光照强度对樱桃谷肉鸭c-fos、生物钟基因表达及褪黑激素的...
光照强度对樱桃谷肉鸭c-fos、生物钟基因表达及褪黑激素的影响崔家杰，谢强，翟双双，龚涛，朱勇文，杨琳，王文策
（华南农业大学动物科学学院/广东省动物营养调控重点实验室，岭南现代农业科学与技术广东省实验室，广州510642）
摘要：【目的】研究持续黑暗下给予樱桃谷肉鸭不同强度的瞬时光照，对下丘脑、间脑、垂体和中脑中c-fos基因及相关生物钟基因的表达及血浆和肝脏中褪黑激素含量的影响。【方法】选用144 只健康且体重接近的1 日龄樱桃谷肉鸭饲养至21 日龄，22 日龄时随机分为2 组，每组6 个重复，持续黑暗7 d，期间自由采食和饮水，分别采用10 Lx 和80 Lx 的LED 白光刺激1.5 h，暗适应1.5 h 后立即从每个重复选取1 只接近平均体重的肉鸭，检测下丘脑、间脑、垂体和中脑c-fos 和生物钟基因的表达量，检测血浆和肝脏褪黑激素含量。【结果】10 Lx 组的下丘脑和中脑c-fos 表达量显著高于80 Lx 光照组（P＜0.05），间脑中c-fos 的表达量显著低于80 Lx 光照组（P＜0.05），两组垂体组织中c-fos 表达无显著影响（P＞0.05）。与80 Lx 组相比，10 Lx 组下丘脑生物钟基因Bmal1、Bmal2、Clock 和Per2 表达量均显著提高（P＜0.05），Cry1 表达量也有提高的趋势。10 Lx 组间脑Bmal1的表达量显著提高（P＜0.05），Bmal2、Clock、Per2 和Cry1 的表达量无显著差异（P＞0.05）。10 Lx 组中脑Clock和Per2 的表达量显著高于80 Lx 组（P＜0.05），两组Bmal1、Bmal2 和Cry1 表达无显著影响（P＞0.05）。不同强度的瞬时光照对垂体中生物钟基因的表达无显著影响（P＞0.05）。与80 Lx 组相比，10 Lx 组肉鸭血浆中褪黑激素含量显著降低（P＜0.05），肝脏中褪黑激素含量显著升高（P＜0.05）。【结论】持续黑暗下，短暂高光强刺激可抑制下丘脑和中脑c-fos 的表达，而提高间脑c-fos 基因的表达，同时减弱了肉鸭下丘脑和间脑生物钟基因表达的振幅。
关键词：樱桃谷肉鸭; 持续黑暗; 光照强度; c-fos; 生物钟
0 引言
【研究意义】家禽生产受多种环境因素的影响，光照强度是影响家禽生产的重要环境因素之一，光照强度过高或过低均不利于家禽生产。家禽的生物钟系统受光信息影响，光刺激也会引起中枢系统相关调控基因的表达变化。探究不同强度的光刺激下家禽脑部区域调节基因和生物钟基因的表达变化对阐明光照强度在生物钟系统发挥的作用有着重要的理论指导意义。【前人研究进展】从蓝藻到哺乳动物，其昼夜节律均受到光照的影响。哺乳动物昼夜节律的主钟在下丘脑的视交叉上核，只有视网膜可以接收光信息；禽类视网膜、松果体和深脑部均可接收光信息，因此其昼夜节律的主钟更为复杂，包括视交叉上核、视网膜和松果体。禽类生物钟的功能渗透机体的多项生理学过程，包括：繁殖、睡眠、活动、免疫等。光照周期、光照强度和光波长的改变均影响家禽行为和生物钟基因的表达：与12L﹕12D 相比，24L白光光照降低了肉鸡间脑、肝脏和骨骼肌生物钟基因Bmal1 和Per3 的表达；在鹌鹑上的研究发现，光照刺激可以诱导松果体Per2 水平的提高；也有研究表明，绿光提高肉鸡下丘脑生物钟基因Bmal1、Clock和Cry1 表达，红光降低生物钟基因表达。c-fos 是一种原癌基因，又是即早表达基因，c-fos 和其编码的蛋白在正常情况下参与神经细胞的生长、发育、分化等过程。c-fos 作为中枢神经系统的标志物，正常情况下表达水平较低，应激时可快速短暂表达，具有信号传递的特征。光照刺激也引起c-fos 基因的表达，对鼹鼠光照刺激后，在视网膜和脑中检测到有c-fos的表达，下丘脑中c-fos 只有在光刺激引起动物行为节律发生相移时表达才会增加，说明c-fos 在光照引起昼夜节律的相移中发挥重要作用。【本研究切入点】家禽的生物钟机制更加复杂，鸭对光信息环境的反应可能较母鸡更敏感。由于c-fos 在正常情况下，表达水平较低，只有在受到信号刺激的情况下才会迅速短暂表达；同时，生物钟基因在家禽昼夜节律以及各种光照条件下研究较多，但瞬时光刺激如何影响其表达鲜有研究。【拟解决的关键问题】以樱桃谷肉鸭为研究对象，采用持续7 d黑暗条件下短暂光信号刺激模式，以便更好地使光信号形成较强刺激，激发c-fos 的瞬时表达，从而研究瞬时光刺激对下丘脑、垂体、间脑和中脑的c-fos基因及生物钟基因表达的影响，探究不同强度的瞬时光刺激下家禽脑部区域调节基因和生物钟基因的表达变化，为进一步阐明肉鸭对光信号响应的变化规律提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 试验动物与试验设计
选用144 只健康且体重接近的1 日龄樱桃谷肉鸭在同一饲养管理下饲养至21 日龄，22 日龄时随机分为2 个处理，每个处理6 个重复，每个重复12 只鸭。光照制度方法参照文献中c-fos 研究方法。持续黑暗（1 Lx）条件下饲养，黑暗时肉鸭的饲养设施及料槽水槽的摆放与1—21d 时一致，黑暗7 d 后，采用10 和80 Lx 白光刺激1.5 h，LED 灯为光源，刺激后暗适应1.5 h。
1.2 饲养管理
鸭舍为全封闭、面积一致的2 个独立房间，每个房间6 栏，网上饲养。舍内温度最后控制在26℃左右，湿度50%—70%。水线统一喂水，人工喂料，试验期间鸭子自由采食和饮水，饲粮组成为玉米59.50%，去皮豆粕28.70%，低筋面粉4.00%，米糠粕2.00%，石粉1.30%，大豆油0.50%，预混料4.00%，营养水平为代谢能12.14 MJ·kg-1，粗蛋白质20.00%。本试验于2017年8 月至2017 年9 月在华南农业大学动物科学学院伟南楼环控舱进行。
1.3 样品采集及指标测定
1.3.1 样品采集 肉鸭暗适应1.5 h 后，每个重复选取1 只接近平均体重的肉鸭：颈静脉采血，每只肉鸭采血约10 mL，置肝素钠抗凝管中，斜面静置30 min，3 000 r/min 离心10 min 吸取上清分装，-80℃冰箱保存待测。采集肝脏迅速放入液氮，-80℃冰箱保存，测定激素含量。采集下丘脑、垂体、间脑和中脑迅速放入液氮，-80℃冰箱保存，测定c-fos 及生物钟相关基因表达。
3) 由激光测径仪测量标准件在该位置处轮廓最低点到测径仪激光帷幕下边界的距离，激光二维扫描传感器测量标准件轮廓最高点到二维扫描传感器的距离；
轮回是叶芝神秘主义思想下不可不提的主题。“轮回”本是古印度婆罗门教主要教义之一，认为死亡仅仅是走向下一个轮回，后被佛教沿袭并为其注入新的教义。“谓众生于六道中犹如车轮旋转，循环不已，流转无穷。众生由惑业之因贪、嗔、痴三毒招感三界、六道的生死轮转，恰如车轮的回转，永无止尽。故称轮回。”而该论文所指的“轮回”是叶芝在自己所处的时代大背景下，基于创作主题和目的的需要，对“轮回”的本意建构了自己的理解，使之能够充分地表达他的思想。
不同光照强度对肉鸭生物钟基因Per2 mRNA 相对表达量的影响如表6 所示，10 Lx 组下丘脑中Per2表达量极显著高于80 Lx 组（P＜0.01），中脑的Per2表达显著高于80 Lx 组（P＜0.05）。垂体和间脑中两 组的Per2 表达量差异不显著（P＞0.05）。
1.3.4 引物合成和荧光定量PCR 根据GenBank 公布的绿头鸭基因的mRNA 序列设计引物序列（表1），由上海生工生物合成。采用SYBR Green (TOYOBO，日本)染料法在ABI7500（Applied Bio-systems, Foster City，美国）上进行RT-qPCR，PCR 反应条件为95℃预变性30 s ，然后95℃变性5 s ，退火温度60℃ 34 s 共40 个循环。用β-actin 作为内参，采用2-ΔΔCT 法对荧光定量PCR 结果进行数据处理。
作为导师不仅要向学生传授高深的专业知识，为他们指点迷津，更要以自己高尚的品德和人格魅力感染教育学生，做到既教书又要育人,引导学生树立良好的学术道德，帮助学生养成恪守学术规范的习惯。引导研究生“遵循学术道德为荣，违背学术道德为耻”的道德荣辱观，把良好的学术道德行为融入到研究生指导的每一个环节中。在研究生学年论文、课程论文、学位论文中认真审核把关，让研究生知道什么是应该遵循的学术道德和学术规范。
不同光照强度对肉鸭生物钟基因Cry1 mRNA 相对表达量的影响如表5 所示，10 Lx 组下丘脑中Cry1 mRNA 相对表达量有高于80 Lx 组的趋势（P=0.06）， 两组肉鸭间脑、垂体和中脑中Cry1 mRNA 的相对表达量差异不显著（P＞0.05）。
1.4 数据统计分析
不同光照强度对肉鸭生物钟基因Clock mRNA 相 对表达量的影响如表5 所示，10 Lx 组的肉鸭下丘脑和中脑Clock 基因表达量显著高于80 Lx 组（P＜0.05）。两组垂体和间脑中Clock 表达量差异不显著（P＞0.05）。
表1 引物信息
Table 1 Primer information
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2 结果
2.1 不同强度光照对樱桃谷肉鸭脑组织c-fos mRNA相对表达量的影响
由图1 所示，与80 Lx 组相比，10 Lx 组肉鸭下丘脑中c-fos mRNA 的相对表达量极显著提高（P＜0.01），中脑c-fos 表达量显著提高（P＜0.05）。而间脑中10 Lx 组c-fos 的表达量极显著降低（P＜0.01），两组垂体中c-fos mRNA 相对表达量无显著差异（P＞0.05）。
2.2 不同强度光照对樱桃谷肉鸭不同脑组织生物钟基因mRNA 相对表达量的影响
由表2 所示，不同光照强度处理极显著影响了下丘脑和间脑中Bmal1 mRNA 相对表达量，10 Lx 组的Bmal1 mRNA 的表达量极显著的高于80 Lx 组（P＜0.01）。两组垂体和中脑中的Bmal1 mRNA 表达量无显著差异（P＞0.05）。
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图1 不同光照强度处理对肉鸭c-fos mRNA 相对表达量的影响
Fig. 1 Effects of different light intensity treatments on the relative expression of c-fos mRNA in meat ducks
**表示差异极显著，P＜0.01, *表示差异显著，P＜0.05
Columns with ** mean extremely significant difference（P＜0.01）, Columns with * mean significant difference（P＜0.05）. The same as below
表2 不同光照强度处理对肉鸭Bmal1 mRNA 相对表达量的影响
Table 2 Effects of different light intensity treatments on the relative expression of Bmal1 mRNA in meat ducks
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同行数据标有不同大写字母者表示差异极显著（P＜0.01），标有不同小写字母者表示差异显著（P＜0.05），未标字母者差异不显著（P＞0.05）。下同 In the same row, values with different capital letter mean extremely significant difference (P＜0.01), values with different small letter mean significant difference(P＜0.05), with no letter mean no significant difference(P＞0.05).The same as below
不同光照强度对肉鸭生物钟基因Bmal2 mRNA相对表达量的影响如表3 所示，10 Lx 组下丘脑中Bmal2的 mRNA相对表达量极显著高于80 Lx组（P＜0.01），间脑中10 Lx 组Bmal2 的表达有高于80 Lx 组的趋势（P=0.08）。垂体和中脑组织中两组的Bmal2 表达量差异不显著（P＞0.05）。
表3 不同光照强度处理对肉鸭Bmal2 mRNA 相对表达量的影响
Table 3 Effects of different light intensity treatments on the relative expression of Bmal2 mRNA in meat ducks
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本研究中涉及光照和性别两种因素。首先按照双因素采用SAS 9.2 软件来统计分析，发现性别对基因表达无显著影响，且光照和性别之间无交互作用，因此我们进一步采用单因素方差分析（one-way ANOVA）的方法统计分析，P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著。
与其它化学消毒剂相比，SAEW杀菌后可完全还原成无毒、无残留的普通水，排放后对环境无任何污染，对生态环境不会造成危害，而且制作成本低廉，使用简单方便。但单独使用SAEW，药浴后蒸发较快，尤其是冬天可能引起奶牛的干裂和冻裂等缺点。本研究旨在SAEW内加入甘油而研制一种安全、对环境友好、无残留、成本低廉并且能够保护皮肤的新型药浴剂。
第二，观点独特，见解新颖。英语写作中是否有与众不同的想法，区别于大众范文的事例，从新的角度观察事物，选材和角度都具有独到之处，具有创新思维，重视独立思考，不人云亦云，有自己的见解。这样的文章价值较高，教师应该给予充分肯定。
1.3.2 肝脏和血浆中褪黑激素测定 剪取适量肝脏组织，4℃生理盐水中漂洗后，滤纸吸干，称重，加入9 倍体积的4℃生理盐水，匀浆，2 500 r/min 离心，取上清分装。血浆和肝脏匀浆中褪黑激素的含量采用ELISA 试剂盒（南京建成生物科技有限公司）测定，具体方法按照说明书测定。
1.3.3 RNA 提取和反转录 采用 Magen HiPure Universal RNA Mini Kit（美基，广州）试剂盒提取不同脑组织的总RNA。再用Prime Script RT reagent Kit(takara，日本)制备cDNA 样品，按照说明书操作，cDNA 样品置-20℃冰箱中保存备用。
2.3 不同强度光照对樱桃谷肉鸭血浆和肝脏褪黑激素含量的影响
由图2-A 和B 可知，80 Lx 血浆中褪黑激素含量显著高于10Lx 组（P＜0.05），而肝脏中褪黑激素含量显著低于10Lx 组（P＜0.05）。
表4 不同光照强度处理对肉鸭Clock mRNA 相对表达量的影响
Table 4 Effects of different light intensity treatments on the relative expression of Clock mRNA in meat ducks
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表5 不同光照强度处理对肉鸭Cry1 mRNA 相对表达量的影响
Table 5 Effects of different light intensity treatments on the relative expression of Cry1 mRNA in meat ducks
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表6 不同光照强度处理对肉鸭Per2 mRNA 相对表达量的影响
Table 6 Effects of different light intensity treatments on the relative expression of Per2 mRNA in meat ducks
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图2 不同光照强度处理对肉鸭血浆和肝脏褪黑激素含量的影响
Fig. 2 Effects of different light intensity treatments on plasma and liver melatonin content in meat ducks
3 讨论
光照强度是家禽生产中重要环境因素之一，c-fos在应对外界环境的变化调控基因表达方面也发挥着重要的作用，在哺乳动物的中枢生物钟下丘脑视交叉上核中，光照环境的变化引起c-fos 表达的改变，同时也会引起机体昼夜节律的改变。c-fos 是脑对各种刺激包括光照在内引起反应的标志物。研究表明，给予光刺激的火鸡，其下丘脑的c-fos mRNA 表达量显著高于未受到光刺激时的表达。在本研究中，采用持续7 d 黑暗条件后给予1.5 h 光照，这种模式有助于形成对肉鸭的强烈光刺激，从而激发脑部c-fos的迅速表达。本试验中下丘脑和中脑10 Lx 光照组的c-fos mRNA 的相对表达量显著高于80 Lx 光照组，而间脑10 Lx 光照组的c-fos mRNA 表达量极显著低于80 Lx 光照组，说明高光强刺激可抑制下丘脑和中脑c-fos 的表达，而提高间脑c-fos 的表达。对母鸡间脑神经核团c-fos 表达的研究也表明，间脑中的圆核和外侧膝状腹侧核c-fos 在20 和30 Lx 表达最强，10 Lx 组最低，但中脑的c-fos 表达与肉鸭不同，随着光照强度的增加，中脑c-fos 表达也加强。对大鼠的研究发现，在下丘脑视交叉上核，随着光照强度的增加，Fos 免疫阳性细胞的数量也增加。这表明光信号可能通过调控神经细胞中c-fos 的表达传递光信息，且脑组织不同部位对于光刺激的感应也不相同，不同种类动物脑部对于光信息感应的模式并不完全相同。c-fos 的表达还会影响昼夜节律的相位，研究发现，c-fos 是哺乳动物生物钟正常夹带所需要的，光照诱导的大鼠自发性活动的昼夜节律的改变与c-fos 的表达有关，c-fos 被阻断后抑制了光照诱导的相移。
昼夜节律被生物钟基因所调控，包括正调控原件Clock 和Bmal1/2，负调控原件Per1/2/3 和Cry1/2。与哺乳动物不同，禽类不表达Per1，只表达Per2 和Per3。Clock 和Bmal 在细胞质中以二聚体形式结合，并进入细胞核结合在负调控原件启动子的E-box 上，激活Pers 和Crys 基因的表达，细胞质中的Per 和Cry蛋白形成复合物进入细胞核会干扰Clock/Bmal1 二聚体的活性，抑制Pers 和Crys 的表达。Reverbα 和Rorα分别通过激活和抑制Bmal1 进而调控生物钟基因的表达。本试验中，与10 Lx 组相比，80 Lx 瞬时光照显著降低了下丘脑中生物钟正调控基因Bmal1、Bmal2、Clock 和负调控基因Cry1、Per2 的表达量；间脑中Bmal1、Bmal2的表达在80 Lx 光照刺激下也低于10 Lx组。不同光照强度对垂体中上述生物钟基因表达均无显著差异。这表明，瞬时高强度光刺激减弱了肉鸭下丘脑和间脑生物钟基因表达的振幅。研究发现，夜晚时间采用低光照强度处理的小鼠生物钟节律发生了改变，per1 的振幅降低；仓鼠的研究也发现，急剧的光刺激消除了中枢神经系统生物钟基因的节律，且表达量降低了18%—40%。下丘脑是家禽的主钟之一，本研究结果也表明瞬时光刺激对下丘脑的影响最大。另一方面，生物钟基因及表达节律也受到光照制度的影响：持续光照下肉鸡间脑的生物钟基因Bmal1、Cry1、Per3 与12L:12D 相比发生了显著改变，振幅降低。与12L:12D 的光照周期相比，23L:1D 破坏了鸡生物钟基因Clock、Bmal1 和Per2 的昼夜节律。肉鸡的松果体细胞在持续黑暗下提高了正调控生物钟基因Clock 和Bmal2 的表达，而12L:12D 提高了负调控基因Per2 和Per3 的表达。研究表明光照强度会对山雀的行为节律产生影响，与夜间弱光相比，强光下山雀活跃开始时间提前，活跃结束时间推迟。
褪黑激素主要来自松果体合成和释放，在视网膜和肠道嗜铬细胞也可以合成，褪黑激素具有抗氧化和调节免疫等生理功能。AANAT 是褪黑激素合成过程中的限速酶之一，生物钟基因Bmal1/Clock 二聚体可通过结合在AANAT 的E-box 上来调控AANAT 的表达，进而调节褪黑激素的表达。血液中褪黑激素主要来源于松果体，光照可通过“视网膜-下丘脑视交叉上核（SCN）-松果体神经传导途径”以及“视网膜外光感受体途径”来调节松果体褪黑激素的分泌。正常光照条件下，血液中褪黑激素主要受松果体分泌的调节，呈光抑制现象。研究表明，5、10和50 Lx 光照强度下北京油鸡血清中的褪黑激素含量显著低于1 Lx 组。但本研究中80 Lx 组血清褪黑激素水平显著高于10 Lx 组，同时80 Lx 组间脑c-fos 基因的表达也显著高于10 Lx 组，说明在持续黑暗后瞬时光刺激下，松果体褪黑激素的分泌调节模式可能会发生改变：一方面，瞬时光照通过刺激间脑的视交叉神经，激活了间脑部位c-fos 的高表达，进而提高松果体褪黑激素的分泌；另一方面，持续黑暗后短暂瞬时的强光照对肉鸭也可能是一种应激，而应激条件会导致动物体内褪黑激素的释放和升高。研究表明，对大鼠进行慢性束缚应激，其血浆褪黑激素的含量显著升高。同时，处于应激条件下的动物机体肾上腺素的分泌也会增加，有研究发现，肾上腺素的提高促进了鸡松果体细胞褪黑激素的分泌。因此，两方面的作用可能会导致高瞬时光刺激下血清褪黑激素水平升高。组织中的褪黑激素水平受到血液和自身分泌的影响，而且自身分泌的调控方式和松果体是有区别的，肝脏是褪黑激素的主要代谢器官，应激增强的情况下，肝脏对褪黑激素分解代谢的增加可能导致其组织褪黑激素水平的降低。以往研究主要集中于常规条件下光照强度对机体的影响，在后续研究中，不同光照模式，如瞬时光刺激模式，对于调节机体生长发育、褪黑激素分泌以及生物钟节律的作用机制还有待进一步深入研究。
4 结论
持续黑暗下给予樱桃谷肉鸭不同强度（10 Lx:80 Lx）的光刺激，对肉鸭多个脑部区域的c-fos、生物钟基因及血浆和肝脏的褪黑素水平均有显著影响。瞬时强光刺激可下调下丘脑及中脑的c-fos 表达，促进间脑c-fos 表达。在4 个脑部区域中，光强对下丘脑的影响最大。同时，瞬时强光刺激减弱了肉鸭下丘脑和间脑生物钟基因表达的振幅。
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