黑土水溶性有机碳对有机物料还田的响应
黑土水溶性有机碳对有机物料还田的响应魏丹1,4，蔡姗姗2，3，李艳1，4，金梁2，王伟2，李玉梅2，白杨4，胡钰4
（1北京市农林科学院植物营养与资源研究所，北京 100097；2黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所，哈尔滨 150086；3沈阳农业大学土地与环境学院，沈阳 110866；4东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030）
摘要：【目的】探究不同有机物料还田措施下黑土水溶性有机碳含量及组成的变化特征，为黑土区土壤肥力提升提供科学依据。【方法】以黑龙江省克山县定位7年的有机物料还田小区为研究对象，采用常规测定及荧光分析方法，以单施化肥处理为对照，对配施有机肥、生物炭、秸秆3种有机物料处理下土壤水溶性有机碳含量及结构进行分析。【结果】与单施化肥相比，配施有机物料使土壤水溶性有机碳含量提升9.65%—20.30%，土壤总有机碳含量提升6.63%—14.86%。各有机物料还田处理下土壤水溶性有机碳中类酪氨酸蛋白质物质、类色氨酸蛋白质物质减少。有机肥施入使水溶性有机碳中溶解性微生物代谢产物增加，使富里酸类物质、腐殖酸类物质增加并使二者结构简化；秸秆、生物炭使土壤水溶性有机碳中富里酸类物质结构简化；生物炭的添加使土壤水溶性有机碳中腐殖酸类物质复杂化。【结论】有机肥、生物炭、秸秆3种有机物料不同程度上提升了土壤水溶性有机碳中各组分含量、增强土壤微生物分解代谢、使水溶性有机碳中结构相对简单的富里酸组分含量增加、结构简化，其中以有机肥效果最佳。
关键词：黑土；有机物料；水溶性有机碳；三维荧光光谱；PARAFAC分析
0 引言
【研究意义】土壤有机碳是土壤肥力的核心，影响着土壤中的物质循环与能量流动。但土壤中的总有机碳含量变化是一个长期的过程，短期内变化较为缓慢。土壤水溶性有机碳（water-soluble organic carbon，WSOC）是土壤中极为活跃且重要的组分，尽管其含量很少，但易被微生物吸收利用，可直接参与土壤肥力转化过程，在调节物理、化学、生物肥力方面均起到了重要作用。土壤水溶性有机碳易受土地利用方式、施肥方式、作物及土壤微生物等因素变化的影响，是指示土壤有机碳变化的敏感指标之一。【前人研究进展】在不同类型土壤中的研究结果表明，在施肥因素的影响下，土壤水溶性有机碳是土壤有机质中受影响的主要成分之一。MITCHELL等在森林土壤中的研究发现，加施生物炭可以显著提高土壤水溶性有机碳的含量，增强土壤微生物活性。在我国对4种典型农田土壤（黑土、潮土、红壤、水稻土）的活性有机碳研究显示，无论是旱田还是水田土壤，长期有机无机配施均可提高土壤水溶性有机碳及总有机碳含量。针对黑土长期施肥的研究发现，有机肥与化肥配施可显著提升土壤水溶性有机碳含量，撂荒处理次之，秸秆还田处理的土壤水溶性有机碳也在一定程度上有所提升，均高于单施化肥处理。【本研究切入点】黑土区是我国的主要粮食产区，黑土肥力的维持和提升影响着我国粮食安全。近年来，由于过度利用及不合理施肥，黑土区农田有机质含量及品质下降，土壤理化性状恶化，威胁着黑土区粮食生产及生态环境。因此，提升黑土有机质含量、改善黑土肥力对农业生产具有重要意义。当前对土壤水溶性有机碳的研究主要集中在含量上，施肥对水溶性有机碳结构的影响研究较少。【拟解决的关键问题】以东北黑土区定位施肥7年的农田土壤为研究对象，对不同有机物料还田下土壤水溶性有机碳含量进行测定，并分析不同有机物料培肥条件下土壤水溶性有机碳的荧光结构变化。通过研究土壤水溶性有机碳含量及结构变化，探讨其与不同有机物料还田措施的响应关系，以期为黑土科学施肥、地力提升提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验地概况
试验地位于原长春指挥所农副业基地，地处黑龙江省齐齐哈尔市克山县涌泉乡均冲村（E47°43′—48°18′，N126°01′—126°41′），年平均气温1.3℃，有效积温2 500℃，无霜期120 d，年降水500 mm。试验地土壤类型为黑土，有机物料还田定位试验始于2013年，至2019年本试验已持续7年。土壤特性见表1。
1.2 试验设计
试验共设4个处理：单施化肥（NPK）、有机肥配施化肥（MNPK）、秸秆还田配施化肥（SNPK）、生物炭配施化肥（BNPK），其中单施化肥为对照处理。每个处理重复3次，小区采取随机区组设计，小区面积为130 m2（5.2 m×25 m）。小区种植制度采取一年一熟大豆-玉米轮作模式，2013年种植作物为大豆，2014年为玉米，以此类推，每两年为一个轮作周期；玉米品种为德美亚1号，大豆品种为黑河36；本试验年份（2019年）种植作物为大豆。各处理化肥施用量相等，大豆种植年份的施肥量为N﹕P2O5﹕K2O=42﹕72﹕30，其中尿素38 kg·hm-2，二铵150 kg·hm-2，硫酸钾60 kg·hm-2；玉米种植年份的施肥量为N﹕P2O5﹕K2O=150﹕60﹕40，其中尿素282 kg·hm-2，二铵125 kg·hm-2，硫酸钾86.9 kg·hm-2。有机肥施用量为17 250 kg·hm-2（猪粪，鲜重），生物炭为玉米秸秆炭化制备，施用量为2 760 kg·hm-2，均为春季施入；秸秆还田方式为秋季收获后，将当季作物秸秆机械粉碎抛洒全量还田（大豆秸秆还田量约为4 420 kg·hm-2，玉米秸秆还田量约为8 450 kg·hm-2）。大豆种植年份所有肥料在播种期一次性施入，玉米种植年份尿素在播种期施用总肥量的一半，大喇叭口期追肥剩余尿素，其余肥料在播种期一次性施入。
表1 土壤理化特性（0—20 cm）
Table 1 Physical and chemical characteristics of soil (0-20 cm)
土壤样品采集于2019年5月6日大豆播种前，采样深度为0—20 cm。
1.3 测定项目与方法
以下各项测定均为3次重复。
1.3.1 土壤基本理化性状测定 土壤pH测定：pH计（水土比为2.5﹕1）；土壤有机质的测定：重铬酸钾外加热法；土壤碱解氮含量的测定：碱解扩散法；土壤速效磷含量的测定：NaHCO3浸提-钼锑抗比色法；土壤速效钾含量的测定：NH4Ac浸提-火焰分光光度法。
1.3.2 土壤水溶性有机碳 水溶性有机碳（water soluble organic carbon，WSOC）提取方法：称取过2 mm筛风干土样3.00 g，置于50 mL离心管内，加蒸馏水30 mL，搅匀，置于恒温水浴振荡器上振荡（180 r/min，50℃±2℃）1 h，取出后3 500 r/min离心15 min，上清液用中速定量滤纸过滤。WSOC溶液碳含量采用TOC分析仪测定。
1.3.3 荧光光谱测定 使用超纯水将WSOC溶液稀释至15 mg·L-1，以备荧光测定。荧光光谱的测定采用日立F-7000荧光光度计。设置光电倍增管（PMT）电压为700 V，激发光波长200—490 nm，间隔10 nm，发射光波长250—550 nm，间隔5 nm，激发光和发射光的狭缝宽度均为5 nm。
1.4 数据分析
数据的统计分析采用Excel 2010，差异显著性分析采用SPSS软件，荧光结构分析采用FL Solutions、Matlab软件，在三维光谱和平行因子分析中，使用Matlab软件消除样品的拉曼散射。荧光区域积分采用Origin9.1。
2 结果
2.1 不同有机物料还田下土壤有机碳含量
与对照处理相比，不同有机物料还田后，土壤SOC、WSOC含量均有不同程度提升（表2）。其中，土壤SOC含量以MNPK处理最高，且与其他处理间差异显著；BNPK、SNPK间差异不显著。与NPK处理相比，MNPK、BNPK、SNPK处理下的土壤SOC含量分别提升了14.86%、7.78%、6.63%。
表2 土壤水溶性有机碳含量及其在总有机碳含量中的占比
Table 2 Distribution of WSOC accounting for the proportion of total organic carbon in soil
*小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同
*The values are the means of three replicates (Means±SD). Lowercase letters in each column indicate significant differences at P＜0.05. The same as below
各处理下的WSOC含量不同。黑土农田有机物料还田试验研究结果显示，耕层WSOC含量大小依次为MNPK处理>BNPK处理>SNPK处理>NPK处理，MNPK处理的WSOC与对照NPK处理间差异显著，其余处理间差异不显著。在黑土区连续有机物料还田7年后，MNPK、BNPK、SNPK处理下的WSOC含量较对照处理（NPK）分别提升了20.30%、9.83%和9.65%。不同有机物料还田处理下的土壤WSOC占比分别提升了0.03、0.02、0.02个百分点，各处理间差异不显著。
2.2 不同有机物料还田下土壤水溶性有机碳荧光结构
2.2.1 水溶性有机碳三维荧光图谱 在已有的研究中，将三维荧光区域划分为5个部分。其中，区域Ⅰ和Ⅱ分别代表类酪氨酸、类色氨酸芳香蛋白质类物质，区域Ⅲ为富里酸类物质，区域Ⅳ为溶解性微生物代谢产物，区域Ⅴ为腐殖酸类物质。详见表3。
在本研究中，不同处理下的土壤WSOC三维荧光光谱具有类似指纹特征，均出现2个荧光特征峰（图1），即富里酸类物质荧光峰（Peak A，各处理峰值：Ex/Em=（240—250）nm/（420—435）nm），由荧光效率高、分子量小的有机物质产生；类腐殖酸物质荧光峰（Peak C，各处理峰值：Ex/Em=（310—320）nm/（395—425）nm），由结构较为稳定、分子量大的有机物质产生。三维荧光图谱结果显示，试验区黑土WSOC以富里酸类物质、腐殖酸类物质占主导地位，WSOC的结构较为复杂、腐殖化程度较高。
表3 三维荧光区域划分
Table 3 Three-dimensional fluorescence region division
width=426.75,height=336.2
图1 不同有机物料还田下水溶性有机碳三维荧光图谱
Fig. 1 Three-dimensional fluorescence spectra of water-soluble organic carbon under different organic materials
三维图谱中荧光峰所在的激发/发射波长变小，即为蓝移，反之则为红移。本研究WSOC三维荧光图谱结果显示，各有机物料中，以MNPK处理下的WSOC荧光结构变化最大，其富里酸类物质、类腐殖酸物质荧光峰波长均有蓝移现象，说明两种物质的芳香度和分子量有下降趋势。与NPK处理相比，SNPK处理的富里酸类物质荧光峰在激发、发射波长处均有蓝移，类腐殖酸物质荧光峰处没有变化。BNPK处理下的富里酸类物质荧光峰与NPK处理相比，在发射波长处有蓝移（2 nm），这一趋势与有机肥、秸秆还田处理相似；类腐殖酸物质荧光峰则在发射波长处有红移现象，芳香度和分子量增加。
为定量揭示各有机物料还田对黑土WSOC的影响，使用Origin软件对4个处理下的土壤WSOC不同区域的荧光数据进行积分，各区域积分值占总区域积分值的百分比如表4所示。
试验区域农田黑土WSOC中各类物质的含量为类腐殖酸物质＞富里酸类物质＞溶解性微生物代谢产物＞类色氨酸蛋白质物质＞类酪氨酸蛋白质物质。其中，对照NPK处理土壤WSOC中的类酪氨酸蛋白质物质、类色氨酸蛋白质物质、富里酸类物质（区域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）积分值均高于3个有机物料处理，这可能与这3种处理中有机物料含量较多，土壤微生物代谢使结构较为简单的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类物质被分解利用有关。MNPK处理下的土壤WSOC溶解性微生物代谢产物（区域Ⅳ）积分百分比高于其他处理（3.96%—4.24%）且达到显著水平（P＜0.05），而酪氨酸蛋白质物质、类色氨酸蛋白质物质、富里酸类物质、类腐殖酸物质（区域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ）的积分百分比则少于其他处理。3个有机物料黑土处理下的类腐殖酸物质（区域Ⅴ）积分高于NPK处理，其中以BNPK处理下最高，生物炭施入使土壤WSOC中类腐殖酸物质结构复杂化，这与三维荧光图谱所示结果相一致。
表4 三维荧光区域积分（FRI）百分比
Table 4 Percentage of fluorescence region integral
2.2.2 水溶性有机碳的PARAFAC分析 运用PARAFAC分析方法，将不同处理下的土壤水溶性有机碳三维荧光数据进行分解，识别出两个荧光组分，见图2。其中，组分C1包含2个激发峰、1个发射峰（Ex/Em=360/460，270/460）为陆源类腐殖物质，主要来源于高等植物腐解产生的有机物；组分C2包含2个激发峰、1个发射峰（Ex/Em=230/395，320/395），为富里酸类物质，是典型的陆源有机物，通常是在微生物作用下，由陆源类富里酸物质转化而成。两个荧光峰处，类腐殖酸组分（C1）的激发（Ex）与发射（Em）波长均高于类富里酸组分（C2），其分子结构也较类富里酸组分复杂。类腐殖酸组分荧光峰所在位置激发、发射波长均较长，说明该组分中含有高分子量和较高芳香度的有机物质，难以分解利用；类富里酸组分荧光峰所在位置与羟基、羧基组成相关，腐殖化程度较低。
比较各处理类腐殖酸（C1）、类富里酸（C2）组分WSOC的Fmax值可知（图3），MNPK处理下的土壤WSOC以类富里酸组分为主，NPK、BNPK、SNPK处理的土壤WSOC则以类腐殖酸组分为主；3个有机物料还田处理类腐殖酸、类富里酸的Fmax值均高于NPK处理。各处理的类腐殖酸组分Fmax值以MNPK处理最大，但各处理间无显著差异；MNPK使土壤WSOC的类富里酸组分显著增加。此外，SNPK处理的类腐殖酸组分含量高于NPK、BNPK处理，这与秸秆还田使土壤中植物残体增加，腐解产生高分子量有机物有关。
3 讨论
土壤中WSOC主要来源于植物残体、外源有机物投入、植物根系分泌物、土壤微生物代谢产物、土壤有机质分解等，种植方式、施肥方式或气候因子发生变化时，WSOC的化学结构也会相应改变。土壤WSOC与SOC含量极显著相关，SOC与WSOC可进行分解与合成转化，因此，二者常处于动态平衡中。在本研究中，黑土耕层土壤水溶性有机碳含量大小依次为MNPK处理>BNPK处理>SNPK处理>NPK处理，有机肥、秸秆、生物炭的投入使土壤中SOC及WSOC含量增加，这与有机物料还田产生激发效应，土壤微生物可获得更充足的碳源，加速了微生物生长代谢活动，从而促进了土壤有机碳矿化及作物残体分解，使土壤有机碳更多地转化为活性有机碳组分有关。在李森等的研究中，土壤水溶性有机碳的含量随着作物生育时期的推进而呈增加趋势。在本试验中，秸秆为秋季还田，而试验区冬季气温较低、秸秆腐解慢；生物炭为春季施入，播种前并未能发挥出最佳效用。因此试验结果中配施秸秆还田、生物炭处理下的土壤水溶性有机碳含量与对照单施化肥处理之间的差异并不显著，可能与本次试验为播前取样有关。
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图2 基于PARAFAC分析方法的土壤水溶性有机碳荧光组分
Fig. 2 Fluorescent components of soil water-soluble organic carbon based on PARAFAC analysis method
width=208.25,height=173.55
图3 水溶性有机碳各荧光组分Fmax值
Fig. 3 Fmax of fluorescent components of water-soluble organic carbon
在腐殖质的多元酚形成理论中，木质素中和微生物代谢产生的多元酚和醌有机化合物参与土壤腐殖质的形成，醌与含氮化合物聚合形成富里酸类物质，再进一步聚合为腐殖酸类物质。本研究中，土壤WSOC三维荧光图谱显示出富里酸类物质、腐殖酸类物质两个荧光特征峰，这是因为在含水量低、植物残体较少的黑土农田中，有机化合物易聚合为芳香度高、腐殖化程度高的物质。在本研究中，土壤中施入有机肥料后，土壤WSOC中的芳香族化合物减少、有机物的芳香度和分子量下降；秸秆施入后，土壤WSOC中结构相对简单的富里酸类物质有简化的趋势。有研究表明，在有机碳含量较高的土壤中，外源有机物料释放出的有机碳通过微生物代谢进入土壤水溶性有机碳中；有机肥与秸秆的施入可促进水溶性有机碳中富里酸类物质的分解利用，这与外源有机物料对土壤的激发效应有关。有研究表明，土壤中添加的生物炭可在微生物的作用下部分溶出，生成水溶性有机碳进入土壤系统中，使土壤水溶性有机碳荧光强度增加。本研究中生物炭的施入使土壤WSOC中类腐殖酸物质分子量加大，可能与生物炭的溶出作用有关。各有机物料在不同程度上均有使土壤WSOC中富里酸类物质腐殖化程度降低的作用，使其更易被微生物利用。
土壤中溶解性微生物的代谢产物一般与土壤微生物的代谢产生速率及微生物的数量成正比。李明堂等对黑土区农田的WSOC荧光结构研究结果显示，高产土壤中，WSOC中的溶解性微生物代谢产物占比较高。在本研究中，MNPK处理下的WSOC溶解性微生物代谢产物积分值高于其他处理，溶解性微生物代谢产物的增加，可能与微生物代谢增强有关，说明MNPK处理下的微生物活性增加，促进了土壤有机质的微生物分解，使土壤中微生物代谢产物积累。土壤中蛋白质类物质是土壤微生物的重要碳源，其中色氨酸和酪氨酸是土壤氨基酸中的重要组分。CORVASCE等认为，土壤微生物代谢缓慢会导致土壤中类酪氨酸蛋白质物质、类色氨酸蛋白质物质的积累，土壤对这两种物质的吸附性强也会降低其微生物可利用性，使其在WSOC中含量增加。本研究NPK处理中类酪氨酸蛋白质物质、类色氨酸蛋白质物质高于3个有机物料还田处理，可能是NPK处理下的土壤有机物质来源较少，微生物碳源少，微生物代谢缓慢而导致WSOC中蛋白质类物质积累。
通过PARAFAC分析将土壤WSOC荧光图谱分解为类腐殖酸物质（C1）、类富里酸物质（C2）两个组分，该两个组分与羟基和羧基相关，可用来表征土壤外源有机物质的输入。研究表明，土壤有机物质中的不同组分在一定条件下可以进行分解或合成转化。MNPK处理下，土壤WSOC的类腐殖酸物质组分有向类富里酸物质组分分解转化的趋势。结合三维荧光图谱结果分析，MNPK处理使土壤WSOC中的类富里酸物质、类腐殖酸物质增加，并且使二者结构趋于简单化，有利于WSOC中低分子量荧光组分的形成；同时增加了类腐殖酸物质组分向类富里酸物质组分的转化，提升了土壤供肥能力。
4 结论
本试验条件下，不同有机物料还田提升了黑土有机碳及水溶性有机碳含量，并提升了土壤水溶性有机碳在总有机碳中的占比。本试验区土壤水溶性有机碳以富里酸类物质、腐殖酸类物质为主，腐殖化程度较高、结构较为复杂。有机物料还田下的土壤水溶性有机碳中，类酪氨酸蛋白质物质、类色氨酸蛋白质物质因微生物分解代谢减少。有机肥使土壤水溶性有机碳中富里酸类物质、腐殖酸类物质含量增加、结构简化；使微生物代谢产物增加，土壤微生物活性增强。秸秆、生物炭土壤水溶性有机碳中富里酸类物质结构简单化，生物炭使腐殖酸类物质复杂化。
综上所述，3种有机物料还田措施均有提升黑土区土壤水溶性有机碳含量的作用；可通过增加微生物代谢产物含量、简化富里酸类物质结构增强土壤的供肥能力；通过提升腐殖酸类物质含量增强土壤的保肥能力，其中以配施有机肥效果最佳。
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The Response of Water-soluble Organic Carbon to Organic Material Applications in Black Soil
WEI Dan 1,4, CAI ShanShan 2,3, LI Yan1,4, JIN Liang2, WANG Wei2, LI YuMei2, BAI Yang4, HU Yu 4
(1Institute of Plant Nutrition and Resources,Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Beijing 100097; 2Institute of Soil Fertilizer and Environmental Resources, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086; 3College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866; 4College of Resources and Environment, Northeast Agricultural University, Harbin 150030)
Abstract: 【Objective】The change characteristics of water soluble organic carbon (WSOC) content and components in black soil with the addition of different organic materials were explored to provide a scientific basis for soil fertility improvement methods in black soil area.【Method】This study was based on experimental plots of returning organic materials to the field in Keshan County, Heilongjiang Province, and the experiment has lasted for seven years. The content and structure of WSOC treated with organic fertilizer, biochar, straw and single fertilizer treatment (CK) was analyzed by routine determination and fluorescence analysis.【Result】Compared with the single application of chemical fertilizer, the content of soil water-soluble organic carbon increased by 9.65%-20.30% and soil organic carbon increased by 6.63%-14.86% under the application of organic materials. The contents of tyrosine-like protein and tryptophan-like protein in WSOC decreased under the treatment of organic materials. The application of organic fertilizer increased the contents of metabolites of soluble microorganisms in WSOC, increased the contents of fulvic acid and humic acid in WSOC, and simplified their structures. Straw and biochar simplified the structure of fulvic acids and biochar complicates the structure of humic acids in WSOC.【Conclusion】Organic fertilizer, biochar and straw improved the content of soil water-soluble organic carbon, enhanced the decomposition and metabolism of soil microorganisms, increased the content and simplified the structure of fulvic acid component in water-soluble organic carbon. Organic fertilizer had the best effect.
Key words:black soil; organic material; water-soluble organic carbon; three-dimensional fluorescence spectra; PARAFAC analysis
收稿日期：2019-07-02；
接受日期：2019-10-17
基金项目：国家自然科学基金（41771284）、国家现代农业产业技术体系（CARS-04-01A）、国家重点研发计划（2018YFD0201001）、北京市农林科学院科技创新能力建设专项（KJCX20190408）
联系方式：魏丹，E-mail：wd2087@163.com
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：width=42.5,height=42.5
（责任编辑 李云霞）
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