实验结束后MC组小鼠体质量明显升高，低聚糖干预后小鼠体质量显著降低。说明低聚糖干预可以抑制高脂饮食小鼠体质量的增加。高脂饮食会导致小鼠血液中的TC、TG水平异常升高，长期的高血脂水平会导致动脉粥样硬化。低聚糖干预后小鼠TC、TG、LDL-C水平显著降低，HDL-C水平显著提高，说明低聚糖对高脂饮食的小鼠有降低高血脂症的作用，这与国内相关研究结果一致。很多临床与实验研究已经表明，在肥胖、血脂代谢紊乱状态情况下，机体氧化应激水平也会升高。氧化应激是指机体促氧化物-抗氧化物之间动态平衡失调所导致的对细胞内大分子的氧化损伤。高脂饮食可生成大量的活性氧，引起机体氧化应激。过量的活性氧会引起蛋白质、脂肪、核酸等生物大分子的氧化损伤，是高血脂、肥胖、糖尿病等营养性慢性代谢疾病发生、发展的根源。已有研究发现，高脂饮食可致组织中许多抗氧化应激系统酶表达减少、活性降低，导致机体清除氧自由基能力降低，从而对机体组织等造成损伤。T-SOD对机体的抗氧-抗氧化平衡起着至关重要的作用，它能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。GSH-Px特异性催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。MDA水平可以反映机体内脂质过氧化的程度。高脂饮食会显著降低小鼠的T-AOC、T-SOD和GSH-Px（P＜0.05），提高MDA水平（P＜0.05），造成机体氧化应激水平升高。与MC组相比，低聚糖干预后小鼠的T-AOC、T-SOD和GSH-Px水平显著提高，MDA水平降低，这说明魔芋低聚糖干预有助于抑制小鼠氧化应激状态。为了进一步研究KOS对脂质代谢调控的分子机制，我们研究了脂代谢相关基因，检测脂质代谢相关基因。CPT能与长链脂酰辅酶A合成脂酰肉碱，并将其转运至线粒体而被氧化分解。CPT是脂肪分解代谢相关基因，高脂饮食虽然会导致小鼠肝脏内脂肪分解代谢相关基因CPT的mRNA表达显著下调，表明高脂小鼠肝脏内脂肪降解减慢，多余脂肪肝脏内积累，但进行KOS干预后小鼠CPT的mRNA显著上调，表明低聚糖干预可以使小鼠肝脏内脂肪降解加快，减少多余脂肪积累。LDL-R基因能够移除血液LDL微粒中含有的胆固醇，对维持机体正常血液胆固醇水平具有重要作用；LDL-R基因突变可以导致LDL-R功能异常和家族性高胆固醇血症。上调LDL-R的表达可以降低血浆低密度脂蛋白胆固醇水平，降低心血管意外的发生率。与NC组相比，KOS组小鼠LDL-R的mRNA显著上调。PPARα可以通过激活脂肪氧化基因的表达促进脂肪的降解，在脂类代谢中起着重要作用。与正常小鼠相比，高脂饮食会导致小鼠肝脏内PPARα的mRNA表达显著降低，但进行KOS干预后PPARα的mRNA表达与高脂组小鼠并无显著区别。综上所述：在高脂饲料中直接添加魔芋低聚糖可以显著降低小鼠的体质量、肝指数、体脂比，改善血脂合成及氧化应激水平：显著增加T-AOC、T-SOD和GSH-Px水平，降低MDA水平。说明魔芋低聚糖对高脂饮食小鼠具有降低体质量、肝指数、体脂比，改善血脂合成及抑制氧化应激的功效；魔芋低聚糖干预后小鼠显著上调CPT的mRNA表达，表明脂肪分解代谢加快，显著上调LDL-R mRNA的表达可以降低血浆低密度脂蛋白胆固醇水平。一杭惨叫一声倒在地上，雪萤疯狂地挣脱红头发，跑开了。红头发回过头，用皮鞋猛踢一杭的肚子。光头蹲下来，抽出还插在一杭身上的刀，又朝他胸前扎了两下，然后擦擦手，说了声：“走！”三个人被夜色掩盖了。参考文献： CHANG Y T, CHEN Y S, LIN K T, et al. 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Effect of Konjac Oligosaccharide on Lipid Metabolism in Mice Fed High-Fat DietZHOU Zhongkai1, ZHAO Yali1,2, YANG Xingyue1,2
（1. College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China;2. Institute of Environmental & Operational Medicine, Academy of Military Medicine,Chinese Academy of Military Sciences, Tianjin 300041, China）Abstract: In this study, 3% konjac oligosaccharide was added to a high-fat diet to investigate the effect of konjac oligosaccharide on body mass, liver index, lipids and high-fat diet induced oxidative stress in mice. Reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） was adopted to measure gene expression levels to explore the underlying mechanism. Male Kunming mice were randomly divided into normal diet, high-fat diet and oligosaccharide intervention groups. The results showed that the dietary addition of konjac oligosaccharide signif i cantly reduced body mass and liver mass, improved blood lipid prof i le, and inhibited the generation of malondialdehyde in mice, which may be related to its ability to improve antioxidant capacity in the body. In addition, konjac oligosaccharide could signif i cantly up-regulate the mRNA expression of carnitine palmityl transferase （CPT）,thereby accelerating lipid decomposition and metabolism. It could also signif i cantly up-regulate the mRNA expression of low density lipoprotein receptor （LDL-R） and reduce plasma low density lipoprotein cholesterol level. In summary, these results demonstrated that konjac oligosaccharide can effectively reduce the health risks caused by obesity.Keywords: konjac oligosaccharide; high-fat diet; blood lipid; oxidative stress
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