烟曲霉单宁酶Kex2位点突变及酶学特性表征
烟曲霉单宁酶Kex2位点突变及酶学特性表征卢海强,陈 伟,黄 蕾,谷新晰,田洪涛*
(河北农业大学食品科技学院,河北 保定 071000)
摘 要：研究单宁酶AfTanA中Kex2蛋白酶切割位点(K315-R316)对酶学性质的影响。通过对单宁酶AfTanA中Kex2蛋白酶切割位点(K315-R316)进行定点突变,构建单点突变体AfTanR316A和缺失突变体AfTanΔKR。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳检测发现两突变体Kex2蛋白酶抗性明显增强。经对酶学性质对比发现,两突变体具有较低的催化反应温度和较强的稳定性。单宁酶的最适反应温度由40 ℃(野生型)降低到20 ℃(两突变体)。突变体AfTanΔKR和突变体AfTanR316A在pH 12.0条件下处理1 h后,剩余酶活力由野生型AfTanA的0%提高到85%和60%;而在50 ℃条件下处理1 h后,剩余酶活力由野生型AfTanA的2%提高到40%和21%,上述性质的改变有利于单宁酶在低温条件的应用和酶制剂的生产贮存。突变体AfTanR316A动力学参数Km和Vmax分别为1.149 mmol/L和10.427 mmol/(L·min),AfTanΔKR的动力学参数Km和Vmax分别为1.46 mmol/L和35.84 mmol/(L·min)。此外,柿子汁经野生型单宁酶AfTanA和突变体处理后,多酚含量均提高50%左右。综上所述,单宁酶AfTanA中的Kex2蛋白酶切割位点(K315-R316)对酶的稳定性和催化效率影响显著,改造后的单宁酶AfTanΔKR能够更好地应用在食品工业中。
关键词：单宁酶;定点突变;Kex2蛋白酶;稳定性;食品酶
单宁酶(EC 3.1.1.20)是可将单宁中的酯键与缩酚羧键断裂,生成葡萄糖和没食子酸等物质一类酶的总称,在速溶茶、葡萄酒和啤酒等食品加工领域具有巨大的应用潜力。虽然对单宁酶的研究广泛且具有较长历史,但是到目前为止,主要集中在产酶微生物的筛选及产酶特性分析方面。单宁酶蛋白往往需要形成二硫键、氨基酸的糖基化及蛋白的正确折叠等表达后加工,才能够成为具有活性的酶蛋白分子,这使得仅有数个单宁酶基因被克隆并表达,涉及的微生物有米曲霉、黑曲霉、植物乳杆菌等。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)作为优良的表达宿主,己经实现了上百种酶基因的高效表达,探究影响单宁酶在巴斯德毕赤酵母正确表达因素的意义重大。
本课题组前期从浓香大曲中筛选获得产单宁酶嗜热真菌烟曲霉(Aspergillus fumigatus)HBHF5,该菌属条件致病菌,具有一定潜在的安全风险。巴斯德毕赤酵母GS115菌株为毕赤酵母表达系统常用菌株,其生理学背景清楚,属于安全菌株。为此,将烟曲霉菌株中的单宁酶afTanA基因在巴斯德毕赤酵母GS115中进行表达。研究发现毕赤酵母表达的重组单宁酶(AfTanA)由2 个30 kDa左右大小亚基组成,且酶的稳定性降低,推测这些性质的改变与Kex2蛋白酶作用相关。单宁酶中普遍含有1～2 个Kex2位点,到目前为止,只有Koseki等对米曲霉来源的单宁酶中Kex2位点进行了研究,而单宁酶AfTanA中Kex2位点对酶学特性影响还不清楚。因此,亟待深入开展Kex2位点对单宁酶AfTanA性质影响的研究工作。
本研究以前期获得的重组单宁酶AfTanA为材料,构建AfTanA蛋白质三维结构模型,分析Kex2位点在单宁酶蛋白结构中的位置及其作用;对比单点突变体(R316A)和双点缺失突变体(ΔRK:Lys315-Arg316)酶学性质及应用效果的差异,探讨Kex2蛋白酶酶切位点对该酶酶学性质及在柿子汁应用效果的影响,以期为单宁酶的生产及性能改造提供一定的理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
pMDTM19T-afTanA质粒由本课题组构建并提供;巴斯德毕赤酵母GS115菌株、pPIC9k质粒 美国Invitrogen公司;FastPfu DNA聚合酶 北京全式金生物技术有限公司;T4 DNA连接酶、限制性内切酶Spe I、Not I和Sal I大连宝生物有限公司;没食子酸丙酯 浙江匝海化工试剂厂;罗丹宁 生工生物工程(上海)股份有限公司;单宁酸 上海化学试剂公司;其他试剂均为分析纯。
营养肉汤(Luria Broth,LB)培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(yeast extract peptone dextrose,YPD)培养基、最少葡萄糖(minimal dextrase,MD)琼脂培养基、甘油(buffered glycerol,BMGY)培养基和甲醇诱导(buffered methanol,BMMY)培养基参照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手册配制。
1.2 仪器与设备
立式高速低温离心机 中国湘仪离心机公司;Tprofessional聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪 德国Biometra公司;TU-1810紫外分光光度计北京普析通用仪器有限公司;细胞电穿孔仪 美国伯乐公司;JY04S-3E型凝胶成像系统 北京君意东方电泳设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 AfTanA中Kex2酶切位点及其作用分析
使用蛋白质在线建模软件I-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)构建AfTanA突变体的三维结构模型,通过PyMOL软件进行蛋白结构分析。使用BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行Kex2位点氨基酸序列比对分析。使用NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)软件预测N-糖基化位点。
1.3.2 引物的设计与合成
参照前期获得的单宁酶afTanA基因序列信息(XP_746534.1),依据Fast MultiSite Mutagenesis System要求设计单宁酶afTanA中Kex2位点突变引物,如表1所示,突变引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。
表1 实验所用引物
Table 1 Primers used in this study
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注:下划线表示酶切位点。
1.3.3 Kex2突变基因的构建
以pMDTM19T-afTanA质粒为模板,PCR参数:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸4 min,25 个循环;72 ℃保温10 min。参照Fast MultiSite Mutagenesis System说明书进行单宁酶afTanA基因Kex2位点的定点突变,分别构建pMDTM19T-afTanR316A和pMDTM19T-afTanΔKR突变质粒,将阳性克隆子送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。
1.3.4 单宁酶突变体的构建
分别将pMDTM19T-afTanR316A、pMDTM19T-afTanΔKR和pPIC-9k质粒进行双酶切,利用胶回收试剂盒对目的酶切产物进行回收,进行afTanA和pPIC-9k的连接反应,分别构建表达质粒pPIC9k-afTanR316A和pPIC9kafTanΔKR。采用5’AOX和3’AOX通用引物对转化子进行验证,将筛选重组表达质粒阳性转化子进行测序鉴定。
测序正确的pPIC9k-afTanR316A和pPIC9k-afTanΔKR质粒经Sal I将表达质粒进行线性化处理后,电转化至巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,利用酶活力筛选方法对转化子进行筛选,获得阳性转化子。
1.3.5 诱导表达及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析
挑取单阳性转化子至50 mL YPD培养基中,30 ℃、250 r/min培养12 h。以1%的接种量接种于200 mL BMGY中,在摇床中30 ℃、250～300 r/min生长至OD600 nm为2～6(约16～18 h),室温、8 000×g离心5 min收集细胞,去除上清液,100 mL BMMY重悬细胞,放入摇床继续培养至48 h,维持甲醇终体积分数为0.5%,离心收集发酵液,即为粗酶液,进行酶活力测定及SDS-PAGE分析。
1.3.6 单宁酶酶学性质分析
酶活力测定参考Sharma等的方法。取100 μL适当稀释酶液与400 μL没食子酸丙酯溶液(1.25 mmol/L,pH 5.0)混匀,于25 ℃条件反应,10 min后加入300 μL罗丹宁终止反应,加入200 μL的KOH(0.5 mol/L)溶液显色,稳定5 min后在520 nm波长处测定吸光度。以每分钟生成1 μmol没食子酸所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
1.3.6.1 pH值对突变体酶活力的影响
分别测定突变体AfTanR316A和AfTanΔKR酶液样品在不同pH值缓冲液体系(pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、1.0)中的酶活力,确定其最适反应pH值。将突变体AfTanR316A和AfTanΔKR在pH 2.0～12.0的条件下,37 ℃处理1 h,对照为未进行处理的酶,按照标准酶活力测定方法测定酶活力,以未加金属离子和乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)的酶活力计为100%,分析其pH值耐受性。
1.3.6.2 温度对突变体酶活力的影响
将突变体AfTanR316A和AfTanΔKR在最适pH值下,分别测定0、10、20、30、40、50、60、70 ℃和80 ℃反应温度下的酶活力,确定其最适温度。将重组酶在40 ℃和50 ℃条件下,孵育0、5、10、20、30 min和60 min后,测定酶活力,分析其热稳定性。
1.3.6.3 金属离子和化学试剂对酶活力的影响
在标准反应条件下,分别测定终浓度为1 mmol/L和5 mmol/L的金属离子(Fe3+、Cu2+、K+、Zn2+、Na+、Mg2+、Ca2+、Li+和Mn2+)、EDTA和SDS下的单宁酶活力。
1.3.7 动力学参数Km和Vmax分析
分别配制底物浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的没食子酸丙酯溶液,在最适条件下反应5 min,测定520 nm波长处的吸光度,计算酶活力和反应速率,利用米氏方程双倒数法求得Km及Vmax值。
1.4 数据分析及处理
每次实验重复测定3 次,利用GraphPad Prism 5.0软件对数据进行统计分析,数据结果采用平均值±标准误差表示。
2 结果与分析
2.1 单宁酶afTanA基因Kex2位点分析
2013年,第一个植物乳杆菌来源的单宁酶晶体结构才被解析(PDB:4JUI)。单宁酶家族的AoFaeB晶体结构(PDB:3WMT) 由一个具有典型的a/β丝氨酸水解酶结构区域和盖子结构域所组成,虽然该酶属于单宁酶家族中的阿魏酸脂酶,这使得该晶体结构还无法完全提供充足真菌来源单宁酶的结构信息,但是对真菌单宁酶的分子机制提供了一定的借鉴。经对多个单宁酶序列比对分析发现,位于盖子结构区域中的LoopFK中的K315-R316位点氨基酸普遍存在单宁酶中(图1)。不同来源的单宁酶在该区域中表现出较强的趋异进化,其中米曲霉单宁酶(ABJ51876.1)差异最大,除在该区域有2 个连续的Kex2酶切位点外,同时还有较长的Loop结构,这表明AfTan中的Kex2位点对酶的影响很可能与之有明显差异。
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图1 使用I-TASSER构建的AfTanA分子模型（a）及Kex2位点（b）分析
Fig. 1 Molecular model of AfTanA constructed using the I-TASSER server (a) and analysis of Kex2 sites (b)
2.2 Kex2位点突变体的构建
采用一步式定点突变对afTan基因进行突变,对测序结果分析,分别成功构建突变pMDTM19T-afTanR316A、pMDTM19T-afTanΔKR克隆载体。随后,将突变基因分别连接至pPIC9K质粒中,并成功转入GS11中,经过对阳性克隆子诱导表达,各筛选出1 株高产菌株。
2.3 突变体的诱导表达及SDS-PAGE分析
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图2 野生型AfTanA及其突变体的SDS-PAGE分析
Fig. 2 SDS-PAGE analysis of wild-type AfTanA and mutants
将重组菌株按1.3.5节方法进行培养和诱导表达之后,对AfTanR316A和AfTanΔKR发酵液进行酶活力测定,25 ℃培养2 d发酵液中单宁酶活力分别为793 U/mL和830 U/mL。
通过对比野生型AfTanA、突变体AfTanR316A和AfTanΔKR发酵液SDS-PAGE结果(图2),发现野生型发酵产物在约45～60 kDa区域内处出现蛋白条带,明显低于理论分子质量(61.9 kDa);而突变体AfTanR316A和AfTanΔKR样品全部在100 kDa出现目标蛋白条带,分子质量明显偏大,这与野生型结果差异明显。分别对上述3 种酶经去糖基化酶Endo H处理,分子质量均不同程度变小,并且从结果中能明显发现野生型单宁酶是由2 个亚基组成(其分子质量分别为31.7 kDa和30.4 kDa),而2 个突变体均未出现类似的现象,表明Kex2位点突变体对Kex2蛋白酶的抗性明显增强。经去糖基化处理后,两突变体的分子质量均为70 kDa左右,较理论值大10kDa左右。经NetNGlyc 1.0分析,单宁酶AfTanA中具有8 个潜在的N-糖基化位点,经NetOGlyc 4.0分析AfTanA中含有14 处O-糖基化位点,表明单宁酶AfTanA的糖基化修饰使其分子质量明显增大。
2.4 突变体AfTanR316A和AfTanΔKR酶学特性分析
为探究Kex2酶切位点(K315-R316)对突变体酶学特性的影响,对2 个突变体的酶学特性进行测定,结果如图3所示。
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图3 单宁酶突变体的酶学性质比较分析
Fig. 3 Characterization of AfTanR316A and AfTanΔKR
由图3A可知,突变体在0～70 ℃范围内均有活性,最适反应温度均为20 ℃,属于低温酶。在反应温度为0 ℃时,突变体AfTanR316A和AfTanΔKR的酶活力分别维持68%和63%以上,在60 ℃条件下,突变体AfTanR316A能够维持10%左右酶活力,而突变体AfTanΔKR则表现出40%左右的酶活力。由图3B可知,突变体AfTanR316A和AfTanΔKR的pH值反应范围分别为2.0～8.0和2.0～9.0,最适反应pH值均为5.0左右。整体而言,在pH 2.0～5.0区间内,突变体AfTanR316A较AfTanΔKR活性高,而在pH 5.0～9.0区间内时,突变体AfTanΔKR较AfTanR316A活性高。由图3C可知,2 个突变体在pH值稳定性方面存在差异。在pH 2.0～12.0分别处理1 h后,突变体AfTanR316A和AfTanΔKR分别能够维持60%和85%以上酶活力。突变体AfTanR316A在pH 4～8区间内相对稳定,能够达到85%以上酶活力,而在碱性范围内,酶活力大幅度降低,在pH值12.0处理1 h后,AfTanR316A酶活力损失40%;由图3D可知,2 个突变体在40 ℃处理时,酶相对稳定,基本没有活性的损失。50 ℃处理条件,2 个突变体的热稳定性能差异明显,尤其当处理10 min以内时,AfTanΔKR能够维持90%以上活性,而AfTanR316A则维持70%左右活性,突变体AfTanΔKR表现出相对较高的稳定性,这表明“KR”位点不仅可以影响AfTan对Kex2酶的敏感性,同样对酶蛋白的热稳定性造成了影响,这很可能是“KR”所处的Loop结构的改变所造成的。Loop结构具有较强的柔性,继而会增加蛋白空间结构的摇摆性,而Loop结构中氨基酸的缺失,会使得Loop结构的刚性增强,继而提高酶的热稳定性。
2.5 金属离子和化学试剂对酶活力的影响及动力学参数
如表2所示,离子浓度对酶活力影响存在差异,且不同离子种类也存在较大差异。总体而言,两种突变体普遍被金属离子和化学试剂抑制,且高浓度条件(5 mmol/L)下抑制更加明显,而突变体AfTanΔKR较AfTanR316A受金属离子和化学试剂影响大。Fe3+对2 个突变体酶活力的抑制效应最显著,在高浓度下,对突变体AfTanR316A和AfTanΔKR能够抑制76%和97%酶活力。在低浓度(1 mmol/L)的条件下,除Fe3+外,其他金属离子和化学试剂均未对突变体AfTanR316A酶活力造成影响,而突变体AfTanΔKR均不同程度受到15%～80%抑制,Mg2+对酶活力影响最低。在高浓度(5 mmol/L)条件下,除Li+外,其他金属离子和化学试剂均对两突变体酶活力造成显著影响。除Fe3+离子外,Mn2+和Zn2+对酶活力均能抑制50%左右。
表2 金属离子和化学试剂对突变体相对酶活力的影响
Table 2 Effects of metal ions and chemical reagents on the activities of mutants%
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以没食子酸甲酯为底物,经动力学曲线回归方程计算,AfTanR316A Km为1.149 mmol/L,Vmax为10.427 mmol/(L·min);AfTanΔKR Km为1.46 mmol/L,Vmax为35.84 mmol/(L·min)。两者的Km差异不明显,但是Vmax改变较大,AfTanΔKR的催化提高了2 倍左右。结果表明,K315-R316位点不仅可以对酶的稳定性有影响,对于酶的催化效率影响也较为显著。
2.6 突变单宁酶在柿子汁中的应用
柿子中富含单宁物质,经水解可生成儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素和没食子儿茶素没食子酸酯等小分子的酚类化合物,这些物质具有较强的生物活性。本研究通过测定野生型单宁酶AfTanA和2 个突变体AfTanR316A和AfTanΔKR处理柿子后的多酚类物质变化,探讨在柿子汁加工中的应用潜力,结果如图4所示。
柿子汁中多酚经单宁酶处理后差异变化较明显,2 种突变体表现出与野生型单宁酶相似的催化效果。多酚含量平均提高约50%(约43 mg/L),这是由于大分子多酚物质(单宁)降解为小分子的酚类化合物所致,从而显著增强柿子汁多酚含量,突变体酶同野生单宁酶一样可应用在柿子果汁的加工中。
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图4 柿子汁水解前后多酚类物质含量分析
Fig. 4 Total phenolic concentration of persimmon juice before and after hydrolysis with wild-type AfTanA and mutants, separately
3 讨 论
目前,巴斯德毕赤酵母GS115表达系统能够使外源蛋白被正确修饰,己成功对上百种外源基因进行了表达,是最成熟的真核表达系统之一。随着研究不断深入发现,单宁酶是由2 个或2 个以上亚基单位(30 kDa和34 kDa)连接组成一个蛋白分子质量范围为50～320 kDa的多聚体。其中,造成这2 个亚单位产生的原因是由于Kex2蛋白酶的切割。Kex2蛋白酶是毕赤酵母内源性蛋白酶,主要在蛋白合成加工过程中发挥作用,而该酶对外源蛋白的过度切割,必然会影响到蛋白的稳定性和活性,因此探索单宁酶中的Kex2位点对酶学特性的影响意义重大。
经分析,两种突变体AfTanR316A和AfTanΔKR的电泳条带都显现为单一的电泳条带,表明AfTanA中Kex2位点(K315-R316)的替换和缺失都使得酶对Kex2蛋白酶抗性明显增强,而这与Koseki等发现Kex2位点氨基酸的精氨酸替换并不能增强单宁酶AoTanA对Kex2蛋白酶的抗性结论不一致。通过对这2 个单宁酶结构分析,两者的氨基酸一致性只有21%,这使得空间结构上存在差异。进一步分析发现单宁酶AoTanA中存在2 个Kex2位点(Lys310-Arg311,Lys315-Arg316),而单宁酶AfTanA仅存在1 个Kex2位点(Lys315-Arg316)。虽然它们全部处在LoopFK区域中,但是单宁酶AoTanA较单宁酶AfTanA长7 个氨基酸,这使得单宁酶AoTanA中的该区域暴露在蛋白的表面较多,更容易被Kex2蛋白酶所识别切割。突变菌株的发酵液中单宁酶活力较野生AfTanA提高了12%和22%左右,进一步说明Kex2位点的改造有利于单宁酶的发酵生产。
本课题组前期己对AfTanA进行了异源表达和性质测定,通过对比AfTanA、AfTanR316A和AfTanΔKR的酶性质发现,突变体和野生型单宁酶的酶学性质差异明显。如单宁酶AfTanA的最适反应温度为40 ℃,而两种突变体最适反应温度均为20 ℃,由常温酶转变为低温酶。大部分己报道的单宁酶最适反应温度范围为30～60 ℃,最适pH值为5.0～6.0,单宁酶活力能够稳定的pH值范围为3.0～8.0。Fuentes等从黑曲霉GH1中首次获得了嗜冷单宁酶,而随后鲜有低温单宁酶的报道。本研究分析造成反应温度发生改变的原因,很可能是由于野生型单宁酶AfTanA中2 个亚基(Kex2蛋白酶切割产物)通过C202-C502间的二硫键连接,而突变后的两蛋白片段是由高键能的肽键所连接,同时精氨酸的缺失使得结构中的次级键数目大大减少,继而该区域柔性增强,更有利于酶适应低温的反应条件。因此,K315-R316位点可以作为温度突变体相关研究的选择位点。参考己报道单宁酶的晶体结构可知,单宁酶AftanA可以分为“Lid”和“Catalytic”2 个模块,并且具有保守的“CS-D-HC”序列,相似的结构也出现在脂肪酶中。本研究单宁酶AfTanA中的Kex2位点(K315-R316)位于“Lid”模块LoopFK区域中,该区域与酶的催化效率和稳定性有较大相关性。Xiao Xunjun等研究发现脂肪酶中的“Lid”模块虽然不是酶的催化区域,但是在底物的接合和产物的释放过程中发挥着重要作用。Johnson等在探究磷酸烯醇丙酮酸羧激酶中的“Lid”模块中的Loop结构功能时,同样发现该结构与酶的催化效率有很大相关性。因此,Kex2酶切位点(K315-R316)对AftanA酶学性质的影响,很可能该位点所处的Loop区域结构的特性所造成的,而内在的分子机制还需进一步探明。
经对突变体和野生型单宁酶在柿子汁的应用对比分析发现,Kex2位点(K315-R316)的单点替换突变AfTanR316A和双点缺失突变AfTanΔKR对柿子中多酚物质(单宁)的降解能力并未发生改变,具有野生型单宁酶相同的应用效果。
本研究通过对单宁酶AfTanA中Kex2蛋白酶位点(K315-R316)对酶性质的影响分析,明确该位点对于酶的催化效率和稳定性影响较大,双点的缺失突变AfTanΔKR单宁酶表现出更加优良的酶学特性,具有在食品工业中发挥巨大作用的潜力。
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Mutational Analysis of Kex2 Sites and Characterization of Tannase from Aspergillus fumigatus
LU Haiqiang, CHEN Wei, HUANG Lei, GU Xinxi, TIAN Hongtao*
(College of Food Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071000, China)
Abstract: In this work, we investigated the effect of the Kex2 cleavage sites (K315-R316) on the enzymatic properties of tannase (AfTanA) from Aspergillus fumigates. We constructed a single amino acid mutant (AfTanR316A) and a double amino acid deletion mutant (AfTanΔKR). The two mutants were significantly enhanced for resistance to Kex2 proteases.Compared with the wild-type tannase (AfTanA), the mutants exhibited lower catalytic temperature and stronger stability. The optimum reaction temperatures of the mutants and the wild-type tannase were 20 and 40 ℃, respectively. After being treated for 1 h at pH 12.0, AfTanΔKR, AfTanR316A and AfTanA remained 85%, 60% and 0% of their original activity, respectively.After being treated for 1 h at 50 ℃, AfTanΔKR, AfTanR316A and AfTanA remained 40%, 21% and 2% of their original activity, respectively. The improved stability against pH and temperature were beneficial to the application of tannase at low temperatures and its production and storage. The Km and Vmax values of AfTanR316A were determined as 1.149 mmol/L and 10.427 mmol/(L·min). The Km and Vmax values of AfTanΔKR were determined as 1.46 mmol/L and 35.84 mmol/(L·min),respectively. In addition, compared with natural persimmon juice, juices treated separately with AfTanA and the mutants showed a 50% increase in the total phenolic concentration. In conclusion, the Kex2 protease cleavage sites (K315-R316)of AfTanA have a significant effect on the stability and catalytic efficiency, and AfTanΔKR could potentially be used in the food industry in the future.
Keywords: tannase; site-directed mutation; Kex2 protease; stability; food enzymes
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