利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因Badh2
利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因Badh2祁永斌，张礼霞，王林友，宋建，王建军
（浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所，杭州 310021）
摘要：【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容，其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑，从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系，使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理，在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点，通过Blast分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体，利用农杆菌介导的遗传转化法，通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型，经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量，明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体，通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T0代嘉58基因编辑的株系15株，在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型，均为不同单碱基插入不同位点；在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式，均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株，在第2外显子处共有5株，均为单碱基插入；在第7外显子处有6株，均为片段缺失。48株T1代秀水134基因编辑株系中，共获得16株无转基因标记的基因编辑株系，其中5株在第2外显子发生突变，11株在第7外显子处发生突变。4个T2代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295 μg·g-1，极显著（P<0.01）高于非转基因对照（0.046 μg·g-1）。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑，并且可获得无转基因成分的基因编辑株系，其香味性状得到明显改良。
关键词：水稻；CRISPR/Cas9；基因编辑；Badh2；香味
0 引言
【研究意义】水稻是中国重要的粮食作物，香米由于具有独特香味，深受消费者青睐，生产和市场价值较高。因此，水稻的香味性状已成为衡量大米品质的一个重要指标，是水稻品质改良的重要研究内容，发掘和创制优质香稻资源是开展稻米品质改良的重要途径。【前人研究进展】从20世纪70年代起，许多研究者对香米的香气成分进行了广泛而深入的研究，Yajima等在1979年报道香米含有114种挥发性化合物，Buttery等发现2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）是香米香味的主要组成成分，2-AP在香米品种除根系外的其他各个组织中均能被检测到。目前，研究表明，稻米香味主要受水稻第8染色体上的隐性基因Badh2调控。该基因由15个外显子和14个内含子组成，其中，第8外显子编码一个VTELGGKSP结构域，第9外显子编码一个28半胱氨酸结构域，都是2种β-乙醛脱氢酶BAD1和BAD2的保守域，第10外显子编码的EGCRLGSVVS也在BAD蛋白中非常保守，在非香型水稻中被发现。研究发现，在一些香米品种如苏御糯、泰国茉莉花型香米和印度巴斯玛蒂型香米品种中，由于在Badh2的第7外显子上有8 bp的碱基缺失和3个SNPs差异导致移码突变，翻译提前终止；在中国的一些香米品种中，发现Badh2第2外显子上有7 bp的碱基缺失，造成Badh2发生突变，从而产生香味。由于香型水稻中Badh2编码区的第7或第2外显子处发生了移码突变，导致其编码的乙醛脱氢酶翻译提前终止，功能保守的结构域不能翻译。因此，无法完成脱氢反应，从而造成2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的积累而产生香味。张江丽等鉴定了86份具有香味的水稻种质资源，其中绝大部分的香味性状受Badh2等位基因控制。因此，Badh2是调控稻米香味的主要基因，通过人工突变的方式，改变其DNA遗传信息，可以创制出新的香型种质资源。目前，鉴定稻米香味的常规方法是利用人工嗅觉直接判断，或者将需要检测的组织在水或KOH溶液中煮沸后根据气味再进行人工判断，也可以利用GC-MS气相色谱质谱联用仪通过成分检测确定其香味。这些方法在香味检测的过程中需要花费大量的人力、物力和时间，而且检测结果因个体差异并不准确，限制其在育种过程中的利用。随着生物技术的发展，利用分子标记辅助选择、转基因抑制表达、基因编辑等方法可提高育种效率，加快香型水稻的培育。利用香型品种中Badh2的分子特征，发展的SNP标记可用于香味基因的分子标记辅助选择，从而提高育种效率。利用RNAi技术降低Badh2在转基因植株中的表达，从而使2-AP不能被降解；Chen等利用玉米泛素启动子驱动人工microRNA在转基因植株表达，使转基因株系中的Badh2表达下调，其后代籽粒中的2-AP含量显著提高。近年来，随着基因编辑技术的不断发展和成熟，利用基因编辑技术改良目标性状基因成为有效的手段之一。转录激活样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技术，锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）技术和成簇规律间隔短回文重复（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR）等被视为有效的基因编辑工具。【本研究切入点】Shan等利用TALEN 技术，对日本晴的OsBadh2进行编辑，纯合的T1代株系中2-AP含量明显增加。邵高能等利用CRISPR/Cas9系统对中花11的OsBadh2进行编辑，在1株纯合的基因编辑株系中OsBadh2的转录显著下调，香味物质大量积累。因此，利用基因编辑技术改良水稻香味性状，可加快香稻育种进程。但日本晴与中花11均为模式品种，其本身农艺性状与推广品种相比具有一定的差距，难以在生产上直接利用。【拟解决的关键问题】本研究以浙江省主要推广的水稻品种嘉58、秀水134为研究材料，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得不同的转基因株系，通过测序及PCR鉴定获得Badh2发生突变并稳定遗传的无标记转基因纯合株系，基因编辑株系的2-AP含量显著高于非转基因对照，为香型水稻的利用提供新的种质资源。
1 材料与方法
1.1 材料
以浙江省主要推广的晚粳稻品种嘉58与秀水134为材料，利用农杆菌介导的遗传转化法，将植物表达载体T-DNA片段插入水稻基因组。转基因材料于2018年正季种植于浙江省农业科学院杨渡试验基地转基因试验区，采用常规种植与田间管理。
1.2 基因编辑载体构建
根据香型水稻在Badh2第2和第7外显子出现碱基缺失突变的特性，利用https://crispr.cos.uni-heidelberg. de/index.html在线分析工具，分别以第2和第7外显子序列为靶序列设计靶点，其中Oligo-up1和Oligo-lw1为第2外显子设计靶点接头，Oligo-up2和Oligo-lw2为第7外显子设计靶点接头。结合靶点上下游DNA序列通过Blast分析，确保其特异性。Oligo二聚体制备（20 μL体系），含Buffer Aneal 18 μL、上下游引物各1 μL。95℃加热3 min后，以0.2℃·s-1缓慢降至20℃。将Oligo二聚体构建至CRISPR/Cas9载体（图1），10 μL体系含CRISPR/Cas9载体2 μL、Oligo二聚体1 μL、Enzyme Mix 1 μL、和H2O 6 μL，20℃反应60 min（以上载体试剂盒由杭州百格生物技术有限公司提供）。构建好的Cas9/gRNA-Oligo质粒载体通过测序验证后用于水稻遗传转化。
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LB：载体左边界；U6：水稻OsU6启动子；SG：向导RNA；UBI：UBI启动子；Cas9：Cas9蛋白；Nos Ter：Nos终止子；35S：35S启动子；Hygro：潮霉素基因；Poly A Ter：PolyA终止子；RB：载体右边界
LB: Left border; U6: OsU6 promoter; SG: sgRNA; UBI: UBI promoter; Cas9: Cas9 protein; Nos Ter: Nos terminator; 35S: 35S promoter; Hygro: Hygromycin; Poly A Ter: Poly A terminator; RB: Right border
图1 CRISPR/Cas9载体示意图
Fig. 1 Diagram of the map of CRISPR/Cas9
1.3 基因编辑株系的靶点分析与鉴定
经过验证的质粒载体转化到农杆菌感受态细胞EHA105中，浸染并转化嘉58与秀水134愈伤组织，通过潮霉素筛选获得转基因再生植株。水稻叶片基因组DNA由CTAB法提取，利用Hpt引物（Hpt-F与Hpt-R，表1）和Cas9引物（Cas9-F与Cas9-R）通过PCR鉴定阳性转基因植株。PCR反应体系（20 μL）为2.0×PCR Buffer 10 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA 2 μL和H2O 7 μL。PCR反应程序为95℃ 3min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 5 min。PCR反应产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳后于紫外灯下拍照。根据阳性转基因植株靶点特性，分别以exon2和exon7的引物，利用高保真KOD Fx酶扩增靶点相邻序列。PCR反应体系（20 μL）为2.0×Kod Fx buffer 10 μL、dNTP（2 mmol·L-1）2 μL、引物各0.5 μL、Kod Fx 0.5 μL、DNA 2 μL和H2O 4.5 μL。PCR反应程序为95℃ 3min；95℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68℃ 30 s，35个循环；68℃ 5 min。PCR反应产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，割胶回收后测序，根据测序结果分析转基因T0代植株靶点的突变类型。
表1 本研究所用各种引物及序列
Table 1 The primers sequence in this study
1.4 稻米香味2-AP含量测定
分别取基因编辑植株和对照的成熟种子30 g，去壳并将糙米碾磨成米粉后测定香味物质2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量。以2,4,6-三甲基吡啶作为内标（浓度229.25 ng·ml-1），每次称取400 mg米粉样品，重复3次，置于10 ml细口玻璃瓶，加入0.8 ml含有内标的乙醇浸提试剂于80℃烘箱中浸提3 h，取出静置至室温，利用0.22 μm的一次性针头过滤膜过滤，取150 μl于内衬管中后放入2 ml样品瓶，使用GC-MS气相色谱质谱联用仪（日本岛津公司）测定，检测数据由Excel 2010和SPSS17.0软件进行分析。
2 结果
2.1 基因编辑表达载体的构建
以日本晴DNA序列为模板序列，分别以水稻Badh2（Os08g32870）的第2和第7外显子为靶点，结合https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index. html在线分析工具，通过Blast序列比对，分别设计了20和19 bp保守的特异序列，通过制备Oligo二聚体后，将其构建到CRISPR/Cas9表达载体（图2）。构建好的质粒载体利用引物SG-SR3和PUV4-R进行PCR扩增，PCR产物经测序后确认sgRNA序列已构建到表达载体中，将其转化到农杆菌感受态EHA105后进行遗传转化。
2.2 转基因株系Badh2突变特性分析
利用农杆菌介导的水稻转基因法，转化嘉58和秀水134的愈伤组织，通过潮霉素选择分别获得26株和18株独立的转化株系。为鉴定转基因株系在Badh2第2和第7外显子的突变情况，分别以exon2-F和exon2-R引物对与exon7-F和exon7-R引物对，利用高保真酶KOD Fx对Badh2的靶点相邻序列进行PCR扩增并测序。结果显示，26株嘉58转基因株系在第2外显子处共有10株，其中无突变2株，8株转基因突变株系有5种不同的突变方式，均为不同单碱基插入不同突变位点；第7外显子处的转基因株系共有16株，其中9株未发生突变，7株转基因株系发生5种突变方式，均为片段或碱基缺失（图2）。因此，共获得嘉58基因编辑株系15株。18株秀水134的转基因株系在第2外显子处共有8株，其中3株无突变，5株均为单碱基插入；在第7外显子处有10株，其中4株无突变，6株均为片段缺失（图2）。因此，共获得秀水134基因编辑株系11株。
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Start code：起始密码子；Stop code：终止密码子；Exon2：第2外显子；Exon7：第7外显子；sgRNA target site：sgRNA靶点。方框表示靶标序列，红色下划线字体表示PAM序列，蓝色字体表示插入碱基，横线表示缺失碱基，+表示碱基插入，-表示碱基缺失The box represented target sequence. The red words with the underline represented PAM sequence. The blue words indicated the insertion base. The transverse line indicated the deletion sequences. + represented base insertion, -indicated base deletion
图2 Badh2第2和第7外显子靶点设计及突变类型分析
Fig. 2 Diagram of the sgRNA design and mutation analysis on the exon2 and exon7 of Badh2 gene
2.3 无标记转基因株系鉴定
为获得无转基因成分的基因编辑株系，选择秀水134基因编辑的2个T0代株系Bh57和Bh53开展进一步的分析，其中Bh57为单碱基插入造成移码突变，Badh2蛋白翻译提前终止；Bh53为片段缺失，其编码的氨基酸与野生型相比缺少6个氨基酸。每个株系种植24株，提取单株基因组DNA并分别利用潮霉素选择标记Hpt引物对与核酸酶Cas9引物对，通过PCR检测分析其在T1代株系中的情况。结果表明，在Bh57的24个T1代单株中，共检测到5株不含Hpt和Cas9（图3），测序结果表明其突变特性与T0代一致；同时，在Bh53的24个T1代单株中，共检测到11株不含Hpt和Cas9（图3），测序结果表明其突变特性与T0代一致。因此，可以从T1代株系中分离到不含转基因成分的基因编辑株系，而且这些株系在靶点的突变特性与其T0代一致，基因编辑的这种突变可以稳定遗传到下一代。根据田间表现，从2个T1代株系中各选择2个单株进行繁殖，分别命名为Bh1、Bh2、Bh3和Bh4。
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图3 T1代基因编辑株系中潮霉素Hpt（A）与核酸酶Cas9（B）的PCR检测
Fig. 3 PCR detection of Hpt (A) and Cas9 (B) gene in the gene-editing plants of T1 generation
2.4 基因编辑株系中香味物质2-AP的含量检测
为检测基因编辑株系中香味物质2-AP的含量，分别选择并收获4个T2代基因编辑株系Bh1、Bh2、Bh3和Bh4的成熟种子，去壳后碾磨成糙米米粉，利用GC-MS气相色谱质谱联用仪测定，其中，Bh1与Bh2为单碱基插入后导致移码突变，Bh3与Bh4为18 bp片段缺失即为缺失突变。2-AP含量检测结果显示，所有基因编辑株系的2-AP含量均极显著（P<0.01）高于野生型对照品种（0.046 μg·g-1），其中Bh2的2-AP平均含量最高，达0.347 μg·g-1，Bh3与Bh1的2-AP平均含量分别为0.332和0.309 μg·g-1，Bh4的2-AP平均含量最低为0.295 μg·g-1，而野生型对照的2-AP平均含量仅为0.046 μg·g-1（图4）。因此，利用基因编辑技术使水稻Badh2发生突变，可获得香味性状得到改良的香型材料。
3 讨论
香味是影响稻米品质的一个重要性状，是水稻品质改良的主要研究目标。香米的种植与选育具有悠久的历史，国外有著名的印度巴斯马蒂型香米、泰国的茉莉花香型、日本的宫香、美国的Jasmine85和Della都以其独特的香味、优良的米质享誉世界。中国的香米种植也具有悠久的历史，主要有东北的稻花香，云南的螃蟹谷，广西靖西香糯等香米稻种资源，但是这些品种不仅具有独特的地理区域特性，而且产量、抗倒伏、抗病性等亟需改良。目前，传统育种仍以杂交、回交等方式将香味性状导入目标品种，但由于香味成分检测繁杂，传统的检测方法主观性较强，准确性有待提高，难以大规模利用。因此，利用传统的育种技术改良稻米香味性状仍然受到各种因素的制约。
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不同字母表示不同株系在0.01水平上差异极显著
Different letters indicated that there are significantly different at the level of 0.01 among different lines
图4 基因编辑株系中2-AP含量（n=4，平均数±标准差）
Fig. 4 The content of 2-AP in the gene-editing lines (n=4, mean±SD)
随着生物技术的发展，尤其是香味基因Badh2的克隆，分子标记辅助选择、RNAi、基因编辑等技术的不断成熟，通过香味基因的定向改良提高香味品质显得更为高效。前人研究表明，Badh2是控制稻米香味的一个重要基因，通过生物技术方法使Badh2发生突变，从而获得定向改良的香味资源用于育种利用。但是，通过基因编辑获得的香型水稻材料均以模式品种日本晴、中花11等为转化受体，其本身农艺性状与推广品种相比具有一定的差距，难以在生产上直接利用，通过基因编辑获得的香型材料仍需通过杂交、回交等传统技术导入推广品种才能得以在生产上利用。因此，其应用受到一定的限制。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以浙江省主要推广的水稻品种嘉58与秀水134为改良目标，通过Badh2的定向编辑，获得不同类型的转基因突变株系，经PCR分析结合测序鉴定，可在转基因后代中分离到无转基因标记的纯合株系，而且其突变特性可稳定遗传给后代，2-AP含量的检测结果表明，这些转基因株系的香味成分均显著高于对照秀水134，其香味性状得到明显改良。同时，秀水134与嘉58为浙江省主要推广的粳稻品种，其本身农艺性状优良，基因编辑后代株系具有潜在的应用价值。
CRISPR/Cas9技术是目前应用最为广泛的基因编辑技术，其Cas9蛋白主要由RECⅠ、RECⅡ、Bridge helix、HNH、RuvC，PAM-Interacting等功能域组成，其中RECⅠ负责与向导RNA的结合，HNH和RuvC主要负责单链DNA的切割。随着Cas9蛋白密码子的优化，编辑效率得到了大幅提升，Cas9核酸酶一般在PAM序列下游第3个碱基开始切割双链DNA，在切割与修复的过程中产生突变。本研究利用优化的Cas9蛋白将水稻Badh2第2和第7外显子作为靶标序列进行基因编辑。测序结果显示，不同靶点产生的突变类型各不相同，不仅有单碱基插入，还有碱基缺失，甚至大片段缺失，其在靶点的突变仍具不可预测性。但不管是碱基插入造成的移码突变还是片段缺失造成的缺失突变，这种突变均能在后代株系中稳定遗传，并且其米粉中的2-AP含量显著高于对照，因此，在改良稻米香味性状方面仍有效。此外，CRISPR/Cas9基因编辑技术仍存在脱靶等缺陷，组织培养过程中也存在自然突变的可能。因此，基因编辑株系在香味性状得到改良的前提下，其潜在的突变等仍需要做进一步的分析，从而为优良香型水稻材料的创制提供重要的种质资源。
4 结论
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，可对水稻香味基因Badh2第2和第7外显子进行定向突变，且这种突变能够稳定遗传给后代。无标记基因编辑株系稻米中香味成分2-AP含量极显著高于对照秀水134，通过基因编辑Badh2可实现对稻米香味性状的定向改良。
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CRISPR/Cas9 Targeted Editing for the Fragrant Gene Badh2 in Rice
Qi YongBin, Zhang LiXia, Wang LinYou, Song Jian, Wang JianJun
(Institute of Crop Science and Nuclear Technology Utilization, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021)
Abstract: 【Objective】Rice fragrance, a very important trait for quality improvement, is mainly controlled by a recessive gene Badh2. In this study, CRISPR/Cas9-mediated editing were used to generate the gene-edited rice plants with the fragrant Badh2 in the conventional elite rice varieties, and the trait of fragrance was improved.【Method】 The targeted sequences were designed according to the sequence of exon2 and exon7 of the Badh2 by the principle of CRISPR/Cas9 gene editing. Its specificity of the targeted sequence was determined by Blast analysis, and then constructed into CRISPR/Cas9 expression vector. The callus of Jia58 and Xiushui134 which are widely cultivated in the Zhejiang Province were selected as explants to transform by Agrobacterium-mediated genetic transformation, and the positive transgenic plants were obtained by the screening of hygromycin resistance. Sequencing analysis of transgenic lines was used to detect the presence of the mutation type on the loci of Badh2. Stable marker-free gene-edited lines carrying the mutation on Badh2 were obtained by PCR analysis and identification. The content of 2-AP in the brown rice flour were measured by GC-MS, and the difference between the gene-edited lines and non-transgenic control was determined. 【Result】Badh2 of the transgenic lines was directionally mutated by the genetic transformation using the expression vector on which the target sequence of the exon2 and exon7 were designed and constructed. A total of 15 T0 gene-edited lines were obtained from Jia58. Eight of them were generated mutation on the exon2 with five different mutations types in which different single base was inserted into different position. Seven of them were generated mutations on the exon7 with five different mutation types in which the base or fragment deletion was produced. A total of 11 T0 gene-edited lines were obtained from Xiushui134, of which five lines were generated mutations on the exon2 with the single base insertion and six lines on the exon7 with the fragment deletion. A total of 16 marker-free gene-edited lines were obtained from 48 T1 Xiushui134, of which five lines were generated mutations on the exon2, and 11 lines on the exon7. The average 2-AP content in brown rice flour of four T2 gene-edited lines were 0.309, 0.347, 0.332 and 0.295 μg·g-1 respectively, which were significantly higher (P<0.01) than that of the non-transgenic control (0.046 μg·g-1). 【Conclusion】 The Badh2 which controlled the rice fragrance trait was directionally edited by using CRISPR/Cas9-mediated technology, and the marker-free gene-edited lines were obtained, of which the fragrance of Badh2 edited lines were significantly improved.
Key words: rice; CRISPR/Cas9; gene editing; Badh2; fragrance
收稿日期：2019-09-02；
接受日期：2019-11-30
基金项目：浙江省科技厅公益技术研究项目（2017C32007）、浙江省粮食新品种选育重大科技专项（2016C02050）、国家重点研发计划“七大作物育种”重点专项（2017YFD0100302）、浙江省农业科学院人才培养项目（2018R16R08E01）
联系方式：祁永斌，E-mail：qi_yongbin@hotmail.com。通信作者王建军，E-mail：wangjj4197@163.com
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（责任编辑 李莉）
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