山东省小麦田播娘蒿对双氟磺草胺抗性水平及靶标抗性机理
山东省小麦田播娘蒿对双氟磺草胺抗性水平及靶标抗性机理高兴祥，张悦丽，李美，李健，房锋
（山东省农业科学院植物保护研究所，济南 250100）
摘要：【背景】播娘蒿（Descurainia sophia）是一种冬小麦田分布广泛且危害严重的阔叶杂草，双氟磺草胺则是目前冬小麦田防除阔叶杂草应用面积最大的一种ALS抑制剂类除草剂。双氟磺草胺经多年应用后，对部分区域冬小麦田播娘蒿防治效果下降，可能与当地播娘蒿对双氟磺草胺产生抗药性有关。【目的】明确山东省冬小麦田播娘蒿对双氟磺草胺的抗性水平和抗性机理，为制定小麦田播娘蒿等阔叶杂草精准区域防控提供理论依据。【方法】以播娘蒿为研究对象，在温室内采用整株生物测定法测定40个播娘蒿种群对双氟磺草胺和对比药剂苯磺隆、2甲4氯共3种除草剂的抗性水平，同时根据播娘蒿ALS基因序列，设计引物，提取对双氟磺草胺高抗的播娘蒿单株基因组DNA，测序获得序列与敏感型基因进行比对，查找突变位点，明确靶标抗性机理。【结果】抗性水平测定结果表明，40个播娘蒿种群中有32个对双氟磺草胺敏感，占80.00%，低抗、中抗和高抗种群分别有3、3和2个，JN-1、JNI-2、LY-2为低抗种群，LC-3、LY-4、YT-1为中抗种群，相对抗性指数（RI）分别为49.00、26.44、21.09，BZ-1和DZ-3属于高抗种群，RI分别为52.00和194.00。对BZ-1和DZ-3进行的ALS基因检测结果表明，BZ-1种群ALS基因第197位氨基酸发生CCT（Pro）到TCT（Ser）或CTT（Leu）突变，DZ-3种群ALS基因第574位氨基酸发生TGG（Trp)到TTG（Leu）突变。另外，40个种群中对对比药剂苯磺隆产生抗性的种群有19个，占总样点数的47.50%，低抗种群有11个，中抗种群有6个，RI分别为38.05、13.55、11.54、10.45、11.50、11.02，高抗种群为DZ-3和LY-4，RI分别为244.75和68.50；40个播娘蒿种群对另一种对比药剂2甲4氯没有产生抗药性。【结论】山东省小麦田采集的40个播娘蒿种群中已有20.00%的种群对双氟磺草胺产生抗性，且高抗双氟磺草胺的播娘蒿种群发生不同位置氨基酸取代。播娘蒿对苯磺隆的抗性仍很严重，但对激素类除草剂2甲4氯未产生抗药性。针对播娘蒿发生区域，不能单一使用双氟磺草胺，应推广多种作用机理的除草剂交替、混和使用，从而延缓和控制杂草产生抗药性，同时扩大杀草谱、降低除草剂使用量。
关键词：双氟磺草胺；播娘蒿；抗性水平；抗性机理
0 引言
【研究意义】随着双氟磺草胺（florasulam）在我国冬小麦田的大面积应用，部分区域已发现小麦田主要阔叶杂草播娘蒿（Descurainia sophia）对双氟磺草胺的敏感性降低，在田间造成防治效果下降的现象，研究播娘蒿对双氟磺草胺的抗性水平和抗性机理，对制定抗性杂草区域性治理技术具有重要意义。【前人研究进展】播娘蒿是我国小麦田常见的一种恶性阔叶杂草，在华东、华北、东北、西北等地区均有分布，是黄淮海冬小麦田最主要的越年生阔叶杂草，在河南、山东和河北等省发生优势度均居于前三位。播娘蒿因其茎叶伸展侵占面积大，与禾本科作物小麦竞争有效资源占尽优势，严重影响小麦产量和品质，对播娘蒿的抗性研究主要集中于其对苯磺隆（tribenuron-methyl）的抗性，据报道播娘蒿抗苯磺隆主要是基因位点突变，第197、376和574位发生突变，且以197位点发生突变为主，约占90%。双氟磺草胺是美国陶氏益农公司在20世纪90年代中期开发成功的第5个三唑嘧啶磺酰胺类除草剂新品种，对小麦田几乎所有的阔叶杂草包括播娘蒿、荠菜、猪殃殃等均有很好的防除效果，是继苯磺隆之后在小麦田用量最大的除草剂，并可与植物生长调节剂、杀菌剂、其他除草剂等混用，现在黄淮海冬小麦田防除阔叶杂草的配方中几乎都有双氟磺草胺这一成分，但该药剂在我国应用多年后，对部分区域播娘蒿等阔叶杂草防治效果已明显下降。关于小麦田阔叶杂草对双氟磺草胺抗性报道不多，马鹏生报道了部分猪殃殃种群对双氟磺草胺产生一定抗性，也有抗苯磺隆的荠菜种群对双氟磺草胺产生交互抗性的报道，但均无抗性机理报道，而另一种重要阔叶杂草播娘蒿未见抗双氟磺草胺报道。【本研究切入点】笔者在田间调查时发现，因为双氟磺草胺具有杀草谱广、用量少等优点，近几年在小麦田推广面积很大，部分区域已发现用量在提高，防治效果下降现象，这很可能与播娘蒿对双氟磺草胺产生抗性有关。【拟解决的关键问题】在山东省冬小麦田主产区采集播娘蒿种子40份，采用整株生物测定法，研究播娘蒿种群对双氟磺草胺和对比药剂苯磺隆、2甲4氯（MCPA）3种除草剂的抗性水平，并对高抗双氟磺草胺播娘蒿种群进行靶标抗性位点测定，为小麦田杂草抗药性精准治理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
播娘蒿种子：2017年5月于山东省17地（市）小麦田采集自然成熟的播娘蒿种子，装入牛皮纸袋，种子自然晾干后储藏柜低温储藏。种群名称以采集点所在地级市的首字母缩写命名（表1）。
除草剂：98%双氟磺草胺原药，沈阳科创化学品有限公司；95%苯磺隆原药，江苏省激素研究所股份有限公司；95% 2甲4氯原药，江苏辉丰生物农业股份有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 抗性水平测定 试验于2018年2—4月进行，在玻璃温室中进行播娘蒿试材的培养，光照为自然光，温度靠暖气调整，试验期间温室温度为14—28℃。每个采集样点的播娘蒿为一个种群，在直径为9 cm的塑料盆中单独种植，覆土1—2 mm，每个种群种植64盒，将塑料盒放入装有水的搪瓷盘中，以盆钵底部渗灌方式浇水，每隔3 d浇水一次，保持土壤湿度。
表1 40个播娘蒿种群采集地点
Table 1 Collection sites information of 40 D.sophia populations
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抗性测定采用盆栽整株剂量-反应测定法。根据预试验，每种除草剂设置5个剂量，其中双氟磺草胺剂量为0.37、1.11、3.33、10.0、30.0 g·hm-2；苯磺隆剂量为5、20、80、320、1 280 g·hm-2；2甲4氯剂量为22.2、66.7、200、600、1 800 g·hm-2，每个种群均设置单独空白对照，每处理4次重复，于播娘蒿3—6叶期，采用ASS-4型自动控制喷洒系统进行药剂喷雾，喷头为扇形喷头，喷雾压力为0.35 MPa，用水量按照每公顷450 L计算。
施药后，观察同一种药剂下，40个播娘蒿种群的敏感差异，详细记录播娘蒿表现症状、表现时期以及不同种群的敏感差异。施药后30 d，用剪刀剪取各种群各处理播娘蒿地上部分，称量鲜重，每个种群根据相应的空白对照鲜重，计算鲜重抑制率。鲜重抑制率（%）=100×（空白对照鲜草重-处理区鲜草重）/空白对照鲜草重。
1.2.2 ALS基因突变分析 根据播娘蒿ALS基因序列（GenBank：FJ715633），设计引物（DS-F 5′ GGTA TCAAATCCCGTGCTCT 3′和DS-R 5′ CATATGCA TACAATCACCGGTT 3′），扩增片段包含目前已报道所有抗性相关位点。参照1.2.1的方法进行播娘蒿高抗种群植株的种植，待播娘蒿长到3—4叶时，采集药剂处理后存活植株的单株叶片，采用植物基因组提取试剂盒（TaKaRa）提取基因组DNA，具体提取方法参照试剂盒相关流程；PCR克隆（25 μL反应体系，参数为94℃ 3 min；95℃ 30 s，53℃ 45 s，72℃ 2min，30个循环；72℃ 10 min）其ALS基因序列，使用UNlQ-10 DNA纯化试剂盒（上海生工生物工程有限公司）回收PCR产物并送上海生工生物工程有限公司测序。将测序后获得序列与拟南芥敏感型ALS基因和氨基酸序列进行比对，查找相关突变位点。每个种群检测10株。
1.3 数据分析
用DPS 7.05软件对药剂剂量的对数值与鲜重抑制率的概率值进行回归分析，得到剂量-反应曲线、相关系数、抑制杂草生长50%的除草剂剂量（GR50）及95%置信区间。由于不同种群本身种子活力、生长势等有差异，所以相对抗性指数（resistance index，RI）＜5.00的均认定为敏感种群，RI=GR50（R）/ GR50（S），其中GR50（R）为抗性种群的GR50值，GR50（S）为敏感种群的GR50值。抗性判断参考高兴祥等：1.00≤RI＜5.00为敏感种群，5.00≤RI＜10.00为低抗性种群，10.00≤RI＜50.00为中抗性种群，RI≥50.00为高抗性种群。
2 结果
2.1 播娘蒿对双氟磺草胺抗性水平测定
双氟磺草胺药效表现较慢，施药后7 d播娘蒿开始出现黄化，而后生长被抑制，至药后15 d后开始死亡。40个播娘蒿种群中大部分种群对双氟磺草胺敏感，但BZ-1、DZ-3、LC-3、LY-4、YT-1 5个种群敏感性明显低于其他种群。
施药后30 d调查结果统计（表2）可见，双氟磺草胺对大部分播娘蒿种群效果很好，最敏感种群是DY-1和JNI-4，GR50均为0.11 g·hm-2，敏感种群有32个，占80.00%，抗性种群有8个，占总种群数的20.00%，部分种群抗性已很明显。其中低抗、中抗和高抗种群数量分别为3、3和2个，各自占总种群数的7.50%、7.50%和5.00%。从山东省不同区域来看，对双氟磺草胺产生抗性的播娘蒿种群分布无明显规律，8个抗性种群分布于7个地（市），最高抗性种群为DZ-3，RI为194.00。
2.2 播娘蒿对对比药剂苯磺隆和2甲4氯的抗性水平测定
苯磺隆药效表现与双氟磺草胺差别不大，施药后7 d播娘蒿开始出现黄化，而后生长被抑制，至药后15 d后开始死亡。表3为苯磺隆施药后30 d调查结果。40个播娘蒿种群敏感性差异明显，对苯磺隆最敏感的播娘蒿种群是HZ-1，GR50为0.56 g·hm-2，另外，DY-1、DZ-1、JN-2、WH-1等20个种群也比较敏感，RI＜5.00，敏感种群占52.50%；抗性种群有19个，占总种群数的47.50%，而且在抗性种群中，低抗、中抗、高抗种群分别为11、6、2个，分别占总种群数的27.50%、15.00%、5.00%。最高抗性种群是DZ-3，RI为244.75。
2甲4氯施药后观察，播娘蒿表现速度快，施药后3 d时播娘蒿即开始出现扭曲，叶片不伸展，药后7 d时茎叶开始黄化，而后逐渐死亡。40个播娘蒿种群对2甲4氯均敏感，效果无明显差异。表4为2甲4氯施药后30 d调查结果。2甲4氯对40个播娘蒿种群效果均很好，无明显抗性产生，RI在1.00—5.00，且大部分在3.00以下。
表2 播娘蒿种群对双氟磺草胺抗性水平测定
Table 2 Resistance level of D.sophia populations to florasulam
pagenumber_ebook=89,pagenumber_book=2403
表3 播娘蒿种群对苯磺隆抗性水平测定
Table 3 Resistance level of D.sophia populations to tribenuron-methyl
pagenumber_ebook=90,pagenumber_book=2404
表4 播娘蒿种群对2甲4氯抗性水平
Table 4 Resistance level of D.sophia populations to MCPA
pagenumber_ebook=91,pagenumber_book=2405
2.3 双氟磺草胺高抗种群ALS基因突变分析
对双氟磺草胺产生高抗种群BZ-1和DZ-3进行了ALS基因测序，测序分析结果显示两个高抗播娘蒿植株均发生了ALS基因功能位点的突变，但是突变位点或突变方向存在差异。BZ-1 ALS基因第197位氨基酸发生CCT（Pro）到TCT（Ser）或CTT（Leu）的突变，DZ-3 ALS基因第574位氨基酸发生了TGG（Trp）到TTG（Leu）的突变（表5）。
表5 高抗种群ALS基因突变分析
Table 5 Analysis of ALS gene mutations in highly resistant populations
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3 讨论
3.1 播娘蒿对双氟磺草胺及对比药剂苯磺隆、2甲4氯的抗性水平
1988年美国杜邦公司的苯磺隆在我国正式登记，我国小麦田除草剂进入一个飞速发展期，但苯磺隆连续多年使用后，小麦田播娘蒿、荠菜、猪殃殃、麦家公等阔叶杂草的抗性逐年加重，苯磺隆单剂逐渐退出市场，仅作为复配制剂的成分之一。本研究中，播娘蒿对苯磺隆的抗性仍然很普遍，抗性种群占47.50%，最高相对抗性指数为244.75。
双氟磺草胺是继苯磺隆之后在小麦田应用最广的防除阔叶杂草的除草剂，该药剂与苯磺隆一样，均属于ALS抑制剂类除草剂，目前市场上防除小麦田阔叶杂草的除草配方中，双氟磺草胺已成为一种必不可少的成分，该药剂由于用量低、活性高，且对小麦安全性高，已大面积应用，国内学者对双氟磺草胺以及复配制剂的应用进行了大量报道，但随着用药时间延长，效果逐渐下降，用药量逐渐加大，已是最初登记用量的3倍甚至更高，已有报道小麦田猪殃殃对双氟磺草胺产生一定程度的抗性，但未有小麦田主要杂草播娘蒿对双氟磺草胺的抗性报道，对双氟磺草胺产生抗性也没有引起足够的重视。从本试验结果可见，虽然仅有20.00%的播娘蒿种群对双氟磺草胺产生抗性，但两个高抗种群BZ-1和DZ-3的相对抗性指数分别达到了52.00和194.00。
本试验中播娘蒿种群未对对比药剂2甲4氯产生抗药性，2甲4氯在小麦田也主要应用于防除播娘蒿、荠菜，因此以播娘蒿、荠菜为主的地块，可以使用2甲4氯等不易产生抗药性的激素类药剂进行防除，多种阔叶杂草混生地块，可采用多种作用机制的除草剂混合使用或者交替使用，减少双氟磺草胺单一药剂的使用。
综合山东省播娘蒿40个种群对双氟磺草胺和对比药剂苯磺隆、2甲4氯的抗性水平测定结果，2甲4氯为激素类除草剂，40个播娘蒿种群未发现抗性产生，这也进一步印证了激素类除草剂不易产生抗药性。双氟磺草胺和苯磺隆为ALS抑制剂类除草剂，也是容易产生抗性的除草剂类型，从结果可以看出，抗双氟磺草胺和抗苯磺隆的播娘蒿种群存在着一定程度的一致性，但又不是完全一致。抗双氟磺草胺种群有8个，抗苯磺隆种群有19个，其中抗双氟磺草胺的8个种群中有7个也是抗苯磺隆种群，如高抗双氟磺草胺的播娘蒿种群BZ-1和DZ-3同时也是中抗和高抗苯磺隆种群；中抗双氟磺草胺种群LC-3、LY-4、YT-1同时分别为中抗、高抗和低抗苯磺隆种群；低抗双氟磺草胺的种群JN-1、JNI-2同时也是中抗苯磺隆种群，只有低抗双氟磺草胺的种群LY-2对苯磺隆没有抗性。其他抗苯磺隆的12个种群未见对双氟磺草胺的抗性。
3.2 播娘蒿对双氟磺草胺的抗性机理
靶标抗性机理和非靶标抗性机理是杂草对ALS类除草剂产生抗性的两大原因。靶标ALS基因突变或代谢作用增强是报道最多的ALS类除草剂抗性机理，国内外大量研究证实ALS存在8个抗性突变位点，分别为第122位丙氨酸、第197位脯氨酸、第205位丙氨酸、第376位天冬氨酸、第377位精氨酸、第574位色氨酸、第653位丝氨酸和第654位甘氨酸，任一位点发生氨基酸替代均可导致杂草抗药性的产生。本试验结果表明，靶标突变是播娘蒿种群BZ-1、DZ-3对双氟磺草胺产生高水平抗性的重要原因之一，种群BZ-1和DZ-3均发生ALS关键位点突变，但突变方式存在差异，这进一步证实了ALS突变的多样性。BZ-1的ALS基因第197位氨基酸发生了CCT（Pro）到TCT（Ser）或CTT（Leu）的突变，而DZ-3的ALS基因则是第574位氨基酸发生了TGG（Trp）到TTG（Leu）的突变，这一结果与邓维报道的关于播娘蒿对苯磺隆靶标抗性突变的3个位点（197、376和574位）研究结果具有一定的一致性，但突变方式不一样。至于二者抗性机理的关联性，有待进一步研究。非靶标抗性机理比靶标抗性复杂，这方面的研究报道较少。非靶标抗性机制是尽量减少除草剂到达目标部位的数量，从而减少除草剂对杂草的损伤，目前有关非靶标抗性机理报道最多的是植物代谢能力的增强。播娘蒿对双氟磺草胺抗性机理除了主要的靶标抗性外，是否还有非靶标抗性是下一步研究的重点内容之一。
4 结论
山东省40个播娘蒿种群中已有20.00%的种群对双氟磺草胺产生明显抗性，其中高抗种群的BZ-1和DZ-3相对抗性指数已高达52.00和194.00，且主要为靶标抗性。另外，播娘蒿种群对对比除草剂苯磺隆的抗性仍很普遍，对另一种激素类除草剂2甲4氯未产生抗性。因此，针对冬小麦田播娘蒿发生区域，不能单一使用双氟磺草胺，应推广多种作用机理的除草剂交替、混和使用，从而延缓和控制杂草产生抗药性，同时扩大杀草谱、降低除草剂使用量。
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Resistance Level and Mechanism of Descurainia sophia to Florasulam in Wheat Field of Shandong Province
GAO XingXiang, ZHANG YueLi, LI Mei, LI Jian, FANG Feng
(Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Ji’nan 250100)
Abstract: 【Background】 Descurainia sophia is the most widely distributed and harmful broad-leaved weed in winter wheat field, and florasulam is the most widely used ALS inhibitor herbicide for controlling broad-leaved weeds.After several years of application, the control effect of florasulam on D. sophia has been found to decline in some wheat fields, which may be related to the resistance.【Objective】The objective of this study is to clarify the resistance level and mechanism of D.sophia to florasulam, and to provide theoretical basis for the establishment of precise regional control of broad-leaved weeds in wheat field.【Method】A total of 40 populations of D.sophia were collected from winter wheat fields.Whole-plant dose response experiments were conducted to determine the resistance level of 40 populations to florasulam, tribenuron-methyl and MCPA in the greenhouse.At the same time, according to the ALS gene sequence of D.sophia, the genomic DNA of a single plant with high resistance to florasulam was extracted.The ALS gene sequences were obtained and compared with that of sensitive type Arabidopsis thaliana to find out the mutation site and the resistance mechanism.【Result】The results of resistance level determination showed that 32 of the 40 D.sophia populations were sensitive to florasulam, accounting for 80.00%.There were 3,3 and 2 populations of low resistance, medium resistance and high resistance, respectively.JN-1, JNI-2 and LY-2 belonged to low resistance populations.Three populations LC-3, LY-4 and YT-1 belonged to medium resistance with resistance index (RI) of 49.00,26.44 and 21.09, respectively.BZ-1 and DZ-3 belonged to high resistance populations with RI of 52.00 and 194.00, respectively.The ALS sequence analysis showed that there were mutations from CCT (pro) to TCT (Ser) or CTT (Leu) in amino acid 197 of ALS gene in BZ-1, while TGG (Trp) to TTG (Leu) in amino acid 574 of ALS gene in DZ-3.In addition, 19 of the 40 D.sophia populations were resistant to tribenuron-methyl, accounting for 47.50%, among them, 11 populations were low resistance, 6 populations were medium resistance with RI of 38.05, 13.55, 11.54, 10.45, 11.50, 11.02, and DZ-3 and LY-4 belonged to high resistance populations with RI of 244.75 and 68.50, respectively.All 40 populations were sensitive to MCPA.【Conclusion】Among the 40 populations of D.sophia collected from wheat fields in Shandong Province, 20.00% of them are resistance to florasulam, and the substitutions of amino acids occur in different positions in the populations with high resistance to florasulam.The resistance of D.sophia to tribenuron-methyl is still very serious, but all the populations are not resistant to MCPA.In view of the resistance area of D.sophia, the alternative and mixed use of herbicides with multiple mechanisms should be promoted, which can not only delay and control the development of resistance in weeds, but also expand the weed control spectrum and reduce the use of herbicides.
Key words: florasulam; Descurainia sophia; resistance level; resistance mechanism
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