百合鳞片褐变过程中膜脂过氧化研究
百合鳞片褐变过程中膜脂过氧化研究百合鳞片褐变过程中膜脂过氧化研究阚 娟，万 冰，解王晶，陈翠翠，刘 俊，金昌海*（扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127）摘 要： 以宜兴卷丹百合作为实验材料，研究百合鳞片采后低温贮藏过程中膜脂过氧化与褐变的关系。结果表明：在低温贮藏过程中，百合鳞片不同部位的褐变度、细胞膜透性、超氧阴离子自由基（O2－·）产生速率、H2O2和丙二醛含量均随着贮藏时间的延长呈上升趋势，且中层鳞片的上升速率始终低于外层和内层鳞片；内源过氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）及脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活力呈先上升后下降趋势。中层鳞片中SOD和CAT活力始终高于外层和内层，而内源POD和LOX活力始终低于外层和内层鳞片；百合鳞片细胞活力在贮藏过程中逐渐降低，但中层鳞片的细胞活力始终高于外层和内层。百合鳞片褐变与膜脂过氧化密切相关，且不同部位百合鳞片在贮藏过程中褐变速率存在一定差异，表现为内层＞外层＞中层。本研究结果可为百合鳞片褐变机理的研究提供一定的实验依据。关键词：百合鳞片；褐变；膜脂过氧化百合是我国卫生部审批通过的首批药食兼用资源，其食用价值和药用价值日益受到海内外消费者的重视，有很高的市场价值。百合鳞片由许多肉质鳞片组成，鳞片肥厚、营养丰富，具有芳香气味与微苦滋味，能刺激食欲、帮助消化。但是百合在采后贮藏过程中极易发生褐变。Aguilera等提出细胞膜是一种半透性膜，维持着细胞内外渗透压的平衡，当膜结构遭到破坏时，细胞的区室化被破坏，细胞内容物渗出，使底物渗出，并与酶反应导致褐变。Purev等研究发现，在干旱、光照、重金属及高渗透压等逆境下，植物体内过氧化氢酶（catalase，CAT）的表达量及活性都有所提高，说明CAT在植物抗逆方面发挥着重要作用。Siedow通过研究发现，过量的H2O2会对果实细胞产生伤害。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）启动并参与膜系统的脂质过氧化进程，加剧细胞膜的降解。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）能够缓解膜脂过氧化反应中代谢产物丙二醛（malondialdehyde，MDA）的积累以及使细胞膜通透性增加，促使果蔬形成防御结构，提高果蔬抗性。目前国内外对百合鳞片的研究主要在生物活性和抗氧化等方面，对百合鳞茎贮藏过程中褐变的研究主要集中在褐变相关酶类，如有研究认为百合褐变与多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）活性密切相关。对膜脂过氧化与百合鳞茎褐变之间关系的研究还少有报道，对于百合鳞茎不同层面鳞片贮藏过程中褐变与膜脂过氧化之间的关系研究也鲜见报道。本研究以宜兴卷丹百合作为实验材料，对新鲜的百合进行剥片处理并分成外层、中层、内层3 部分，并避光贮藏于4 ℃环境中，研究了百合鳞片在贮藏过程中褐变及膜脂过氧化相关指标，为进一步了解百合鳞片褐变与膜脂过氧化之间的关系以及深入研究百合鳞片的褐变机制提供一定的实验依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂本实验以宜兴卷丹百合（Lilium lancifolium Thunb.）为材料，采自宜兴市百合种植基地。二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒上海碧云天生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。1.2 仪器与设备Lambda 35紫外-可见分光光度计 美国Perkinelmer公司；PT-MR-2100高速组织匀浆机 瑞士Kinematica公司；5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；SHJ-A6磁力搅拌恒温水浴锅 上海比朗仪器有限公司；CX41RF显微镜 日本OLYMPUS公司。1.3 方法1.3.1 原料处理采收大小、果色均匀、成熟度基本一致、无机械损伤和病虫害的产品。采后即刻运往实验室，对新鲜百合鳞片进行剥片处理，选择无明显机械损伤、无虫害的百合鳞片，将百合鳞片分为外、中、内3 部分，外层即从外向内数1～3 层，内层即由内向外数1～3 层，其余为中层，避光贮藏于4 ℃冰箱中，并于贮藏的第0、3、6、9、12、15天分别取样测定。究其要因，其一，罗塞蒂的技艺并不足以支持其抗起拉斐尔前派“求真”这一面纯洁的旗帜。若将他的作品与其伙伴亨特的绘画相比，他的写实技巧就要逊色不少。《邂逅》这幅原本最能体现拉斐尔前派精神的作品，也始终没有完成。因为罗塞蒂这个快活的意大利人从未刻苦地钻研过绘画技巧，即使他曾给马多克斯·布朗这位体现出拉斐尔前派创作精神的优秀画家写过热情洋溢的书信，声明要做他的学生(事实是很快便厌倦了枯燥的基础训练而中途放弃)。他的吉卜赛式的作风，注定了与兄弟会初创所倡导的质朴严谨不能相容。1.3.2 表观变化的记录和细胞活力的测定贮藏过程中每隔3 d取大小相近的各层百合鳞片置于白纸上拍照记录表观变化情况。细胞活力的测定参照Heese等的方法略作修改。随机取外、中、内百合样品，切成1 mm左右厚的薄片浸入台盼蓝染液中（V（台盼蓝）∶V（乙醇）∶V（水）∶V（乳酸）∶V（甘油）∶V（苯酚）＝0.067∶1∶1∶1∶1∶1），沸水浴加热2 min使切片快速染色。冷却后，将切片浸入适量2.5 g/mL三氯乙醛溶液中，振动脱色过夜。将脱色完成的切片浸入体积分数60%甘油溶液中，用显微镜观察并采集图片。1.3.3 褐变度、细胞膜透性和呼吸强度的测定褐变度的测定按照K u m a r等的方法，以10×OD420 nm表示。细胞膜透性的测定按照Zhang Zhengke等的方法，用相对渗透率表示百合鳞片细胞膜透性，具体计算见下式。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/49577ff1f13929480530088ed44b4400.jpg呼吸强度的测定按照Grozeff等的方法，以每小时每千克新鲜组织吸收CO2的质量表示。1.3.4 内源POD活力的测定内源POD活力用二氨基联苯胺DAB显色试剂盒测定，显微镜观察和采集图片。目前的家庭只有患者和母亲。父亲离家外出寻找工作。叔叔一家住在北平，奶奶和收养的哥哥跟随叔叔一起居住。经济情况看似很差，据说她们以典当、变卖财产以及靠亲戚的救济为生。1.3.5 H2O2含量和超氧阴离子自由基（O2－·）产生速率的测定H2O2含量的测定按照Liu Hong等的方法，H2O2的含量以每克新鲜组织含有的H2O2物质的量表示；http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/6b2c85552db10982ea94aeddc14d8971.png·产生速率的测定按照Ren Chunguang等的方法，以每分钟每克新鲜组织催化羟胺生成NaNO2的物质的量表示http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/8848adbffdaaa6b716b203226c4f7fa6.png·产生速率。1.3.6 MDA含量和LOX活力的测定MDA含量测定按照Gao Hui等的方法，单位为µmol/g；LOX活力的测定按照Wang Jinghua等的方法，LOX活力以每分钟每毫克蛋白引起234 nm波长处吸光度增加0.01为1 个酶活力单位（U）。1.3.7 SOD、CAT活力的测定SOD活力的测定按照Mahdavian等的方法，1 个SOD活力单位（U）定义为每克新鲜组织每分钟对氮蓝四唑光化还原抑制为50%时消耗的酶量；CAT活力的测定按照Bailly等的方法，以每分钟每毫克蛋白引起240 nm波长处吸光度减少0.1表示1 个酶活力单位（U）。1.4 数据处理所有实验取样重复3 次，通过SPSS 17.0软件对数据进行方差分析，Duncan法进行显著性检验，P＜0.05表示差异显著。凤河支流官沟流经东半壁店小流域，是流域内主要河流，流域排水一部分通过农田二支渠、三支渠等农田灌溉和排涝渠系排入官沟后入凤河，部分排水直接排入凤河，部分雨水也排入流域坑塘。2 结果与分析2.1 不同部位的百合鳞片在贮藏过程中表观和细胞活力的变化http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/e44bf78752a2b7a4318ea2fa6150dd8d.jpg&p=580x684&q=30 图1 不同部位的百合鳞片在贮藏过程中细胞活力的变化
Fig.1 Change in cell activity in different parts of lily bulbs during storage
检测细胞活力最常用的染色试剂是台盼蓝，未受损的细胞其膜结构完整、活力强，细胞质内不沉淀台盼蓝；而受损甚至死亡的细胞，膜结构被破坏，活力降低，则台盼蓝堆积在细胞内。由图1可以看出，随贮藏时间延长，各层百合鳞片的活细胞数量均逐渐减少，但相同贮藏时间的中层鳞片活细胞数量比外层和内层多，细胞活力较强，与图2表观变化结果一致。全面实施营改增主要是为了配合供给侧改革，降低企业税负。对于小规模企业来说，营改增使其上缴税款的税率降低，税负的降低也是必然。而自2016年5月1日酒店全面实施营改增以来，增值税率的高低不等同于实际税负。营改增对酒店财务管理工作的影响主要体现在税负和成本两个方面：http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/babadb37c5293ff31cb11e5fdb747a22.jpg&p=542x908&q=30 图2 不同部位的百合鳞片在贮藏过程中的表观变化
Fig.2 Change in appearance of different parts of lily bulbs
2.2 不同部位的百合鳞片在贮藏过程中褐变度、细胞膜相对渗透率和呼吸强度的变化从图3A可以看出，各层百合鳞片的褐变度都随着贮藏时间的延长呈现明显的增长趋势，在0～3 d内各层百合鳞片的褐变度变化不显著（P＞0.05），但是3 d之后呈显著性增加。中层百合鳞片褐变度在贮藏过程中总体低于外层和内层鳞片，与表观变化结果一致。从图3B可以看出，随着贮藏时间的延长，各层百合鳞片的相对渗透率都呈现增长趋势，但是中层百合鳞片相对渗透率始终低于外层和内层鳞片。除了第6、9天外层和中层百合鳞片相对渗透率差异不显著外（P＞0.05），在其他贮藏时间各层均呈现显著性差异。尤其12～15 d时，相对渗透率迅速升高，15 d时内层鳞片相对渗透率达到23.97%，是中层鳞片（15.78%）的1.52 倍。在贮藏过程中，中层百合鳞片细胞膜损伤程度较轻，与细胞活力和褐变度变化结果一致。从图3C可以看出，不同层的百合鳞片在贮藏过程中呼吸强度随着贮藏时间的延长呈现不断增长的趋势，中层鳞片增长速率较为缓慢，始终低于外层和内层。贮藏当天各层百合鳞片呼吸强度无显著性差异，第3天和第15天外层和内层无显著性差异，但中层显著低于外层和内层，6～12 d期间各层鳞片呼吸强度呈显著性增加，可能是采后贮藏期间营养成分的消耗所致。呼吸强度的变化与褐变度及细胞膜透性变化结果一致。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/4da46a372f686710c138926f6c19811c.jpg&p=646x1006&q=30 图3 不同部位百合鳞片在贮藏过程中褐变度（A）、相对渗透率（B）、呼吸强度（C）的变化
Fig.3 Changes in browning degree （A）, relative permeability （B） and respiration intensity （C） in different parts of lily bulbs during storage
2.3 不同部位的百合鳞片在贮藏过程中内源POD活力的变化DAB显色试剂盒测定内源POD的活力时，棕褐色沉淀的量反映了内源POD的活力，颜色越深表示POD活力越强。由图4可以看出，在贮藏过程中，随着贮藏时间的延长，各层百合鳞片细胞内的棕褐色沉淀先增加后减少，表明内源POD活力先升高后降低，贮藏过程中中层百合鳞片的内源POD活力低于外层和内层，其中内层鳞片中内源POD活力最高，与内层鳞片中褐变度较高密切相关。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/68c099e5503e02ddd86f6343621a7a0d.jpg
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/37a8861d0fdf9d6e46c74ba4ee9166b1.jpg&p=592x412&q=30 图1 不同部位的百合鳞片在贮藏过程中内源POD活力的变化
Fig.1 Change in endogenous POD activity in different parts of lily bulbs during storage
2.4 不同部位的百合鳞片在贮藏过程中H2O2含量和O2－·产生速率的变化http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/ed38f4094df0372a3a629634a793540d.jpg&p=562x632&q=30 图5 不同部位的百合鳞片在贮藏过程中H2O2含量（A）和http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/9dc74d4ad6080f0c2691fdbb23472462.png·产生速率（B）的变化
Fig.5 Change in H2O2 content （A） andhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/b1d6fb90fa83e2a0b58df2c5f94d9772.png· production rate （B） in different parts of lily bulbs during storage
由图5A可以看出，随着贮藏时间的延长，各层百合鳞片的H2O2含量均呈现上升趋势，但是中层鳞片H2O2含量始终低于外层和内层鳞片。在贮藏前9 d，H2O2含量增长相对缓慢，可能是百合受到衰老损伤后引起CAT等酶活力的增加所致；贮藏后期12～15 d，各层鳞片H2O2含量均呈显著性增加，细胞受到的氧化损伤也逐渐加重，自我修复能力下降导致H2O2含量增加较快，同时加速了组织褐变。植物衰老过程会导致呼吸代谢过程中电子的增加，也是http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/a6504e503e9e30d513524b64741de006.png·产生速率不断上升的原因。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/e1da3a084e94d00ad36996f784b71b0b.png·还会和其他氧自由基一起攻击膜系统，使膜上不饱和脂肪酸发生过氧化反应，并攻击膜上蛋白。由图5B可以看出，随着贮藏时间的延长，各层百合鳞片的http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/229420241e6a3b0ded3bcdff5d914c20.png·产生速率均呈现上升趋势，尤其是12～15 d有显著性增长，但是中层鳞片的http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/6f985c86261b27333eaba8d4296517fa.png·产生速率始终低于外层和内层鳞片，而内层鳞片始终最高，这与膜渗透率和鳞片褐变程度结果一致。2.5 不同部位的百合鳞片在贮藏过程中MDA含量和LOX活力的变化http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/1619b80d7ff36d4d8447de2236eedae4.jpg&p=626x648&q=30 图6 不同部位的百合鳞片在贮藏过程中MDA含量（A）和LOX活力（B）的变化
Fig.6 Change in MDA content （A） and LOX activity （B） in different parts of lily bulbs during storage
植物体在遭受逆境伤害或者衰老时，会发生膜脂过氧化现象，最终产物为MDA。由图6A可以看出，在贮藏过程中，各层百合鳞片的MDA含量均随着贮藏时间的延长而呈现上升趋势，但是中层鳞片的MDA含量以及增长速率均低于外层和内层。在贮藏前6 d，MDA含量增长缓慢，中层和内层含量差异不显著，可能是因为百合在衰老褐变过程中产生的适量H2O2诱导机体作出一系列反应机制抵御了氧化损伤；贮藏后期9～15 d，外层和中层MDA含量呈显著性升高，而内层鳞片在9～12 d急剧增加，表明贮藏中后期内层鳞片膜脂过氧化作用增强，导致MDA大量积累，加剧了褐变的发生。LOX活力的增强会加快细胞损伤以及植物体衰老。由图6B可以看出，随着贮藏时间的延长，各层百合鳞片的LOX活力均呈先上升后下降趋势，在贮藏12 d时达到峰值。中层鳞片的LOX活力上升幅度低于外层和内层，且峰值最小，而内层鳞片峰值最大。在贮藏前期0～6 d各层鳞片LOX活力差异不显著，但9～15 d内层与外层、中层均呈显著性差异；这与百合内层鳞片褐变严重结果一致。LOX活力的上升可能是百合鳞片对衰老等伤害反应的“应答”。就能得出奇异值差分谱序列的峰值谱N,以及相应的重构阶数.如差分谱峰值dk,以角标数字k找出奇异值序列中的对应峰值σk,即在k值前的奇异值变化较大,而之后的奇异值将接近于某一值后稳定.说明峰值σk是信号与噪声的分界点,此时取k值前的奇异值重构信号,该信号就是降噪处理后的真实振动特征数据.2.6 不同部位的百合鳞片在贮藏过程中SOD活力和CAT活力的变化http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=98f28ecba23571b61ed4e6736d6ea662/a922223166a2115f48a248e60316efe1.jpg&p=626x648&q=30 图7 不同部位的百合鳞片在贮藏过程中SOD（A）和CAT（B）活力的变化
Fig.7 Change in SOD （A） and CAT （B） activity in different parts of lily bulbs during storage
由图7A可以看出，各层百合鳞片的SOD活力均随着贮藏时间的延长呈先上升后下降趋势，第9天出现峰值，但是中层鳞片的SOD活力始终比外层和内层高，而内层鳞片贮藏中、后期SOD活力急剧下降，可能是膜脂过氧化作用使组织细胞积累大量的活性氧，细胞受到不可逆伤害，自我修复力下降所致。CAT能将植物体内的H2O2催化分解，降低植物受到的过氧化损伤。由图7B可以看出，各层百合鳞片的CAT活力均随着贮藏时间的延长呈先上升后下降趋势，第9天时CAT活力出现峰值，但是中层鳞片的CAT活力始终高于外层和内层，具有较强清除H2O2的能力。但在贮藏后期CAT活力逐渐下降，组织受到的氧化损伤不可逆，组织修复能力下降，百合鳞片褐变加剧。3 讨 论百合在贮藏过程中发生的一系列生理变化，最直观的表现是颜色的变化。褐变主要是因为细胞受到损伤使多酚渗出后被氧化成醌类物质，而醌类物质可进而聚合成“类黑精”，外观上表现为百合表面颜色的加深。本研究结果表明，百合鳞片采后贮藏过程中褐变程度的增加伴随着细胞活力的降低和细胞膜的损伤。POD在过氧化物存在的条件下能催化多种酚类物质的氧化，导致采后果蔬的酶促褐变。植物细胞中内源POD活力常用DAB组织染色法来测定，在细胞内POD等氧化酶的作用下，催化H2O2释放氧，从而与显色底物DAB发生氧化反应产生棕褐色沉淀，以棕色物质在细胞内分布的多少来反映内源POD的活力。本研究中，不同部位百合鳞片细胞内POD活力先上升后下降。这与李文香等对梨果实贮藏过程中POD活力的研究结果一致。植物组织衰老过程中会因为植物代谢产生大量的活性氧攻击生物膜，造成膜脂过氧化最终产生MDA。细胞膜的相对渗透率可以用来衡量细胞膜被破坏的程度，进而反映膜脂过氧化的程度。本研究结果表明，在贮藏过程中百合鳞片的MDA含量呈上升趋势，而中层百合鳞片的MDA含量均低于外层和内层，细胞膜的相对渗透率、呼吸强度和MDA含量变化趋势相同，这表明细胞膜透性、呼吸强度和膜脂过氧化程度呈正相关，随着贮藏时间的延长，营养物质逐渐消耗，鳞片组织呈衰老状态；这与Lin Yifen等在龙眼果实中的研究结果相似。植物的膜脂过氧化需要LOX启动和参与。本研究中，褐变相对较慢的中层百合鳞片LOX活力较低，上升速率较平缓；褐变最快的内层鳞片在贮藏过程中LOX活力峰值最高且上升速率较快。在对鲜切荸荠和梨的研究中表明，LOX通过对膜的氧化损伤促进了褐变的发生。这与本研究的结果一致，LOX活力与百合鳞片的褐变也密切相关。SOD和CAT是植物自由基清除系统中的重要保护酶，二者协同作用可以有效阻止活性氧的积累，防止膜脂过氧化，减轻衰老伤害。本研究表明，SOD和CAT活力在贮藏初期和中期不断增强，均在第9天达到高峰，可最大程度清除活性氧，减轻氧化伤害；贮藏后期，随着细胞受到的氧化伤害不可逆，酶活力降低，膜脂过氧化程度加剧，因而还会继续产生活性氧；其中H2O2和O2－·是最主要的两种氧自由基，植物在衰老或遭受逆境时，机体内的H2O2含量和O2－·产生速率会呈现上升趋势。本研究中，百合鳞片中的H2O2含量和O2－·产生速率也随着贮藏时间的延长而不断上升，这与草莓和菠菜贮藏过程中活性氧含量的变化研究结果一致。综上，在百合鳞片的贮藏过程中，百合鳞片细胞因衰老而造成活性氧积累，导致膜脂过氧化，引起褐变加剧、品质下降；但是植物对逆境（如衰老）的防御机制非常复杂，不同防御反应之间可能会存在相互影响、信号交叉等现象，而根据之前有关百合鳞片贮藏期间酚类物质研究结果推测，不同部位百合鳞片在贮藏过程中褐变程度的差异可能与不同部位酚类物质的含量组成及对膜损伤的防御能力差异相关，具体机制还需要进一步研究。百合鳞片贮藏过程中极易发生褐变，本研究结果证明其褐变与膜脂过氧化造成的膜氧化损伤密切相关。参考文献： 聂慧, 严辉, 钱大玮, 等. 百合药材UPLC特征图谱及特征峰QTOFMS分析研究. 中药材, 2013, 36（7）: 1087-1092. 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Membrane Lipid Peroxidation during Browning of Lily BulbsKAN Juan, WAN Bing, XIE Wangjing, CHEN Cuicui, LIU Jun, JIN Changhai*
（College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China）Abstract: The objective of this study was to relate membrane lipid peroxidation and browning in lily bulbs （Lilium lancifolium Thunb.） grown in Yixing, Jiangsu during postharvest cold storage. It was demonstrated that browning degree,cell membrane permeability, superoxide anion radicals production rate, hydrogen peroxide （H2O2） and malondialdehyde contents increased in all bulb parts with storage time. The rate of increase in these parameters was always higher in the middle layer than in the outer and inner layers of bulbs. The activities of exogenous peroxidase （POD）, superoxide dismutase（SOD）, catalase （CAT） and lipoxygenase （LOX） increased initially and decreased thereafter. The middle layer of bulbs showed higher SOD and CAT activities but lower POD and LOX activity than that of the two other layers. Cell viability in lily bulbs gradually decreased with storage time, and it was higher in the middle layer than in the two others. Browning was closely related to membrane lipid peroxidation in lily bulbs. The rate of browning was different among different bulb parts,in the decreasing order of inner ＞ outer ＞ middle layers. The results from this study can provide an experimental basis for understanding the mechanism of lily browning.Keywords: lily bulbs; browning; membrane lipid peroxide
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