实时PCR 技术在羊亚科肉类鉴定中的应用
实时PCR 技术在羊亚科肉类鉴定中的应用尚 柯，梁恒兴，张 彪，段庆梓，王 巍，张 玉
（成都市食品药品检验研究院，四川 成都 610045）
摘 要：根据线粒体cyt b基因的种间差异，建立羊亚科、绵羊、山羊肉类的实时荧光聚合酶链式反应检测技术，对方法进行系统的优化与完善，并进行特异性、灵敏度与扩增效率、检出限、试剂一致性分析与适用性考察，同时邀请5 家国内权威机构对方法进行复核。结果表明，方法的重复性好、适用性广，可用于不同基质的肉制品检测，扩增效率达95%以上，用于羊肉制品的动物源性成分检测准确率达100%，适于推广使用。
关键词：物种鉴定；羊亚科；方法考察；实际应用
羊肉作为一种优良的畜肉，属于高蛋白、低脂肪、低胆固醇类营养保健食品，有着悠久的食用历史。我国的肉类生产以猪肉为主，随着生活水平的提高，猪肉产量的比例逐年下降，而牛、羊等高价格肉类产量逐年上升，在2015年羊肉产量达到了肉类产量的7%。目前，我国的羊肉市场以绵羊、山羊为主，同时部分地区，如贵州、云南等地也生产与食用麻羊等。羊肉中的赖氨酸、精氨酸、组氨酸含量明显高于猪、牛、鸡等肉类，且胆固醇含量仅有猪、牛的1/3甚至1/4，同时羊肉易于消化吸收，深受消费者喜爱。
近年来，政府及消费者对肉及肉制品的产品质量和食用安全越来越重视，但不法商贩在肉制品生产（加工）中进行肉质掺伪、造假的现象仍屡有发生，这一掺假造假现象在羊肉制品中表现较为突出。掺假的方式越来越多，形式越来越复杂。目前，肉制品的掺假主要表现为原料肉掺假、组织替换等，鸭肉冒充羊肉事件、欧洲马肉门事件、巴西肉类丑闻、阿胶用猪皮制作、欧洲鱼肉事件层出不穷，“挂羊头卖狗肉”的肉类掺假掺杂事件近年来屡被曝光。这些食品问题严重地侵害了消费者的合法利益，给肉制品食用安全带来潜在危害，同时也对民族宗教信仰带来较大的风险。
DNA杂交、免疫扩散和等电点聚焦等方法曾经被用于肉类品种鉴定，但这些方法大都存在成本高、基质单一、对检测对象要求高、工作量大、无法检测深加工肉类等缺点。随着分子生物学技术的发展，目前从基因角度检测物种的真实属性已经成为主流检测技术，规避了性状检测、蛋白检测、化学成分检测所存在的诸多局限。Nataliav等利用鸡尾酒引物实现了物种的通用扩增，采用条形码技术鉴定肉类的成分；Guan Feng等采用八重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法，可区分山羊、绵羊、鹿、水牛、牛、牦牛、猪和骆驼；冯海永等采用七重PCR检测方法，可区分猪、牛、绵羊、山羊、鸡、马和牦牛7 种动物；杨冬燕等对国外现有方法进行优化与完善，建立了猪、马、牛、鸭多重实时PCR（real-time PCR）检测体系，用于检测羊肉制品掺假情况；熊蕊等采用限制性片段长度多态性PCR技术，可从牛羊肉中检测猪源性成分。但这些方法均存在一定的局限性，普通PCR方法及DNA条形码技术由于操作繁琐，准确度与灵敏度不高，对样本及实验设备要求高，易造成污染等问题，不适于检测技术发展的需要；目前已建立的实时荧光检测技术大多仅针对某一种羊肉进行检测，无法确定羊肉的具体种类。
为提高肉制品中羊源性成分检测方法的可操作性，建立建全羊肉具体种类的检测方法，本实验针对山羊、绵羊、麻羊3 种食用羊的基因序列，分别建立绵羊、山羊、羊亚科的专属性real-time PCR检测方法，对羊肉制品中的羊源性成分进行检测，以期为监管部门提供技术手段与数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本实验所用样品包括确定基原的对照物种20 种，以及市场采购样品20 种。样品采自养殖厂、研究所、农贸市场、电商、超市等。所有样品通过合成引物进行线粒体基因测序验证，保证样品的真实性。样品的具体信息见表1。
表1 样品信息
Table 1 Detailed information about the samples tested in this study
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续表1
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动物基因组提取试剂盒 上海捷瑞生物工程有限公司；实时荧光PCR扩增试剂盒：Bio-Rad SsoAdvancedTM Universal Probes Supermix、Tiangen SuperReal PreMix(Probe)、TransStart® Probe qPCR SuperMix、TaKaRa Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)。
1.2 仪器与设备
Applied Biosystems Veriti II PCR仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；CFX96 Touch实时荧光PCR仪、PowerPac电泳仪 美国Bio-Rad公司；GelDoc-It凝胶成像仪 美国UVP公司；Centrifuge 5427 R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；ME2002E电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；MK3涡旋振荡器 德国IKA公司；P330核酸蛋白定量仪 德国Implen公司；MM400行星球磨仪 德国Retsch公司；Milli-Q Academic实验室超纯水仪美国Millipore公司；Thermo-Shaker BG-100干式恒温器杭州瑞诚仪器有限公司；SW-CJ-FD型单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 引物及探针
将GenBank数据库中山羊、绵羊以及其他18 种动物的cyt b基因序列运用生物软件进行比对分析，选择山羊（EU130780.1）、绵羊（KP228916.1）、羊亚科（MF503655.1）的基因序列进行引物和探针的设计。引物及探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。探针荧光基因为FAM，淬灭基团为BHQ1，最终确定的引物组具体序列见表2。
表2 引物信息
Table 2 Sequences of PRC primers and probes
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1.3.2 real-time PCR方法建立
按照试剂盒说明书对样品进行基因组提取，用核酸蛋白定量仪确定DNA提取的效率与纯度，进行OD260 nm/OD280 nm值测定，测得值均在1.7～2.0之间，表明可用于PCR实验。real-time PCR包括10 µL 2×SsoFast Advanced Supermix real-time PCR预混液、DNA模板、可变引物和探针量以及去离子水，其体积为20 µL。通过改变引物浓度、探针浓度和退火温度进行方法的筛选与建立。引物终浓度分别为25、50、100 nmol/L和150 nmol/L，探针终浓度分别为5、12.5、25 nmol/L和50 nmol/L，退火温度分别为56、58、60、62 ℃和64 ℃。
1.3.3 特异性实验
以20 种基原动物基因组DNA（JY-1～JY-20）为模板，用建立的real-time PCR方法进行扩增，评价特异性。阳性、阴性和空白对照在实验中同步进行，进行质量控制。
1.3.4 灵敏度实验
对模板DNA进行倍比稀释，质量浓度设定为10-4、10-3、10-2、10-1、100、101 ng/μL。作为反应模板进行扩增反应，确定模板DNA质量浓度范围与Ct值线性关系，同时根据原理，参考文献建立扩增效率计算公式：扩增效率/%=（lg稀释倍数/lg2）/|标曲斜率|×100，并建立本方法的判定原则。
1.3.5 检出限实验
分别将山羊、绵羊肉样品以1%、0.1%、0.01%三个水平掺入鸡肉样品中，充分混匀后，提取基因组DNA，作为检测模板，分别使用山羊、绵羊、羊亚科检测体系进行肉样水平检出限检测。
1.3.6 试剂一致性考察
考察不同公司实时荧光预混液对检测结果的一致性，分别进行常见品牌的实时荧光预混液比对实验，确定不同试剂盒对检测结果的影响。检测体系仅替换real-time PCR预混液，其他条件均一致。
1.3.7 加工肉制品Ct值变化
确定肉制品影响DNA质量的主要是杀菌环节。目前，国内肉制品企业的杀菌方式主要为高温杀菌、巴氏杀菌、辐照杀菌等。据此，采用对DNA影响最大的高温杀菌方式对样品进行处理，确定杀菌工艺对DNA质量的影响，以及本方法是否适用于加工后的肉制品。联系肉制品生产企业获取加工前绵羊、山羊生肉原料及最终成品肉制品，提取DNA后，依照建立的方法分别进行检测。
1.3.8 方法适用性考察
UPLC-Q-TOF-MS法分析苗药黑骨藤提取物中的化学成分…………………………………………………… 覃小丽等（21）：2949
为了保证方法的一致性和可重复性，起草组制定验证工作方案，邀请了山东省食品药品检验研究院、中国检验检疫科学研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、河北省食品检验研究院、国家副食品质量监督检验中心5 家检测机构进行方法验证，由验证单位独立完成从DNA提取到结果判定的全过程验证实验。
1.4 数据统计及图表绘制
使用Bio-Rad CFX Manager 3.0.1224.1015软件制作real-time PCR结果图谱，使用Microsoft Excel 2007软件对real-time PCR数据进行统计分析，并绘制相关的数据分析图表。
2 结果与分析
2.1 引物探针的设计筛选
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图1 山羊目标序列比对分析
Fig. 1 Target sequence alignment analysis of Capra
根据引物设计原则，利用DNAStar软件设计山羊、绵羊、羊亚科通用的引物探针，并对各物种的引物及探针进行序列高级结构分析比对，以确保其高度的特异性，防止出现二聚体、茎环及发卡等影响检测效率的结构。具体信息见图1～3。
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图2 绵羊目标序列比对分析
Fig. 2 Target sequence alignment analysis of Ovis
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图3 羊亚科目标序列比对分析
Fig. 3 Target sequence alignment analysis of Caprinae
2.2 real-time PCR方法建立
表3 real-time PCR体系筛选与建立（Ct值）
Table 3 Screening and establishment of real-time fluorescence PCR
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分别进行引物浓度筛选、探针浓度筛选和退火温度筛选，具体信息见表3。最终确定的real-time PCR方法为：PCR预混液（2×）10 μL，5’端、3’端引物（10 μmol/L）各0.2 μL，探针（10 μmol/L）0.1 μL，DNA模板（1～100 ng/μL）1 μL，用无菌双蒸水补足20 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min；35 个循环（95 ℃变性15 s，58 ℃退火及延伸1 min，收集荧光）。
2.3 特异性结果
特异性实验结果显示，相应动物源性成分有典型扩增曲线且Ct值均小于25，其他动物源性成分均未检出，实验结果理想，均能达到检测要求，其中羊亚科源性检测可同时检测绵羊、山羊、麻羊。具体检测情况见图4。
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图4 特异性检测图谱
Fig. 4 Specificity evaluation
2.4 灵敏度结果
在Ct值小于或者等于30时，灵敏度均可达10-3 ng/μL，满足多种检测要求，在线性范围内均有良好的线性关系，山羊、绵羊、羊亚科检测方法的R2分别为0.999、0.997、0.999，扩增效率分别为99.37%、92.48%、96.32%。具体检测情况见图5。
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图5 灵敏度实验图谱
Fig. 5 Sensitivity evaluation
2.5 检出限结果
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图6 检出限实验图谱
Fig. 6 Detection limit evaluation
图6 及表4显示，在鸡肉中掺入1%、0.1%的山羊、绵羊肉时，本方法检测Ct值均小于30。而在0.01%的掺入比例实验时，相应Ct值接近甚至超过30 个循环，对其判定可能会出现偏差。根据以上验证结果，本方法的检出限为0.1%。
表4 检出限检测结果
Table 4 Detection limit validation
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注：*.混合比例。
2.6 试剂一致性分析
选择Bio-Rad SsoAdvancedTM Universal Probes Supermix、Tiangen SuperReal PreMix(Probe)、TransStart®Probe qPCR SuperMix、TaKaRa Premix Ex TaqTM(Probe qPCR) 4 种real-time PCR预混液对方法进行重复性考察，结果显示，不同试剂表现出一致的检测结果，表明本方法的试剂一致性较好，常用实时荧光预混液均适用于本方法的检测。具体情况见图7及表5。
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图7 试剂一致性实验图谱
Fig. 7 Reagent consistency evaluation
表5 试剂一致性结果（Ct值）
Table 5 Reagent consistency validation
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2.7 加工肉制品Ct值变化情况分析
如图8所示，原料肉与最终产品检测结果存在一定的差异，但加工后的成品与原料肉相比Ct值差异在3以内，且Ct值均在30以下，有典型扩增曲线，不影响结果的判断。因此，本方法适用于生鲜肉及肉制品的检测。
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图8 生鲜肉与加工肉制品real-time PCR结果比较
Fig. 8 Comparison of real-time PCR results of raw meat and processed meat
2.8 方法适用性分析
山羊、绵羊、羊亚科源性成分检测的10 个样品3 个浓度水平Ct值均小于30，且具有典型扩增曲线，适用性实验结果符合预期，满足检测要求，见图9及表6。
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图9 适用性实验图谱
Fig. 9 Applicability evaluation
表6 适用性检测结果（Ct值）
Table 6 Applicability validation
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2.9 方法验证
由成都市食品药品检验研究院提供验证样品580 个，其中特异性验证样品100 个，适用性验证样品300 个，灵敏度验证样品90 个，检出限验证样品90 个；由验证单位独立完成从DNA提取到结果判定的全过程验证试验。5 家验证单位均获得了满意的验证结果，验证汇总结果见表7。
表7 验证结果汇总
Table 7 Summary of validation results from five domestic authoritative institutions
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3 结 论
鉴于肉类掺假现象的出现，基于DNA的肉类鉴定方法已成为食品真实性鉴定的首选方法。本研究开发并验证了羊亚科3 种real-time PCR检测普通肉制品的方法，分别为羊亚科通用检测方法、山羊检测方法及绵羊检测方法。这些方法特异性强、灵敏度高、适用性强，可用于羊肉类原料及加工肉的鉴别，以及肉制品中羊源性成分的检测。3 种方法的反应体系及检测步骤一致，可在一次real-time PCR实验中同步完成3 种方法的检测。结果表明，该方法是一种高效、灵敏、特异、高实用性的羊亚科专属性鉴别方法。
本方法以real-time PCR探针法为基础，从基因水平对肉类DNA进行检测。real-time PCR技术利用荧光基团的淬灭与激发，在反应过程中可以通过荧光信号反映DNA扩增情况，在实验过程中对反应情况进行实时监测，扩增反应结束，直接获得检测结果。整个过程闭管操作，不需要进行酶切、染色、电泳、测序等传统PCR方法所需的繁琐步骤，缩短了检测时间，提高了检测效率，减少了后续实验的污染以及染色试剂对操作人员造成的潜在危害。
本方法的成功依赖于以下3 个方面：适当的靶基因位点、专属性极强的引物和探针以及DNA真实性考察。首先，根据在动物物种中高度保守且母体遗传的cyt b基因，并对20 个物种进行了目的基因序列比对，以确保该方法的有效性。其次，用DNAStar v7.1.0.44软件设计了针对目标物种特定DNA序列的引物和探针，并对高级结构进行分析，以确保引物与探针不存在茎环及发夹等影响扩增效率的结构。通过猪、牛、绵羊、鸡、鸭、鹅等20 个物种的特异性鉴定，验证了所有引物和探针的特异性，保证了方法的特异性。最后，本实验所用的动物肉类样品和PCR产物均经过测序验证，以确保样品的真实性，整个方法依据分子生物学标准流程进行设计、优化与验证。
本研究的目的是建立一种快速、高通量的real-time PCR方法，以鉴定市场上销售的肉制品的羊源性成分。因此，在建立了羊亚科3 种检测方法后，本实验邀请了5 家中国权威的检测机构对该方法进行系统、科学地验证。在验证之前，实验设计了方法验证的内容和步骤，包括方法的特异性、适用性、灵敏度、扩增效率和检出限。联合验证的结果表明，该方法的特异性满足预期，仅能扩增目标物种，不能扩增其他非目标物种；方法的扩增效率达90%以上，检出限均可达0.1%；此外，对真实的市售产品进行检测，检测准确率达100%，方法适用性满足检测要求。鉴于这些方法是基于real-time PCR原理进行开发，希望增加定量检测方法，为肉制品的真实性鉴定和掺假提供了更加准确和科学的检测方法，为监管部门提供技术标准与检测依据。
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Application of Real-Time PCR Assay in the Identification of Caprinae Meat
SHANG Ke, LIANG Hengxing, ZHANG Biao, DUAN Qingzi, WANG Wei, ZHANG Yu
(Chengdu Institute for Food and Drug Control, Chengdu 610045, China)
Abstract: A real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) method for the identification of meat from Caprinae(including goats and sheep) was established and optimized based on the inter-species difference of cytochrome b (cyt b)gene. We evaluated the specificity, sensitivity, amplification efficiency, detection limit, reagent consistency and applicability of this method, and we invited five domestic authoritative institutions to validate it. The results showed that this method could be suitable for detecting Caprinae meat products with different substrates because of its good repeatability, wide applicability, high amplification efficiency (＞ 95%) and accuracy (100%).
Keywords: species identification; Caprinae; method investigation; practical application
收稿日期：2019-02-19
基金项目：成都市科技惠民应用示范项目（2015-HM02-00099-SF）
第一作者简介：尚柯（1985—）（ORCID: 0000-0002-9457-5141），男，工程师，硕士，研究方向为分子生物学。E-mail: 9740991@qq.com
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190219-104
中图分类号：TS251.7
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2020）12-0318-08
引文格式：尚柯, 梁恒兴, 张彪, 等. 实时PCR技术在羊亚科肉类鉴定中的应用. 食品科学, 2020, 41(12): 318-325. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190219-104. http://www.spkx.net.cn
SHANG Ke, LIANG Hengxing, ZHANG Biao, et al. Application of real-time PCR assay in the identification of Caprinae meat. Food Science, 2020, 41(12): 318-325. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190219-104.http://www.spkx.net.cn
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