三种酶对采后‘海沃德’和‘华特’猕猴桃
三种酶对采后‘海沃德’和‘华特’猕猴桃AsA 的氧化作用
封琦1，李朝政1，高贵田1，吴悠1，肖妍1，赵武奇1，雷玉山2
（1 陕西师范大学食品工程与营养科学学院，西安 710119；2 陕西省农村科技开发中心，西安 710054）
摘要：【目的】探究‘海沃德’‘华特’猕猴桃果实采后影响抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）氧化的相关酶活性及基因表达差异，为猕猴桃采后AsA 氧化机制的系统研究，调控果实成熟和衰老进程，并有效保持果实采后品质和延长贮藏时间等研究提供理论依据。【方法】以‘海沃德’‘华特’猕猴桃作为试验材料，测定两个品种的果实在采后25℃贮藏条件下AsA、总抗坏血酸（total ascorbic acid，T-AsA）、脱氢抗坏血酸（dehydroascorbic acid，DHA）、AsA/DHA、与AsA 氧化相关的抗坏血酸氧化酶（ascorbic acd oxidase，AO）、漆酶（Laccase）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）的活性及相关酶基因的表达，研究两个品种猕猴桃果实AsA含量变化与AO、漆酶、APX 活性及相关酶基因的相关性。【结果】‘海沃德’猕猴桃采后初期AsA 含量为86.9 mg/100 g FW，到贮藏末期损失约45%，而‘华特’猕猴桃在采后初期AsA 含量较高，为610 mg/100 g FW，中期上升至峰值886 mg/100 g FW，末期下降到778 mg/100 g FW，高于采后第1 天AsA 含量，整体呈上升趋势；两个品种DHA含量在整个贮藏期整体呈下降趋势，但‘海沃德’猕猴桃中DHA 含量始终低于‘华特’；T-AsA 含量与其AsA 含量的变化趋势接近；整个贮藏后期，‘海沃德’猕猴桃的AsA/DHA 比值远低于‘华特’。AO 活性与两个品种猕猴桃AsA 含量呈显著负相关性，漆酶活性与两个品种猕猴桃AsA 含量呈负相关性；从采后第8 天开始，‘华特’的AO 活性低于‘海沃德’，在整个贮藏期，‘华特’猕猴桃中漆酶活性都低于‘海沃德’；且在采后第11 天，‘华特’中AO 和漆酶活性均达到最低值，‘海沃德’中漆酶活性在采后第16 天达到最高值；APX 对AsA 含量的影响较小，其活性与AsA 变化无显著相关性。AO 基因家族中的3 个基因中，Achn020161 是AsA 氧化分解的关键基因，而Achn191341 和Achn316521 与AsA 的氧化无显著相关性；漆酶基因家族中的3 个基因中，Achn007661、Achn191341对AsA 含量变化有一定影响，而Achn163871 与AsA 的氧化无显著相关性；APX 基因家族中的Achn123021、Achn082241、Achn187071 对AsA 含量的变化有一定影响，但均不是氧化AsA 的关键基因。【结论】AsA/DHA 的高比值对AsA 的积累起重要作用，AO 是氧化AsA 的关键酶，漆酶对AsA 氧化有一定作用，APX 不是主要氧化AsA 的酶，推测AO 基因家族中的Achn020161 是氧化AsA 的关键基因，而漆酶基因家族中的Achn007661 与Achn19134 对氧化AsA 有一定作用。
关键词：猕猴桃；‘华特’；‘海沃德’；抗坏血酸；酶活性；基因表达
0 引言
【研究意义】抗坏血酸（ascorbic acid，AsA），又称维生素C（Vc），是广泛存在于植物中的抗氧化剂主要清除细胞内的氧化物和超氧化物，或作为某些还原酶的辅因子参与还原反应。AsA 还参与植物的衰老调控。另一方面，AsA 是人体不可缺少但无法自身合成，必须从食物中获取的营养物质。猕猴桃（Actinidia）果实AsA 含量高于大多数水果，享有“Vc之王”的美称。深入了解猕猴桃果实采后AsA 的变化规律及影响因素，AsA 在成熟与衰老中的作用及其机制，对调控果实成熟和衰老进程并有效保持果实采后品质和延长贮藏时间具有重要意义。【前人研究进展】植物中AsA 的含量由合成途径和循环再生途径综合调节。AsA 主要合成途径为L-半乳糖途径，循环再生途径主要为抗坏血酸-谷胱甘肽循环（AsA-GSH），是氧化态AsA 再生的主要途径。在该途径中，AsA 通过APX或AO，将AsA 氧化成单脱氢抗坏血酸（monodehydroascorbate，MDHA），同时AsA 作为电子供体在APX 清除H2O2的过程中被氧化成MDHA，部分MDHA 发生非酶促歧化反应后得到DHA，生成的DHA 借助AsA-GSH 循环还原成最初的AsA，APX 对AsA 的积累有调节作用。MA 等研究表明不同品种猕猴桃果实AsA 含量存在较大差异。原玉林等研究发现猕猴桃果实生长发育过程中AsA 含量受合成和再生的共同调控，不同基因型猕猴桃果实中AsA 和AsA 相关氧化物水平存在明显的多样性，并且 L-半乳糖 1,4-内酯脱氢酶（GalLDH）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）的活性均与AsA 含量存在极显著相关性，并且MDHAR 活性与AsA 含量和APX 都有较高的相关性。目前，植物AsA 合成与氧化的研究主要集中在AsA 生物合成途径方面，对果蔬采后AsA 分解氧化及其机理鲜有报道。薛敏等研究发现‘海沃德’猕猴桃果实在贮藏期AsA 氧化率高达61.5%，另有研究表明，‘华特’猕猴桃在采后AsA 含量始终保持较高水平，在贮藏末期AsA的氧化率只有10%。【本研究切入点】笔者课题组前期采用转录组测序技术，发现‘海沃德’猕猴桃采后AsA 氧化通路中AO、漆酶基因家族中存在表达差异，并用实时荧光定量PCR 进行了验证，为从基因水平研究猕猴桃采后AsA 分解氧化奠定了基础。【拟解决的关键问题】本研究以AsA 含量较低、采后流失严重的‘海沃德’猕猴桃和AsA 含量高、采后流失少的‘华特’猕猴桃作为试验材料，通过研究两个品种的猕猴桃在采后25℃贮藏条件下AsA 含量和相关酶活性及其基因表达的变化差异，以期探明影响猕猴桃AsA 含量变化的相关机制，为今后通过基因层面维持和减少猕猴桃果实采后AsA 的损失提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
‘华特’猕猴桃、‘海沃德’猕猴桃，于2017 年10 月21 号采于周至县虎峰村的陕西佰瑞猕猴桃研究院有限公司实验基地。
挑选果型大小均匀、完整、无病虫害的果实于采后当天运回实验室。‘华特’猕猴桃、‘海沃德’猕猴桃分别按每30 个一组放入已消毒的筐中，框外侧套厚度为0.05 mm 的聚乙烯薄膜袋，让袋口处于自然合拢状态，置于（25±0.5）℃的恒温箱贮藏；每隔5 d 分别选‘华特’猕猴桃30 个和‘海沃德’猕猴桃30 个，取果实果肉、中轴部分将其切碎混合后用液氮速冻，用锡箔纸把样品包好后存放在-80℃冰箱，用于酶活测定及基因表达研究。
1.2 主要仪器与试剂
仪器：pH 计，北京科伟永兴仪器公司；超高速低温离心机，美国Sigma 公司；紫外分光光度计，瑞典福斯公司；全波长酶标仪，美国热电公司；BIO-RAD梯度PCR 仪，北京元业伯乐科技发展有限公司；DYY-4C 型电泳仪，北京市六一仪器厂；格兰仕微波炉，格兰仕微波炉电器有限公司；XW-80A 漩涡混合仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；JY02G 型凝胶成像仪，北京君意东方电泳设备有限公司；NanoDrop 2000 微量快速核酸定量仪，赛默飞尔公司；RF-6000 荧光定量PCR 仪，美国热力公司。
分析纯化学试剂：BP（纯度＞97.0%），磷酸，无水乙醇，标准抗坏血酸，氯化铁（FeCl3），三氯乙酸（TCA）购于天津天力化学试剂有限公司；HiPure Plant RNA Mini Kit，美基生物工程有限公司；Light cycler RNA SYBR green I，Sigma 生物工程有限公司；TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit，北京艾德莱生物科技有限公司；DNA Marker-D、6×Loading Buffer、EDTA、Tris-HCl、琼脂糖，TaKaRa（大连）生物工程有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 T-AsA、AsA、DHA 含量测定 参考赵玉梅等的方法测定。
标准曲线制备：在波长534 nm 处测定吸光值，将AsA 质量设置为横坐标，吸光度值设置为纵坐标，绘制标准曲线，并求线性回归方程。
样品提取：准确称4.0 g 猕猴桃果实样品，放入已加5 mL 50 g·L-1 TCA 溶液的研钵中，冰浴条件下将样品研磨成匀浆后转移到25 mL 的容量瓶，用TCA 溶液冲洗研钵一并转移到容量瓶后定容至刻度，摇匀，冰浴条件下提取10 min 后过滤，将滤液4℃、12 000×g 离心10 min 后收集上清液，即样品提取液。低温备用（‘华特’猕猴桃果实上清液需稀释10 倍备用）。
T-AsA 测定：取1.0 mL 样品提取液，加0.5 mL浓 度 为 60 mmol·L-1 的 DTT- 乙 醇 溶 液， 用Na2HPO4-NaOH 溶液将pH 调至7—8，室温下静置10 min，加0.5 mL 的TCA 溶液。按照制作标准曲线同样的方法进行测定。记录波长534 nm 处的吸光值。重复3 次。
AsA 测定：取1.0 mL 样品提取液，加1.0 mL 的TCA 溶液，按照制作标准曲线同样的方法进行测定。记录波长534 nm 处的吸光值。重复3 次。
DHA 含量等于样品中T-AsA 的含量减去原有的AsA 的含量。
1.3.2 漆酶、AO、APX 活性的测定 漆酶、AO、APX活性测定用Mlbio 酶联免疫分析试剂盒（分别为Plant Laccase ELISA KIT、Plant AO ELISA KIT、Plant APX ELISA KIT）进行测定。
1.3.3 RNA 的提取及质检 裂解液加入浓度为2%（w/v）的PVP-40，其余步骤按照植物RNA 小提试剂盒说明书（HiPure Plant RNA Mini Kit）进行；通过2%的琼脂糖凝胶电泳和微量快速核酸定量仪检测RNA的纯度、浓度。
1.3.4 单链cDNA 的合成 将检测合格的RNA 使用第一链反转录试剂盒（TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit）进行单链cDNA 合成。
1.3.5 荧光定量PCR 用Gene ID 在猕猴桃数据库（http://bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi）检索并获得相应基因的CDS 区，通过Primer 6.0软件，在NCBI 上使用Primer-BLAST 程序将设计的引物进行模拟扩增，通过比对引物扩增的特异性，筛选出特异性最强的荧光定量PCR 引物对，引物见表1。
按照Light cycler RNA SYBR green I 试剂盒操作，以18s RNA 基因为内参基因进行qRT-PCR 反应。反应程序为95℃预变性10 min，90℃变性20 s、61℃退火20 s，40 个循环，熔解曲线温度范围为55—95℃。分析荧光值变化曲线及熔解曲线，用2-△△Ct 法计算两个品种猕猴桃在不同的贮藏天数时AO、漆酶、APX相关基因的相对表达量。
表1 实时荧光定量PCR 分析使用的引物
Table 1 Primers for quantitative real-time PCR
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1.3.6 数据处理 样品进行3 次生物学重复取平均值，运用SPSS 17.0 进行数据统计和差异性分析，取P＜0.05 为显著相关，P＜0.01 为极显著相关，采用Origin 8.6 绘图。
2 结果
2.1 猕猴桃中T-AsA、AsA、DHA 含量
‘海沃德’和‘华特’猕猴桃在采后贮藏期AsA含量存在显著差异（图1-A）。‘海沃德’猕猴桃果实采后第1 天AsA 含量只有‘华特’猕猴桃的14%，在第6—11 天下降速度加快，在第11—21 天下降速度又趋于平缓，在贮藏末期，AsA 含量下降了约45%，损失严重。‘华特’猕猴桃采后贮藏期AsA 含量远高于‘海沃德’猕猴桃，含量呈现先下降后上升的趋势；在第6—11 天AsA 含量急剧上升并达到峰值，从第11 天到贮藏末期，AsA 含量缓慢下降，仍高于采后第1 天AsA 含量，整体呈上升趋势。
‘海沃德’猕猴桃DHA 含量在整个贮藏期都低于‘华特’猕猴桃，两个品种都呈现先下降后上升的变化趋势（图1-B）。‘海沃德’猕猴桃第1—16 天DHA含量处于缓慢下降的趋势，在第16—21 天含量略有回升，在第21 天仍低于初期含量。‘华特’猕猴桃在采后第1—16 天，DHA 含量处于较快下降的趋势且达到最低点，16 d 之后含量开始回升，但仍远低于初期含量。
‘海沃德’和‘华特’猕猴桃的T-AsA 含量与其AsA 含量的变化趋势接近（图1-C）。T-AsA 是AsA与DHA 之和，由于两个品种的猕猴桃果实中AsA 含量远远大于DHA 含量，因此，AsA 含量的变化直接影响T-AsA 的变化趋势。
2.2 猕猴桃AsA/DHA 比值的变化
AsA/DHA 的比值反应果实中AsA 的氧化还原状态和程度。如图2，‘海沃德’和‘华特’猕猴桃在采后初期AsA/DHA 比值接近，‘海沃德’AsA/DHA比值整体缓慢波动呈下降趋势，而‘华特’呈先上升后下降趋势。在贮藏第1—6 天，两个品种的AsA/DHA比值都略微上升，‘华特’上升较快。‘海沃德’在第6—11 天，AsA/DHA 比值呈下降趋势。‘华特’在第6—16 天，比值急剧上升且达到顶峰。在整个贮藏后期，‘海沃德’猕猴桃的AsA/DHA 比值远低于‘华特’。
2.3 猕猴桃AO、漆酶、APX 活性的变化
‘海沃德’猕猴桃在贮藏期AO 活性呈先上升后下降的趋势，且在采后初期低于‘华特’，第1—16天缓慢上升，在第16 天达到最高值后呈下降趋势。‘华特’猕猴桃在贮藏期AO 活性呈现先下降后上升的趋势，第11 天到达最低值，之后活性上升，但仍低于‘海沃德’（图3-A）。
在整个采后贮藏期，‘海沃德’猕猴桃的漆酶活性始终高于‘华特’，但两者变化趋势相似，均表现为先下降后上升再下降的趋势。‘海沃德’猕猴桃漆酶活性在第16 天达到峰值后开始下降，在贮藏末期活性仍高于‘华特’；‘华特’猕猴桃在贮藏第1—11 天时漆酶活性呈快速下降趋势，在第11天达到最低值，贮藏末期的活性只有‘海沃德’的一半（图3-B）。
‘华特’猕猴桃在贮藏期APX 活性始终高于‘海沃德’，且在第1 天远高于‘海沃德’，在采后第1—6天，‘华特’APX 活性迅速下降，在贮藏后期，呈现波动变化趋势，但始终维持在20 U·g-1 FW 以上。‘海沃德’猕猴桃APX 活性在贮藏过程中呈先上升后下降的趋势，在第11 天达到峰值，随后开始下降，贮藏后期活性始终维持在14.5 U·g-1 FW 左右（图3-C）。
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图1 两个品种猕猴桃采后AsA(A)、DHA(B)、T-AsA(C)含量变化
Fig. 1 Changes of AsA (A), DHA (B), and T-AsA (C) contents of two varieties of kiwifruit during storage
“*”和“**”分别表示在两品种差异显著（P＜0.05）和极显著（P＜0.01）水平。下同
“*” and “**” indicate significant differences (P＜0.05) and extremely significant (P＜0.01) between the two varieties. The same as below
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图2 两个品种猕猴桃采后AsA/DHA 比值变化
Fig. 2 Changes of AsA/DHA ratio of two varieties of kiwifruit during storage
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图3 两个品种猕猴桃采后AO（A）、漆酶（B）、APX（C）活性变化
Fig. 3 Changes of AO (A), laccase (B) and APX (C) activities of two varieties of kiwifruit during storage
2.4 猕猴桃AsA 含量与T-AsA、AsA/DHA 及3 个酶的相关性分析
如表2，‘海沃德’猕猴桃中AsA 含量与T-AsA含量呈极显著正相关（P＜0.01），且相关系数为0.999，与AO 活性呈显著负相关性且相关系数为0.910；‘华特’猕猴桃AsA 含量与T-AsA 含量呈极显著正相关（P＜0.01），且相关系数为0.993，与AO 活性呈显著负相关（P＜0.05），且相关系数为0.958。
表2 两个品种猕猴桃AsA 含量与相关指标的相关系数
Table 2 Relation coefficient among AsA content and related indexes of two varieties of kiwifruit
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2.5 两个品种猕猴桃AsA 氧化相关酶基因相对表达量的变化
Achn020161、Achn230551 和Achn316521 是猕猴桃AO 基因家族中的3 个基因。两个品种的猕猴桃采后贮藏期内，Achn020161 的表达变化趋势如图4-A 所示，在‘海沃德’中的表达量在第16 天达到峰值；‘华特’猕猴桃的表达量没有明显变化，且整个贮藏期表达量都明显低于‘海沃德’。从图4-B 可以看出，‘海沃德’猕猴桃Achn230551 处于表达量较低的状态，且始终低于‘华特’；在‘华特’中，其表达量在第16 天达到峰值，第21 天时与最初表达量持平。由图4-C 可知，‘海沃德’猕猴桃Achn316521 表达量在第6 天达到最高表达量后急剧下降，第11 天后开始上升；‘华特’猕猴桃其基因表达量呈波动变化，贮藏末期与最初表达量没有明显差异。
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图4 两个品种猕猴桃AsA 氧化相关酶基因相对表达量的变化
Fig. 4 Changes of expression levels of related enzyme genes of two varieties of kiwifruit during storage
Achn007661、Achn191341、Achn163871 是猕猴桃漆酶基因家族中的3 个基因。由图4-D 可见，在猕猴桃整个采后贮藏期内，‘海沃德’Achn007661 表达量在第16 天最高，‘华特’的表达量一直明显低于‘海沃德’。Achn191341 在‘海沃德’猕猴桃中表达量总体呈上升的趋势，第16 天表达量达到峰值且是第1天的5 倍；‘华特’猕猴桃表达量变化趋势不明显，且第6 天后明显低于‘海沃德’（图4-E）。‘海沃德’猕猴桃Achn163871 表达量在第11 天达到最高；‘华特’猕猴桃其表达量呈持续上升趋势，且贮藏末期高于‘海沃德’（图4-F）。
Achn123021、Achn082241、Achn187071 是猕猴桃APX 基因家族中的3 个基因。‘海沃德’猕猴桃Achn123021 表达量在第16 天达到峰值；‘华特’猕猴桃其表达量在第1—6 天急剧上升，到贮藏末期相比于第1 天上升了约4 倍（图4-G）。‘海沃德’中Achn082241 表达量始终高于‘华特’，第11 天表达量达到峰值；在‘华特’中的表达量变化整体差异不明显（图4-H）。‘海沃德’猕猴桃中Achn187071表达量在第11 天表达量开始急剧上升；‘华特’猕猴桃的表达量在前期稍有下降，但整体变化趋势不明显（图4-I）。
2.6 猕猴桃AsA含量与AsA氧化相关酶基因相对表达量的相关性
如表3 所示，AO 基因家族中，Achn020161 表达量与‘海沃德’‘华特’猕猴桃果实中AsA 含量的变 化具有显著负相关性，相关系数分别为0.922、0.920；Achn191341 表达量与‘海沃德’猕猴桃中的AsA 含量变化正相关，与‘华特’没有显著相关性；Achn316521 表达量与‘海沃德’‘华特’猕猴桃的AsA 含量无显著相关性。
漆酶基因家族中，Achn007661 表达量与‘海沃德’‘华特’猕猴桃贮藏期AsA 含量的变化呈显著负相关，相关系数分别为0.947、0.950；Achn191341 表达量与‘海沃德’猕猴桃中的AsA 含量的变化呈负相关，与‘华特’没有显著相关性；Achn163871 表达量与‘海沃德’‘华特’猕猴桃中AsA 含量的变化没有显著相关性。
APX 基因家族中，Achn123021 表达量与‘海沃德’猕猴桃中AsA 的含量变化呈负相关性，与‘华特’没有显著相关性；Achn082241 表达量与‘海沃德’‘华特’猕猴桃中的 AsA 含量变化无显著相关性；Achn187071 表达量与‘海沃德’猕猴桃中AsA 含量呈负相关，与‘华特’无显著相关性。
表3 两个品种猕猴桃AsA 含量与相关基因表达量的相关系数
Table 3 Relation coefficient among AsA content and genes expression of two varieties of kiwifruit
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3 讨论
3.1 AsA/DHA 对猕猴桃采后AsA 氧化的影响
猕猴桃以富含高AsA 而著名，但在贮藏后期，不同品种的猕猴桃果实AsA 的损失情况有显著差异。‘华特’猕猴桃具有较高的AsA 含量且在采后贮藏期流失较少。而‘海沃德’猕猴桃与‘华特’相比，AsA 在采后贮藏期损失很大。DHA 是AsA 中的一种氧化产物，AsA 很容易在酶的作用下氧化，同时在脱氢抗坏血酸还原酶的作用下，DHA 还可以转化为AsA 以维持较高水平。本试验发现，‘华特’猕猴桃AsA 含量是‘海沃德’的8—10 倍，与原玉林等的研究结果一致；造成AsA 含量差异的主要因素为AsA合成和循环再生机制，‘华特’贮藏前期出现AsA 含量的上升现象，说明果实中的AsA 合成和再生的协作速率大于氧化速率。有研究表明，‘华特’贮藏前期DHAR 活性上升，后期受到反馈抑制活性下降，因此，DHAR 以DHA 为底物会促进果实贮藏前期AsA含量的积累；‘海沃德’猕猴桃刚好与其相反，说明‘海沃德’AsA 氧化速度大于再生合成的速度。‘华特’猕猴桃DHA 含量远远高于‘海沃德’，两者变化趋势一致，DHA 除自身氧化外还参与AsA 再生循环。由于猕猴桃中AsA 含量远高于DHA 含量，所以，‘华特’和‘海沃德’的T-AsA 含量变化趋势与AsA基本保持一致，受DHA 变化影响很小。AsA/DHA 的比值反映的是果实中AsA 的氧化还原状态，比值越大，说明抗氧化能力越高，越有利于维持果实中T-AsA 的含量。AsA/DHA 的高比值可以阻止AsA的降解，‘华特’在贮藏期内AsA 含量整体上升而DHA 下降，保持着较高的AsA 再生能力，AsA 再生酶可能对其后期可以保持较高的抗氧化能力也起到一定作用。‘华特’猕猴桃和‘海沃德’猕猴桃在贮藏过程中AsA/DHA 的比值存在显著差异，较高含量的DHA 还原以及AsA/DHA 的高比值对AsA 的积累起到重要作用。
3.2 3 种酶对猕猴桃采后AsA 氧化的影响
通过AsA-GSH 循环，植物有清除活性氧（ROS）的能力，同时，AsA 会被氧化为单脱氢抗坏血酸（MDAH），这种能力在酶的催化下会增强。前人研究表明，在AsA-GSH 循环中，AO 在有氧情况下，APX 提供电子供体是AsA 分解氧化的主要途径，植物APX 表达受生物和非生物胁迫以及植物发育期间的调节。漆酶是一种含铜多酚氧化酶，作为催化剂可清除ROS，也可与抗坏血酸、胺类等物质反应。本研究发现，AO 活性与两个品种猕猴桃AsA 含量呈显著负相关性；漆酶活性与两个品种猕猴桃AsA 含量呈负相关性，与笔者课题组前期基于转录组测序分析发现漆酶可能是‘海沃德’采后氧化AsA 酶的结论一致。猕猴桃AO 和漆酶活性在‘华特’采后第11 天达到最低值，在‘海沃德’采后第16 天达到最高值，而在采后第11 天‘华特’猕猴桃的AsA 含量上升到峰值，DHA 的含量接近最低值，推测这是导致‘华特’猕猴桃AsA 含量在贮藏后期始终维持较高含量而‘海沃德’AsA 含量呈下降趋势的主要原因。进一步比较AO 与漆酶的活力，发现AO 是漆酶活力的3—4 倍，据此推测，AO 是导致两个品种猕猴桃采后氧化的关键酶，漆酶对猕猴桃采后AsA 的氧化有一定的作用。而APX的活力变化趋势在两个品种之间差异较大，在采收当天，‘华特’猕猴桃是‘海沃德’的2 倍多，在采后第7—21 天，‘华特’始终高于‘海沃德’；在采后第1—6 天，‘华特’APX 活力剧增，与其采后1—6 天的AsA 升高及DHA 降低的变化吻合，但采后第7—21 天，APX 活力变化与AsA 及DHA变化吻合度较低。而‘海沃德’APX 活力与其采后AsA 含量的相关系数仅为0.253，因此，APX 不是两个品种氧化AsA 的主要酶，这与钟雨在‘华特’猕猴桃中的研究结果一致。植物中AsA-GSH循环途径需要多个同工酶共同参与，这3 种酶对于ROS 的清除应该都有一定的作用，但具体如何参与ASA 的氧化并不清楚，还需要进一步探究验证。
3.3 相关基因对猕猴桃采后AsA 氧化的影响
AO 基因家族中，Achn020161 在两个品种猕猴桃中的表达变化趋势与其对应的酶活性变化趋势相近，与其AsA 含量呈显著负相关，推测该基因是导致两个品种猕猴桃AsA 氧化的关键基因之一。Achn230551、Achn316521 表达量与AsA 含量无显著相关性，推断这两个基因可能并不参与调控AO 氧化AsA 的过程。
漆酶基因家族的Achn007661 与Achn191341 在‘海沃德’猕猴桃中表达量显著高于‘华特’；‘华特’猕猴桃Achn007661 与Achn191341 在采后平稳下降，与其对应品种的漆酶活性变化趋势基本一致，相关分析表明Achn007661 与Achn19134 与两个品种AsA 变化分别为极显著相关与负相关，推测Achn007661 与Achn19134 对氧化AsA 有一定影响。Achn163871 表达量在‘海沃德’猕猴桃中为先上升后下降的趋势，第11 天表达量达到最高，与漆酶活力变化趋势一致；但在‘华特’猕猴桃中的表达量持续上升，且贮藏末期高于‘海沃 德’，与漆酶活力变化趋势相反，表明Achn163871与两个品种猕猴桃氧化 AsA 无相关性，也暗示Achn163871 可能存在转录后调控，其机理有待进一步研究。
APX 基因家族的Achn123021 在‘海沃德’猕猴桃中表达量与APX 活力的变化趋势一致，与AsA 含量呈负相关性；但在‘华特’中采后第1—6 天APX活力下降一半，其表达量反而上升，采后第11 天，Achn123021 表达量是采收当天的4.5 倍，与AsA 含量上升的表型相反。在两个品种中，Achn082241、Achn187071 表达量变化与 APX 活力变化趋势相近，但两个基因的表达量在‘海沃德’中显著高于‘华特’，与‘华特’APX 活性整体高于‘海沃德’的结果相反。其原因可能是由于本研究中APX基因家族Achn082241、Achn187071 的CDS 序列来自中华猕猴桃‘红阳’基因组数据库，而本研究所用的材料是美味猕猴桃‘海沃德’与毛花猕猴桃‘华特’，与中华猕猴桃‘红阳’存在较大的遗传差异，APX 基因编码区的序列也可能存在一定的多态性。另一方面，较多的研究表明APX 在植物生长发育和逆境胁迫响应等生理过程中都发挥着非常重要的作用，它催化H2O2 依赖的L-抗坏血酸发生氧化作用，对AsA 表现出高度的专一性。本研究不论从酶学层面，还是基因层面均表明APX与两个品种采后AsA 氧化相关性低，其原因有待进一步研究。
4 结论
较高含量的脱氢抗坏血酸还原以及AsA/DHA 的高比值对抗坏血酸（AsA）的积累起重要作用。抗坏血酸氧化酶（AO）是氧化AsA 的关键酶，漆酶对氧化AsA 有一定作用，抗坏血酸过氧化物酶（APX）不是主要氧化AsA 的酶。推测AO 基因家族中的基因Achn020161 是导致AO 氧化AsA 的关键基因，而Achn191341 和Achn316521 则与AsA 氧化相关性不明显；漆酶基因家族中的基因Achn007661 对AsA 氧化有一定作用，Achn191341、Achn163871 与AsA 的氧化没有显著相关性；APX 基因家族中的3 个基因Achn123021、Achn082241、Achn187071 不是氧化AsA的关键基因。
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Influence of Three Enzymes on Oxidation of Ascorbic Acid in Postharvest 'Hayward' and 'Huate' Kiwifruit
FENG Qi1, LI ChaoZheng1, GAO GuiTian1, WU You1, XIAO Yan1, ZHAO WuQi1, LEI YuShan2
(1College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119; 2Shaanxi Rural Science and Technology Development Center, Xi’an 710054)
Abstract:【Objective】This study explored the differences in activities of enzymes and their gene expressions related with oxidation of ascorbic acid (AsA) in postharvest Hayward and Huate kiwifruit to provide a theoretical basis for the oxidation mechanism of AsA in postharvest kiwifruit to regulate fruit ripening and senescence, maintain postharvest quality and extend storage life.【Method】 Hayward and Huate kiwifruit were harvested, and total ascorbic acid (T-AsA), dehydroascorbic acid (DHA), AsA/DHA, and AsA content were measured under the storage conditions of 25℃. Enzyme activity of ascorbic acid oxidase (AO), laccase, ascorbate peroxidase (APX) and gene expression related with AsA oxidation were measured. The relationships between AsA content and the enzyme activity of AO, laccase, APX and gene expression were investigated in the two varieties of kiwifruit.【Result】The content of AsA in Hayward was 86.9 mg/100 g FW at the beginning of harvest, and the loss was about 45% at the end of storage. The content of AsA in Huate was higher at the beginning of harvest (610 mg/100 g FW), and it rose to 886 mg/100 g FW, reached its peak value during the storage, and dropped to 778 mg/100 g FW at the end, which was higher than that on the first day after harvest. The DHA content of the two varieties showed a downward trend throughout the whole storage period, but the DHA content of Hayward was lower than that of Huate. The T-AsA content and AsA content change trend was similar. In the later stage of storage, the AsA/DHA ratio of Hayward was much lower than that of Huate. AO activity was significantly negatively correlated with AsA content of two varieties of kiwifruit, and laccase activity was negatively correlated with AsA content. From the 8th day after harvest, the AO activity of Huate was lower than Hayward, and the laccase activity was lower than Hayward during the whole storage period of Huate kiwifruit. The activity of AO and laccase got the lowest value on the 11th day after harvest; laccase activity reached its highest value in Hayward on the 16th day after harvest. APX had little effect on AsA content, and its activity had no significant correlation with AsA content. Among the three genes in the AO gene family, Achn020161 was a key gene for the oxidative decomposition of AsA, while Achn191341 and Achn316521 had no significant correlation with the oxidation of AsA. Among the three genes in the laccase gene family, Achn007661 and Achn191341 had certain effect on the change of AsA content, while Achn163871 had no significant correlation with the oxidation of AsA. Achn123021, Achn082241 and Achn187071 in the APX gene family had certain effect on the change of AsA content, but they were not key genes for oxidative degradation of AsA.【Conclusion】The high ratio of AsA/DHA played an important role in the accumulation of AsA. AO was the key enzyme on the oxidation of AsA, laccase had certain effect, and APX was not a main enzyme in oxidation of AsA. It’s speculated that Achn020161 in the AO gene family was the key gene for oxidizing AsA, and Achn007661 and Achn19134 in the laccase gene family had certain effects on the oxidation of AsA.
Key words: kiwifruit; Huate; Hayward; ascorbic acid; enzyme activity; gene expression
收稿日期：2019-07-09；
接受日期：2019-11-30
基金项目：陕西省科技厅特色产业链项目（2018TSCXLNY-01-05）
联系方式：封琦，E-mail：fengqi19970101@snnu.edu.cn。
通信作者高贵田，E-mail：gaoguitian2006@snnu.edu.cn
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
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（责任编辑 赵伶俐）
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