驴乳粉蛋白的特性、结构与组成分析
驴乳粉蛋白的特性、结构与组成分析樊雨梅1,2，帖 航3，解 晓1,2，史传超1,2，周广运1,2，苏 宁3,*，廖 峰1,2,*
（1.国家胶类中药工程技术研究中心，山东 东阿 252201；2.东阿阿胶股份有限公司，山东 东阿 252201；3.中国检验检疫科学研究院，北京 100176）
摘 要：采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、圆二色谱和基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法研究德州驴乳粉蛋白质的性质、结构和组成，为德州驴乳的深层次开发提供依据。结果表明，驴乳粉蛋白质量分数为16.10%，等电点均匀分布在4.5～6.5之间，分子质量主要集中在10～20 kDa和53～78 kDa的乳清蛋白区域，以及28～36 kDa酪蛋白区域。通过与马科蛋白图库进行对比，检索出386 种可识别的蛋白，其中有139 种蛋白首次在驴乳中发现，为揭示驴乳的生理功效提供理论基础。
关键词：驴乳粉；基本特性；结构表征；蛋白质组分
目前，驴乳以其营养价值和潜在的健康效益逐渐引起人们的关注。与其他原料乳相比，驴乳最重要的特征是其化学成分与母乳类似。因此，在牛乳蛋白过敏的情况下，与其他反刍动物乳相比，驴乳是良好的婴儿营养替代品。此外，驴乳的生理保健和疾病预防也引发了医学界的关注，流行病学和机制研究已初步证明了驴乳具有一定的减轻氧化应激、抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、改善免疫功能等作用。
国内外研究主要集中在探究驴乳的组成、物化和营养性质以及功效，其中2011年在分子水平研究驴乳蛋白质组成取得了重要的进展。此后，关于驴乳蛋白质组学的报道大量增加。研究表明，不同品种、同一品种中的个体动物之间的乳蛋白质含量和相对蛋白质组成不同。虽然，目前关于驴乳的研究较多，但是德州驴作为我国主要品种之一，蛋白质组成的研究较少。因此，本实验以德州驴乳粉为研究对象，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、二维电泳、圆二色谱和基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization-time of fight-mass spectrometry，MALDITOF/TOF-MS）等技术手段揭示德州驴乳粉蛋白质的性质、结构和组成，以期为德州驴乳的深层次开发提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
冻干驴乳粉 东阿阿胶股份有限公司。
乙腈、甲醇、甲酸（均为质谱纯） 百灵威科技有限公司；牛血清白蛋白、尿素、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、CHAPS 北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；Tris-base 美国阿拉丁公司；苯甲基磺酰氟 上海碧云天生物技术有限公司；Bio-Lyte 3-10 buffer、Ready Strip IPG Strips、Modified Trypsin（Sequencing Grade，Promega）SDS-PAGE Marker、毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis，CGE）Marker美国Bio-Rad公司；HiLoad 16/60 Superdex 200 pg制备级分子筛分离柱 美国通用电气公司。
1.2 仪器与设备
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MALDI-TOF/TOFMS、Multiskan GO多功能酶标仪 美国Thermo公司；Mini Protean 3 Cell SDS-PAGE仪、Protean IEF cell双向凝胶电泳（2-dimensional gel electrophoresis，2-DE）仪美国Bio-Rad公司；P/ACETM MDQ CGE仪 美国贝克曼库尔特有限公司；AKTA蛋白纯化系统 美国通用电气公司；MOS 450圆二色谱仪 法国Bio Logic公司。
1.3 方法
1.3.1 蛋白质特性的测定
1.3.1.1 BCA法测定蛋白质含量
按照BCA蛋白浓度测定试剂盒的方法检测驴乳粉的蛋白质含量。
1.3.1.2 SDS-PAGE测定蛋白质分子质量范围
根据刘晓等的方法稍作修改。10%驴乳粉溶液稀释10 倍后，加入等量含DTT的2×Loading Buffer缓冲液，充分混匀，沸水浴5 min。浓缩胶5%，分离胶12%。上样量10 μL，将凝胶扫描电子图谱保存，电泳所用的Marker分子质量范围为10～250 kDa。
1.3.1.3 CGE分析蛋白质相对丰度
参考文献的方法，略有改动。毛细管规格为内径100 μm，总长31 cm，有效长度20 cm，柱体温度40 ℃，电动进样，进样电压-10 kV，进样时间1 s，分离电压-12.4 kV，紫外检测波长280 nm，样品贮存温度30 ℃。
1.3.1.4 2-DE分析蛋白质等电点范围
根据陈静廷等的方法，稍作修改。200 μL 10%驴乳粉溶液与800 μL的水化液混匀。取200 μL加载到电泳池，等电聚焦程序见表1。
表1 7 cm胶条的等电聚焦程序
Table 1 IEF program for 7 cm latex
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等电聚焦后立即进行胶条平衡。平衡分两步，每次15 min，分别使用5 mL含1% DTT平衡液和5 mL含2.5%碘乙酰胺平衡液。将平衡好的胶条置于12%聚丙烯酰胺凝胶上，并用1%的琼脂糖固定胶条，进行第二向电泳。凝胶用考马斯亮蓝染色后，以脱色液脱去背景颜色，使用凝胶成像设备扫描成电子图片保存。
1.3.2 蛋白质二级结构的表征
1.3.2.1 蛋白质的分离纯化
酪蛋白的纯化：称取一定量的驴乳粉，加入2.5 倍质量的50～55 ℃水充分溶解乳粉，将配制好的醋酸-醋酸钠溶液缓慢加入驴乳溶液中，直至淡黄色块状胶体完全沉淀为止。在加入缓冲液过程中，使用pH计控制缓冲液的pH值范围在4.6～4.8之间。3 000 r/min离心15 min，上清液为乳清蛋白粗品，沉淀为粗品酪蛋白。将粗品酪蛋白用无水乙醇沉淀3 次，每次洗涤后3 000 r/min离心15 min，最终得到白色洁净的酪蛋白，将酪蛋白移至表面皿中进行减压真空干燥。
乳清蛋白纯化：乳粉乳清蛋白质粗品经0.22 μm滤膜过滤，备用。利用分子筛纯化驴乳粉乳清蛋白。具体条件如下：层析柱条件：HiLoad 16/60 Superdex 200 pg制备级分子筛纯化层析柱，内径16 mm，柱床高度600 mm，柱床体积120 mL，分离范围10～600 kDa；AKTA纯化系统运行参数：流速恒定2 mL/min，室温环境纯化（20～25 ℃），最大压力0.3 MPa，缓冲体系pH 8.0（含100 mmol/L氯化钠的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液），上样量3 mL，检测器包含紫外检测器（280、254、215 nm）、pH检测器、电导率检测器和温度检测器。
1.3.2.2 圆二色谱法检测蛋白质二级结构
参考文献的方法，略有改动。0.5 mg/mL左右的蛋白质样品经过0.45 μm微孔滤膜处理后进行远紫外圆二色谱扫描，超纯水作为空白。测定条件：0.1 cm石英比色杯，温度25 ℃，光径0.1 cm，带宽1 nm，扫描范围250～190 nm，扫描速率0.5 nm/s，用平均残基摩尔椭圆率[θ]表示圆二色谱光谱数据，单位为（deg·cm2）/dmol，通过在线引擎采用SELCON3程序估算蛋白质的二级结构（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml），匹配方式为Closest matching solution with all proteins。
1.3.3 蛋白质组成分析
驴奶粉经SDS-PAGE分离后，将3 个明显的蛋白区域分成3 份切开，转移至EP管中。蛋白质的脱色酶切方法参考文献。浓缩液与基质混合后，采用MALDI-TOF/TOF-MS分析。利用Mascot软件的SwissPort数据库进行搜索。检索分类（Taxonomy）为Equus caballus，Mascot检索P值小于0.05和Mascot得分大于41 分的结果被认为鉴定成功。
1.4 数据处理
以3 次重复实验每次同时做平行实验所得的数据为结果，用平均值表示。
2 结果与分析
2.1 蛋白质的基本性质
2.1.1 蛋白质含量的分析
利用BCA法测定驴乳粉蛋白质质量分数为16.10%，折合驴乳蛋白质质量分数约为1.61%，这与相关研究结果一致。
2.1.2 蛋白质分子质量的分布
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图1 驴乳粉SDS-PAGE图
Fig. 1 SDS-PAGE profile of donkey milk powder
如图1所示，分子质量主要分布在3 个区域，10～20 kDa小分子质量的乳清蛋白区域，28～36 kDa的酪蛋白区域，53～78 kDa的大分子乳清蛋白区域。通过分子标记物条带和相关报道的驴乳蛋白质迁移模式，识别出以下蛋白：乳铁蛋白（分子质量约为75 kDa）、血清白蛋白（分子质量约为67 kDa）、免疫球蛋白（分子质量约为60 kDa）、酪蛋白（分子质量约为28～36 kDa）、β-乳球蛋白（分子质量约为18 kDa）、溶菌酶（分子质量约为15 kDa）、α-乳清蛋白（分子质量约为14 kDa）。
2.1.3 蛋白质丰度
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图2 驴乳粉GCE结果
Fig. 2 GCE spectra of donkey milk powder
由图2可以看出，驴乳粉蛋白质主要集中在酪蛋白区域和小分子质量乳清蛋白区域，且酪蛋白丰度低于小分子质量乳清蛋白丰度，这与Salimei、张岩春、Malacarne等的报道一致。人乳乳清蛋白约占总蛋白50%，而牛乳的乳清蛋白不足20%，由此可见，与牛乳相比，驴乳更接近于人乳，更易被消化吸收。酪蛋白与乳清蛋白的比值是牛乳致敏能力的重要影响因素，Cunsolo等通过综合分析驴乳的相关临床研究发现，低酪蛋白与乳清蛋白比率是驴乳低致敏性的主要因素之一。
2.1.4 蛋白质等电点
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图3 驴乳粉2-DE图
Fig. 3 2-DE profile of donkey milk powder
如图3所示，水平方向为第一固相pH值梯度等电聚焦，垂直向为第二向垂直板SDS-PAGE。驴乳粉蛋白的等电点均匀分布在4.5～6.5之间，与人体pH值酸碱环境相近。驴乳蛋白质条带清晰单一，结构完整，与Vincenzetti等的报道驴乳蛋白质二维电泳结果一致。A区域分子质量为28～36 kDa，pI在4.5～6之间；B区域分子质量约为19 kDa，pI在5～5.5之间；C区域分子质量为7～19 kDa，pI在5～6之间；D区域分子质量约为19 kDa，pI在6.5左右。根据驴乳常见蛋白分子质量的大小和pI可推断，A区域蛋白为酪蛋白，B区域蛋白为β-乳球蛋白，C区域蛋白为α-乳清蛋白。
2.2 蛋白质结构的表征
2.2.1 蛋白质的分离纯化
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图4 驴乳粉分子筛纯化洗脱图
Fig. 4 Molecular sieve gel chromatographic patterns of donkey milk powder
从图4可以看出，组分1和组分2之间并无明显280 nm吸收峰，且电泳图谱中也并未发现明显酪蛋白条带，由此可见，经第1步粗分离后，酪蛋白和乳清蛋白已基本分离。第2步经分子筛纯化，由图4可以找到3 个典型性蛋白峰，非常明显3 个典型性蛋白质峰对应3 个不同分子质量的区域的蛋白质，分别为大分子质量乳清蛋白和2 个不同分子质量的小分子质量乳清蛋白。由图4可知，在驴乳粉纯化蛋白质峰前，有一个215 nm吸收峰，该处峰可能为糖类分子及其他大分子杂质。经冻干称质量计算驴乳粉蛋白质综合回收率在90%以上。
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图5 纯化驴乳粉SDS-PAGE图
Fig. 5 SDS-PAGE patterns of puri fied donkey milk powder
由图5可以看出，经等电点沉淀分离酪蛋白，再经分子筛纯化乳清蛋白，电泳条带非常清晰，可得到较为单一的蛋白质组分。由此可见醋酸-醋酸钠等电点沉淀配合Superdex分子筛纯化乳粉中的蛋白质方法较为理想，为后期靶向研究蛋白功能，开发功能性蛋白分子提供理论依据。
2.2.2 蛋白质二级结构分析
表2 各纯化蛋白质组分的二级结构分析
Table 2 Secondary structures of purified protein components from donkey mild powder
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如表2所示，驴乳粉中的酪蛋白二级结构主要以β-折叠、无规卷曲和β-转角为主；大分子质量乳清蛋白α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲比例较为均衡；小分子质量乳清蛋白仍主要以β-折叠、无规卷曲和β-转角为主。这与预期结果一致，Aspre等报道驴乳主要富含脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。而脯氨酸具有环状结构有利于β-转角的形成，缬氨酸和异亮氨酸易形成β-折叠。刘微等也报道人乳β-酪蛋白单体二级结构以β-折叠、无规卷曲和β-转角为主，推测驴乳酪蛋白二级结构与母乳类似，可能是驴乳低致敏性的原因之一。
2.2.3 蛋白质组成的分析
表3 驴乳粉常见蛋白质分析结果
Table 3 Analysis of common protein components in donkey milk
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利用SDS-PAGE结合MALDI-TOF/TOF-MS的方法，共鉴定出386 种蛋白质，显著高于Cunsolo等报道的106 种蛋白、古丽巴哈尔·卡吾力等报道的283 种蛋白、张新浩等报道的216 个乳清蛋白。鉴定出的386 种蛋白质，其中有72 种蛋白为未命名蛋白，剩余314 种已命名蛋白。在314 种已命名蛋白质中，101 种成分是常见的驴乳蛋白，包括87 种免疫λ轻链可变区片段，剩余的14 种蛋白主要是酪蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、溶菌酶、血清白蛋白，见表3。除常见驴乳蛋白外，有139 种（约占总识别蛋白的36.01%）蛋白首次在驴乳中鉴定出的蛋白，见表4。
根据驴乳蛋白2-DE图谱，酪蛋白部分存在一些蛋白斑点，经MALDI-TOF/TOF-MS鉴定后，发现驴乳蛋白存在3 种酪蛋白：一种是β-酪蛋白（27 kDa，pI 4.91）和2 种α-S2-酪蛋白（27.2 kDa，pI 4.72；25.4 kDa，pI 4.8）。α-S2-酪蛋白的异质性主要取决于磷酸化程度和RNA错误剪接事件产生的内部缺失异构体。研究表明，分子质量25.4 kDa的蛋白与α-S2-酪蛋白的区别在于Asn176～Gln180五肽的缺失。驴乳α-乳清蛋白A和α-乳清蛋白B/C（14.2 kDa）的发现与Bertino等报道一致，α-乳清蛋白（16.3 kDa），是乳清蛋白（Met 90）的氧化甲硫氨酸形式，这是由于体内氧化应激导致的α-乳清蛋白同种型。驴乳β-乳球蛋白存在2 种不同的形式，β-乳球蛋白I和β-乳球蛋白II（同分异构体II B、C、D），但是在本次鉴别中只发现了3 种同分异构体，可能与所使用的鉴别方法的低敏感性有关。在驴乳中，已鉴定出2 个溶菌酶的变体，分子质量分别为14.6 kDa和16.8 kDa，分子质量的差异主要与49、52、61位氨基酸残基不同有关。值得注意的是，此次鉴别出的驴乳血清白蛋白含有607个氨基酸，分子质量为68.3～68.6 kDa，与Cunsolo等报道的驴乳血清白蛋白含有583 个氨基酸，分子质量为65.584 kDa略有不同，但是与鲜马奶血清白蛋白含有的氨基酸及分子质量（607 个氨基酸，68.3 kDa）一致。
表4 驴乳粉首次鉴定蛋白组分分析
Table 4 Analysis of donkey milk powder protein components first identified in this study
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续表4
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续表4
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续表4
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3 结 论
本实验主要研究德州驴乳粉蛋白质的性质、结构和组成。研究表明，驴乳粉蛋白质质量分数为16.10%，等电点均匀分布在4.5～6.5之间，分子质量主要集中在10～20 kDa小分子质量的乳清蛋白区域、28～36 kDa的酪蛋白区域和53～78 kDa的大分子乳清蛋白区域。驴乳粉酪蛋白和小分子质量乳清蛋白二级结构主要以β-折叠、无规卷曲和β-转角为主，大分子质量乳清蛋白二级结构较为均衡。通过与马科蛋白图库进行对比，检索出386 种可识别的蛋白，其中有139 种蛋白首次在驴乳中发现，为揭示驴乳的生理功效提供理论基础。
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Analysis of Characteristics, Structure and Composition of Protein in Donkey Milk Powder
FAN Yumei1,2, TIE Hang3, XIE Xiao1,2, SHI Chuanchao1,2, ZHOU Guangyun1,2, SU Ning3,*, LIAO Feng1,2,*
(1. National Engineering Research Center for Gelatin-based Traditional Chinese Medicine, Dong’e 252201, China;2. Dong’e Ejiao Co. Ltd., Dong’e 252201, China;3. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China)
Abstract: Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), circular dichroism spectroscopy and matrix assisted laser desorption ionization time-of-f l ight mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF-MS) were used to reveal the properties, structure and composition of milk powder protein from Dezhou donkeys, aiming to provide a basis for the deep exploitation of Dezhou donkey milk. The results showed that the protein content of the milk powder was 16.10%, the isoelectric point was evenly distributed between 4.5 and 6.5, and the molecular mass was mainly concentrated in the range of 10-20 and 53-78 kDa for whey protein, and 28-36 kDa for casein. By matching against the equine protein library, 386 proteins were identified, 139 of which were first discovered in donkey milk. This study provides a theoretical basis for revealing the physiological effects of donkey milk.
Keywords: donkey milk powder; basic properties; structural characterization; protein fractions
收稿日期：2019-07-11
基金项目：山东省泰山产业领军人才传统产业创新类项目（TSCY20170233）
第一作者简介：樊雨梅（1992—）（ORCID: 0000-0001-5238-1106），女，硕士，研究方向为天然功效成分。E-mail: bzguo9@163.com
*通信作者简介：
苏宁（1979—）（ORCID: 0000-0002-2031-7772），男，副研究员，硕士，研究方向为毒理学安全评价。E-mail: sun@caiq.org.cn
廖峰（1981—）（ORCID: 0000-0001-6251-6772），男，正高级工程师，博士，研究方向为天然产物功效研究与应用。E-mail: liaofengcd@163.com
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190711-162
中图分类号：TS252.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2020）12-0221-07
引文格式：樊雨梅, 帖航, 解晓, 等. 驴乳粉蛋白的特性、结构与组成分析. 食品科学, 2020, 41(12): 221-227. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190711-162. http://www.spkx.net.cn
FAN Yumei, TIE Hang, XIE Xiao, et al. Analysis of characteristics, structure and composition of protein in donkey milk powder. Food Science, 2020, 41(12): 221-227. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190711-162. http://www.spkx.net.cn
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