凡纳滨对虾蛋白酶对酱油渣蛋白质的降解作用
凡纳滨对虾蛋白酶对酱油渣蛋白质的降解作用凡纳滨对虾蛋白酶对酱油渣蛋白质的降解作用肖盼盼1，章 骞2，翁 凌1,2，张凌晶1,2，杨 爽1，刘光明1,2，曹敏杰1,2,*（1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.水产品深加工技术国家地方联合工程研究中心，福建 厦门 361021）摘 要：从凡纳滨对虾加工副产物虾头中提取蛋白酶，并对其所含酶种类及NaCl质量分数对酶活力的影响进行研究。对虾粗蛋白酶主要由胰蛋白酶、组织蛋白酶及氨肽酶构成。在25% NaCl质量分数下，胰蛋白酶、组织蛋白酶B+L、组织蛋白酶K保留约10%的相对酶活力，苯丙氨酸氨肽酶的相对酶活力为30%，而高NaCl质量分数（25%）对丙氨酸氨肽酶和甲硫氨酸氨肽酶具有激活作用，相对酶活力分别达到131%和191%。应用对虾粗蛋白酶对酱油渣中的残留蛋白进行酶解，并研究酶解效果及产物抑制血管紧张素转化酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）的活性。结果表明，对虾粗蛋白酶在高NaCl质量分数下仍具有酶解酱油渣蛋白的能力。酶解产物中，多肽质量浓度从酶解前的96.16 μg/mL增加至1 049.55 μg/mL；分子质量大于5 kDa的蛋白占比从酶解前的43.78%降低至16.85%，小于1 kDa的多肽组分占比从酶解前的28.50%增加至58.96%；游离氨基酸质量浓度从酶解前的3.01 mg/100 mL增加至97.16 mg/100 mL。利用对虾粗蛋白酶酶解酱油渣蛋白可使大豆蛋白利用率提高11.82%。酶解液对ACE的抑制活性（IC50值）为90.02 μg/mL。本研究为高值化利用对虾和酱油加工副产物提供了理论依据。关键词： 对虾粗蛋白酶；酶活力；酱油渣蛋白；血管紧张素转化酶抑制活性酱油是我国传统调味品之一，因其具有独特的滋味，受到广大消费者的喜爱。2017年，我国酱油年产量已超过600万 t，约占世界总产量的60%。根据酱油制备过程中发酵工艺的不同，我国酱油一般可分为高盐稀态发酵酱油（high-salt liquid fermentation soy sauce，HLFSS）和低盐固态发酵酱油（low-salt solid fermentation soy sauce，LSFSS）。据报道，HLFSS较LSFSS具有更佳的风味，近年前者市场份额逐年攀升。HLFSS生产工艺主要包括制备种曲、制备大曲、大豆泡合盐水制成酱膠后发酵、挤压淋油、处理酱油成品等步骤。经过几个月的精心养殖，小龙虾普遍生长到50g以上，自8月份就开始捕捞上市，采用虾笼、地笼、围网等方法，捕大留小。在少量补充投饵的情况下今年产出100～150kg商品虾。每只小龙虾可繁殖200只左右的幼虾，存活100只左右。纯利润可达两千五百元左右/亩。2～3年后，即使不投放种虾，亩产也可达100kg以上。 尽管我国酱油产量居世界首位，但生产工艺并不先进，特别是蛋白转化率偏低。据报道，日本酱油行业蛋白质利用率高达92%，而我国约为70%，仍有较多蛋白残留在剩余的固态原料残渣（以下简称酱油渣）中。酱油渣的传统利用方式是被制作成动物饲料，但存在产品NaCl质量分数过高等问题。邱宏端等选用红螺菌科细菌发酵酱渣生产酱渣光合细菌蛋白饲料，边名鸿等研究了多菌种协同发酵酱油渣以生产蛋白质饲料，钟世荣等将菜籽饼粕与酱油渣混合发酵生产蛋白饲料。实际上，酱油渣中残留的蛋白质，如能进一步分解，是制备生物活性肽和氨基酸的良好原料。肖诗英等选用木瓜蛋白酶酶解酱油渣蛋白得到小分子肽；沈晗等通过超声辅助酶法将酱油渣中的蛋白转化为多肽。随着对酶法制备方法的不断优化，酱油渣资源的利用率不断提高，但未被利用的酱油渣仍占大多数。为提高酱油渣中剩余蛋白的利用率，使更多蛋白被有效分解而转化为游离氨基酸或小肽，筛选高盐条件下具有活性的蛋白酶至关重要。我国是虾类养殖大国，2017年虾类产量达351.3万 t，其中，凡纳滨对虾产量为167.2万 t，占养殖虾类年产量的47.6%。在对虾加工过程中，为保证可食部的鲜度，避免黑变，加工企业通常将虾进行去头处理。作为加工副产物的虾头约占虾体质量的30%，除少量用于制备饲料、甲壳素外，大部分被作为废弃物丢弃，不仅造成大量蛋白资源的浪费，而且易造成环境污染。研究发现，虾头消化腺中含有丰富的蛋白酶。因此，充分利用虾头消化腺中的蛋白酶，用于蛋白质酶解，将有益于充分利用蛋白资源，减少环境污染。本研究从凡纳滨对虾虾头消化腺提取蛋白酶，将其应用于酱油渣蛋白的降解，以期提高酱油酿造原料蛋白质的利用率，降低我国酱油行业的生产成本，实现加工副产物资源的高效利用。1 材料与方法1.1 材料与试剂鲜活凡纳滨对虾购于某农贸市场；发酵12 个月的大豆残渣（以下简称酱油渣）由某酱油生产企业提供；血管紧张素转化酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）酶液由本实验室从猪肺中纯化制备；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型） 碧云天生物技术有限公司。酪氨酸、马尿酰-组氨酰-亮氨酸（hippuryl-histidylleucine，HHL） 美国Sigma公司；Boc-Phe-Ser-Arg-MCA等各种7-甲氧基香豆素-4-乙酸（7-methoxycoumarin-4-acetic acid，MCA）荧光多肽合成底物 日本Peptide Research Institute公司；Tris碱、硼酸、乙酸乙酯、盐酸、三氯乙酸、酒石酸钾钠等均为国产分析纯。在建设施工过程中，安全问题极为重要，要不断地加强和完善建设施工的安全监督管理。目前，我国的水利工程建设的安全监督管理体系还不够完整，仍存在许多问题。如在水利工程长年不断的建设过程中，一些设备已经落后，并且老化，存在较大的安全隐患，如果没有对其进行严格的监督管理，不对其进行更换，将会出现一系列的安全质量问题，从而影响整个工程的建设。另外，如果没有对那些不良企业单位进行严格的质量安全监督管理，出现偷工减料的行为，导致严重的质量问题，从而埋下安全隐患，以后将会造成更严重的安全问题，严重的影响水利工程的建设。 1.2 仪器与设备PT-2100组织捣碎机 瑞士Kinematica公司；Avanti J-26S XP冷冻离心机 美国Beckman公司；Infinite M200 Pro酶标仪 奥地利Tecan公司；FP-8200荧光分光光度计日本Jasco公司；蛋白质电泳装置 美国Bio-Rad公司；AG-223331 Lambda紫外分光光度计 美国Perkin Elmer公司；G:Box凝胶成像仪 英国Synegen公司；1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司。1.3 方法1.3.1 对虾粗蛋白酶的制备参考方忠兴的方法并作改进。从凡纳滨对虾中分离虾头消化腺，其与20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液按1∶10（g/mL）混合，组织均浆后10 000×g、4 ℃离心15 min。离心所得上清液经绢布过滤后的产物即为对虾蛋白酶粗酶液，立即使用或于-20 ℃冻藏保存。1.3.2 对虾粗蛋白酶活力测定参考翁凌等的方法并略作修改。将50 μL粗酶液加入到900 μL 20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），再加入50 μL Boc-Phe-Ser-Arg-MCA荧光底物（10 μmol/L），于37 ℃以应30 min后，立即加入1.5 mL终止液（甲醇-水-异丙醇（35∶30∶35，V/V））终止以应，以应释放的产物7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）用荧光分光光度计在激发波长380 nm和发射波长450 nm处进行测定。对虾组织蛋白酶B和组织蛋白酶L活力测定用20 mmol/L HAc-NaAc缓冲液（pH 5.5）和Z-Arg-Arg-MCA、Z-Phe-Arg-MCA荧光底物；赖氨酸氨肽酶活力测定用20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）和Lys-MCA荧光底物，其余方法同上。创新是一个民族进步的灵魂，也是高职学生成才的基础。思想政治教育的每一门课程，都蕴含着激励学生创新思维的丰富内容。思政课理论的无穷魅力，只有在联系实践中才能充分发掘出来。 酶活力单位（U）定义为每分钟分解MCA荧光底物释放出1 nmol AMC所需酶量。相对酶活力定义为不同NaCl质量分数下所测得的酶活力与对照组（不含NaCl）的酶活力（100%）之比。(2) 将从GIS中导出的预处理后的模型数据导入HEC-RAS软件，以实现河网的几何属性编辑。这些属性主要包括：河网形状、河流走向、河道断面、研究区曼宁系数。根据需要，还可以添加水工建筑物，例如堤防、水坝、桥梁、堰、孔口等。 1.3.3 酱油渣蛋白的提取按树龄分，全县1493.3hm2为幼树，1706.7hm2为初果期，盛果期为1066.7hm2。2773.3hm2挂果树占全县核桃种植总面积的65%。 参考刘冬等的方法并略加修改。以酱油渣-蒸馏水1∶4（g/mL）的比例混合，组织均浆后调均浆液pH值至9.5，于37 ℃搅拌60 min后，3 000×g、4 ℃离心20 min，所得上清液即为酱油渣蛋白溶液。上清液用透析袋（截留分子质量3 500 Da）透析除盐后4 ℃贮藏备用。蛋白提取率按式（1）计算：无载氧体时，热解挥发气中H2含量较高，为51.1%，H2/CO相对较高，但气体收率低，为1.16 Nm3/kgbiomass，生物质碳转化率仅为62.8%。Fe2O3引入的晶格氧促进了生物质气化反应，当Fe2O3/C为0.13时，生物质碳转化率提高到 90.9%。进一步提高 Fe2O3量到Fe2O3/C为0.5，可将生物质完全气化。带入燃料反应器的晶格氧量的增加，促进了固体焦炭转化为气体成分，因此合成气收率和 CO含量提高，这也降低了H2/CO比，约为0.83。合成气收率和合成气的H2及CO收率为1.48 Nm3/kgbiomass和1.16 Nm3/kgbiomass。 http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/5e3dfc4b3ffcd79755efe8cf02e761fb.jpg式中：m1为提取液中蛋白质量/g；m0为样品质量/g；c为样品中蛋白质量分数/%。1.3.4 蛋白含量的测定利用BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）测定提取液及酶解液中的蛋白含量。吸取样品溶液200 μL，加入BCA工作液20 μL，在37 ℃恒温箱中静置30 min，于562 nm波长处测定其吸光度。用凯氏定氮法对大豆及酱油渣样品中蛋白质含量进行测定。1.3.5 对虾粗蛋白酶酶解酱油渣蛋白在酱油制备过程中，酱醪含盐量约为15%。将提取的脱盐酱油渣蛋白于121 ℃加热30 min，冷却至室温后加入NaCl至质量分数为15%并调pH值至8.0。以酱油渣蛋白-对虾粗蛋白酶质量比200∶1加入混合，置于37 ℃水浴中酶解72 h，酶解结束后于95 ℃加热10 min，用于后续分析。蛋白降解率按式（2）计算：http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/b96452c046694f796904bd71c094a32d.jpg
式中：m1为提取液中蛋白质量/g；m为酶解液中蛋白质量/g。1.3.6 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析参考Laemmli的方法，选用Tricine-SDS-PAGE对除盐后的酶解液进行分析。某型号为N300-16.7/537/537-8的300 MW机组于2006年3月投产。机组有3个临界转速，分别为1370 r/min、1688 r/min、1750 r/min。该机组于2017年9月大修时配套进行节能升级改造，更换了高中压缸隔板汽封、高中压缸前后汽封、高中压缸过桥汽封，所有汽封间隙全部按技术规范下限调整。 1.3.7 酶解前后多肽含量的变化参考Pantako等的方法对样品中的多肽进行提取，用Lowry法测定酶解前后三氯乙酸可溶性多肽含量的变化。以L-酪氨酸（0～100 μg/mL）为标准。1.3.8 分子质量分布的测定参考谢雪琼等的方法并略做修改，采用高效凝胶过滤色谱法测定。分子质量校正曲线所用标准品如下：鱼类小清蛋白II，11 950 Da；50肽，5 617.97 Da；杆菌肽，1 422.69 Da；Gly-Gly-Arg-Tyr，451.48 Da；Tyr，181.19 Da。色谱条件：GF-1260高效液相色谱纯化系统，色谱柱为TSK gel G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm），流动相为乙腈-水-三氟乙酸（45∶55∶0.1，V/V），检测波长2 2 0 n m，进样体积1 0 μ L（标准品）、5 0 μ L（待测样品），流速1 m L/min，柱温25 ℃。利用GPC Offline软件进行数据分析，以确定样品分子质量的分布比例。1.3.9 氨基酸组成分析采用高效液相色谱法。用浓度为0、50、125、250、500 μmol/L的氨基酸标准品制作标准曲线。色谱条件：GF-1260高效液相色谱纯化系统；色谱柱为ADVANCEBIO AAA；流动相A为10 mmol/L Na2HPO4、10 mmol/L Na2B4O7，流动相B为乙腈-甲醇-水（45∶45∶10，V/V）；检测波长为262 nm（脯氨酸）和338 nm（其余氨基酸）；进样体积1.0 μL；流速1.5 mL/min；柱温40 ℃。根据保留时间确定样品中的氨基酸组成，根据峰面积计算样品中每种氨基酸的含量。1.3.10 ACE抑制活性的测定参考Cushman等的方法，并略作修改。在Eppendorf管中先后加入20 μL ACE溶液与20 μL待测样品，充分混匀，37 ℃预热5 min后，立即加入50 μL 6.5 mmol/L HHL溶液（溶于0.1 mol/L硼酸盐缓冲液，pH 8.3，含0.3 mol/L NaCl），于37 ℃加热60 min。用50 μL 1 mol/L盐酸终止以应后，加入300 μL乙酸乙酯，室温、1 000×g离心5 min。取上清液200 μL，真空浓缩去除乙酸乙酯，加入600 μL去离子水充分溶解后，2 000×g离心3 min，在波长228 nm测定上清液的吸光度。其中，对照组用超纯水代替样液，空白组先加入盐酸再加入底物，其余条件不变。IC50代表ACE抑制率为50%时对应的样品质量浓度。ACE抑制率按式（3）计算：对比国内外文献共被引结果，我们认为有两点值得深思：(1)国内外追踪的热点虽有相似，但研究路径截然不同。国内研究似乎还停留在厘清概念、引介国外研究成果的阶段，对实证性、原创性的研究成果不够重视。(2)国内文献引用的大多是领域内的专家学者，注重权威性，比较青睐理论综述、基础研究类的文献。而国外文献引用的除了专家学者，还有热点话题研究的先驱，关注点更全面。 http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/3e2b7f46414f14f85129786afae1781e.jpg
式中：A1为对照组吸光度；As为实验组吸光度；A0为空白组吸光度。1.4 数据处理采用Excel 2010对数据进行处理。每组设置3 个平行，以组内的平均变异系数为组内误差进行分析。形势变得异常严峻。订单越来越少，价格就被压得更低，景花厂将面临着揭不开锅的局面。阿花像只漏气的轮胎，怎么打气也无济于事了。阿花说我拿什么撑下去啊，就算我养着这些员工，也养不了几个月，金融危机是几个月就能过去的吗？阿花忽然悲恸不已，伏在办公桌上泪如珠落。阿花说，都是我这个老板的错，我只关心美容健身，关心时尚服装，从不关心政治经济，不关心市场走势，要早知道闹金融危机，景花厂及早调头，哪会像今天这样一败涂地呢？ 2 结果与分析2.1 对虾粗蛋白酶活力及NaCl质量分数对其影响http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/7c5358ffa853afae6bd98cfaf71d3f74.jpg&p=590x324&q=30 图1 对虾粗蛋白酶活力
Fig. 1 Activities of crude proteases in shrimp heads
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/6497809bca0c02f11a381e62c170e16f.jpg&p=604x406&q=30 图2 NaCl质量分数对酶活力的影响
Fig. 2 Effect of salt concentration on protease activities
对虾粗蛋白酶中所含的3 种主要酶及其活力如图1所示。对虾粗蛋白酶主要由高活力的胰蛋白酶、赖氨酸氨肽酶及组织蛋白酶B+L组成，其活力分别为25.47、5.11 kU/mL和1.70 kU/mL。如图2所示，胰蛋白酶、组织蛋白酶B+L、组织蛋白酶K、苯丙氨酸氨肽酶及赖氨酸氨肽酶的活力先降低后趋于稳定。在高NaCl质量分数下，不同蛋白酶均具有一定的酶活力。甲硫氨酸氨肽酶及丙氨酸氨肽酶的相对酶活力随NaCl质量分数的增加呈现先降低后升高的趋势，在NaCl质量分数为5%时其相对酶活力最低，而NaCl质量分数在25%时，分别达到191%和131%。检测不同浓度KCl对丙氨酸氨肽酶及甲硫氨酸氨肽酶的相对酶活力影响，得到了类似结果。推测当一价金属离子达到一定浓度时对丙氨酸氨肽酶及甲硫氨酸氨肽酶具有一定的激活作用。Lei Fenfen等研究发现从海洋Bacillus licheniformis SWJS33中提取的氨肽酶具有很强的耐盐性，在15%的NaCl溶液中具有150%左右的相对酶活力。Gao Xianli等研究发现，天冬酰胺氨肽酶具有较高的耐盐性，在17.5%的NaCl溶液中仍具有90%左右的相对酶活力。由于对虾粗蛋白酶在高NaCl质量分数下仍具有一定的酶活力，可作为在高盐条件下酶解蛋白的工具酶。2.2 酱油渣蛋白的提取及酶解分析以发酵12 个月的酱油渣为原料，采用碱溶的方法对酱油渣残余蛋白进行提取，蛋白提取率可达62.89%。利用Tricine-SDS-PAGE对所提蛋白进行分析，结果显示经过12 个月的发酵酶解，酱油渣中残存的主要是分子质量小于35 kDa的蛋白（图3对照组）。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/a9075d187b99be7a2d8fb2f795cf6d1a.jpg&p=612x400&q=30 图3 不同NaCl质量分数下对虾粗蛋白酶酶解酱油渣蛋白的Tricine-SDS-PAGE分析
Fig. 3 Tricine-SDS-PAGE analysis of soybean dregs hydrolyzed by crude proteases under different salinities
考虑到酱油在实际酿造过程中含有较高质量分数的NaCl，本研究设计对虾粗蛋白酶在不同NaCl质量分数（15%、17.5%、20%、22.5%、25%）下对酱油渣蛋白进行酶解，如图3所示。在不同的NaCl质量分数下，蛋白均可被有效降解，且降解效果没有显著性差异，该结果与NaCl质量分数对酶活力影响一致。由蛋白降解计算可知，在15% NaCl质量分数下，对虾粗蛋白酶对酱油渣蛋白的降解率可达63.25%。高盐稀态酱油在酿造过程中含盐量较高，酱醪NaCl质量分数达15%左右。一般蛋白酶在该NaCl质量分数下会丧失活性，不适合应用于酱油酿造，而对虾粗蛋白酶在NaCl质量分数高达25%时依然具有酶解酱油渣蛋白的能力，说明对虾粗蛋白酶具有应用于酱油生产提高蛋白质利用率的可能性。图8、9：引自htt ps://www.archdail y.com/882382/seoul l o-sky garden-mvr dv. 2.3 酶解前后多肽含量的变化http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/b7c5ab59aec97d41345d0b80858642bd.jpg&p=652x310&q=30 图4 酶解前后样品多肽质量浓度
Fig. 4 Peptide contents before and after enzymatic hydrolysis
用酶解前后样品多肽含量的变化显示酶解效果，差异越大则酶解效果越好。酶解前后多肽含量变化如图4所示，酶解前样品的多肽质量浓度为96.16 μg/mL，酶解后达到1 049.55 μg/mL，增加了9.91 倍，表明对虾粗蛋白酶能够酶解酱油渣蛋白且具有良好的酶解效果。2.4 分子质量分布酶解前后样品的分子质量分布如图5所示，样品分子质量的分布如表1所示。比较图5a与图5b，加入对虾粗蛋白酶后酱油渣蛋白得到有效酶解，特别是对分子质量大于5 kDa蛋白的酶解作用效果显著，占比由43.78%降至16.85%；小分子质量（小于1 kDa）部分占比明显增多，由28.50%升至58.96%。酶解后分子质量小于500 Da的组分占比接近50%，表明大分子质量蛋白被有效降解，且降解产物以小分子肽和氨基酸为主。观察组患者不良反应发生率为16.25%，对照组患者不良反应发生率为12.86%，两组相比，差异无统计学意义，见表4。 http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/f7122e42a58658e2800d43445c94be1c.jpg&p=662x642&q=30 图5 酶解前后样品的分子质量分布色谱图
Fig. 5 Chromatogram for molecular mass distribution of samples before and after hydrolysisa.酶解前样品；b.酶解产物。斜线表示分子质量的标准曲线，A、B、C、D、E表示标准蛋白及肽，分子质量分别为11 950、5 617.97、1 422.69、451.48、181.19 Da。
表1 酶解前后样品的分子质量分布比例
Table 1 Molecular mass distribution of samples before and after hydrolysishttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/3142e5546c1a835cb859113c376d5d02.jpg&q=30 分子质量范围/Da 占比/%酶解前 酶解后＞5 000 43.78 16.85 3 000～5 000 9.61 6.85 1 000～3 000 18.11 17.33 500～1 000 12.31 9.38 1～500 16.19 49.58
2.5 氨基酸组成分析如表2所示，酶解前后对比，酶解后氨基酸的种类及含量均有较大程度的增加。游离氨基酸总量由3.01 mg/100 mL增至97.16 mg/100 mL。酶解前后样品中的呈鲜味氨基酸总量由0.35 mg/100 mL增至3.33 mg/100 mL，呈甜味、酸味氨基酸总量由0.75 mg/100 mL增至11.50 mg/100 mL，但呈苦味氨基酸总量也由1.91 mg/100 mL增加至60.15 mg/100 mL。推测在对虾粗蛋白酶酶解酱油渣蛋白的过程中耐盐的氨肽酶发挥了重要作用，使小肽被酶解为游离氨基酸，其种类及含量均有较大幅度的提升。而酶解前样品中游离氨基酸的种类及含量较低是由于透析所导致的。表2 酶解前后样品的氨基酸含量变化
Table 2 Changes in amino acid composition before and after hydrolysishttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/12cd20765ac6292413eb96b3a7902cf1.jpg&q=30 注：/.未检出。氨基酸 质量浓度/（mg/100 mL）酶解前 酶解后天冬氨酸（Asp） 0.30 1.22谷氨酸（Glu） 0.05 2.11丝氨酸（Ser） 0.19 0.57组氨酸（His） 0.18 4.11甘氨酸（Gly） 0.20 4.59苏氨酸（Thr） / 0.60丙氨酸（Ala） 0.36 4.53酪氨酸（Tyr） 0.52 0.71半胱氨酸（Cys） / 0.58缬氨酸（Val） 0.23 0.36甲硫氨酸（Met） / 21.00色氨酸（Trp） 0.07 0.39苯丙氨酸（Phe） 0.37 12.06异亮氨酸（Ile） 0.35 14.46亮氨酸（Leu） 0.19 20.25赖氨酸（Lys） / 7.81脯氨酸（Pro） / 1.81鲜味氨基酸 0.35 3.33苦味氨基酸 1.91 60.15甜味、酸味氨基酸 0.75 11.50氨基酸总量 3.01 97.16
2.6 ACE抑制活性分析http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/5af48dc7d7b7d103f1ea22154c4c3386.jpg&p=632x310&q=30 图6 酶解液的ACE抑制活性
Fig. 6 ACE inhibitory activity of enzymatic hydrolysate
ACE能水解缓激肽，引起血管收缩，具有使血压升高的作用。酱油渣蛋白酶解液对ACE具有抑制活性（图6），随着质量浓度增加其ACE抑制活性逐渐增强，IC50为90.02 μg/mL。ACE抑制肽在预防和/或治疗高血压中起重要作用。因此，与普通酱油相比，具有ACE抑制活性的酱油将具有更强的竞争力。3 讨 论酱油渣是酱油酿造过程中产生的副产物，酱油渣蛋白在高盐条件下难以降解是造成酱油酿造过程中蛋白利用率低的主要原因。本研究从凡纳滨对虾加工副产物虾头消化腺中提取蛋白酶并对酱油渣蛋白进行酶解。对虾消化腺中含有丰富的蛋白酶，是一种优质的蛋白酶资源。Cao Wenhong等报道了利用超声技术从凡纳滨对虾的头部回收蛋白质的方法。本研究发现，对虾粗蛋白酶中主要含有高活力的胰蛋白酶、组织蛋白酶及氨肽酶，Tricine-SDS-PAGE分析结果显示在不同NaCl质量分数条件下对虾粗蛋白酶均能够有效降解酱油渣蛋白。对酶解前后结果进行对比发现，酶解后酱油渣蛋白质分子质量明显降低，酶解产物中多肽含量显著升高。据Zhuang Mingzhu等报道，分子质量小于500 Da的小肽是酱油风味的主要提供者。Lioe等研究表明酱油中咸味和鲜味主要是由分子质量小于500 Da组分提供。本研究以酱油渣蛋白为原料，以对虾粗蛋白酶为酶解工具酶，所得到的酶解液中小于500 Da组分占比较高，预测在酱油生产工艺中加入对虾粗蛋白酶会使酱油具有更好的风味。A.借助计算器或Excel。分别逐一计算各行、各列以及条件百分比，之后根据逐项算出的数据，在原有交叉分布表的基础上制作出包含百分比的二维表。在计算γ系数时，根据已知频数分布表可知：同序对数Ns=68×(36+13+41+10)+57×(13+10)+25×(41+10)+36×10=9746；异序对数Nd=16×(25+36+34+41)+57×(25+34)+13×(34+41)+36×34=7738，于是有γ系数为可看出“身份”与“态度”两个顺序变量几乎不相关。 与酶解前相比，酶解后产物中呈味氨基酸及总氨基酸的种类及含量均有较大程度的增加。Goh等指出酱油中的游离氨基酸含量对其感官品质的评价至关重要。酱油中呈味氨基酸含量越高则其风味越鲜美，且相比于蛋白，小分子肽及游离氨基酸更易被人体消化吸收，推测在酿造酱油的过程中加入对虾粗蛋白酶会使酱油具有更好的风味、更高的营养价值。1.3.4 IL-6、NE水平检测 患儿分别在急性期 （入院时）及恢复期 （临床症状消失后3d）采静脉血2ml，健康体检婴幼儿采血2ml，分离上清，并分装保存，贮存于-20℃冰箱中，采用化学发光法（德国西门子，化学发光免疫分析仪，型号：IMMULITE1000）检测IL-6，采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）(芬兰酶标仪，型号MK-3)检测 NE水平。 经检测，本研究合作企业的原料大豆中蛋白质量分数为32.24%，而酱油渣中仍残留9.59%的蛋白，蛋白利用率为70.25%。应用对虾粗蛋白酶对酱油渣蛋白进行酶解，可再利用3.81%的大豆蛋白，即蛋白利用率提高至82.07%。对酶解液的生物活性进行测定后发现酶解液具有ACE抑制活性。Peng Mingye等报道酱油含有黄酮、异黄酮、酚等许多生物活性成分。Li Huipin等指出从酱油中纯化的具有高抗氧化活性的成分可用作食品工业中的生物活性成分。Zhu Xiaolin等曾从酱油中鉴定出具有ACE抑制活性的小肽。4 结 论本研究从凡纳滨对虾虾头消化腺中提取对虾粗蛋白酶，并将其应用于酱油豆渣蛋白质的进一步酶解。进行Tricine-SDS-PAGE、多肽含量变化、分子质量分布、游离氨基酸种类及含量变化测定，对酶解效果进行表征，结果均表明对虾粗蛋白酶能够有效酶解含盐酱油渣蛋白。利用对虾粗蛋白酶酶解酱油渣蛋白可使大豆蛋白利用率提高11.82%。酶解产物对ACE表现较高的抑制活性，其IC50为90.02 μg/mL。本研究可为虾头和酱油豆渣的高值化利用、解决我国酱油行业蛋白质利用率低的问题提供理论参考。参考文献： 赵国忠, 姚云平, 曹小红, 等. 2 种米曲霉发酵酱油风味物质比较.食品科学, 2014, 35(24): 249-253. 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Protein Degradation of Soybean Dregs from Soy Sauce Production by Proteinase from Pacific White Shrimp (Penaeus vannamei)XIAO Panpan1, ZHANG Qian2, WENG Ling1,2, ZHANG Lingjing1,2, YANG Shuang1, LIU Guangming1,2, CAO Minjie1,2,*
(1. College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China;2. National & Local Joint Engineering Research Center of Processing Technology for Aquatic Products, Xiamen 361021, China)Abstract: Proteases were extracted from shrimp heads as a byproduct from the processing of Pacific white shrimp (Penaeus vannamei). The types of enzymes contained in the extract and the effect of salt concentration on these protease activities were investigated. The extract mainly contained trypsin, cathepsins and aminopeptidases. At NaCl concentration of 25%,trypsin, cathepsin B+L and cathepsin K retained about 10% of their initial activity while the activity of phenylalanine aminopeptidase remained 30% of its initial level. High salinity (25%) had an activating effect on alanine aminopeptidase and methionine aminopeptidase, increasing them by 31% and 91%, respectively. The crude proteases were used to degrade waste proteins from soy sauce production. The degradation efficiency and the inhibitory activity of the resulting products against angiotensin I-converting enzyme (ACE) were evaluated. It was found that the proteases were still able to digest the proteins even at high salinity. After enzymatic hydrolysis, the polypeptide content increased from 96.16 to 1 049.55 μg/mL,the proportion of proteins with molecular mass higher than 5 kDa decreased from 43.78% to 16.85%, and the proportion of peptides with molecular mass lower than 1 kDa increased from 28.50% to 58.96%. The total amount of free amino acids increased from 3.01 to 97.16 mg/100 mL. The utilization rate of soybean proteins increased by about 11.82%. The IC50 value of the resulting hydrolysate for inhibition of ACE was 90.02 μg/mL. Our present study provides a theoretical basis for highvalued utilization of by-products from the processing of soy sauce and shrimp.Keywords: crude shrimp proteases; enzyme activity; waste proteins from soy sauce production; angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity
收稿日期：2019-04-19基金项目：福建省科技厅产学研重大项目（2017N5011）第一作者简介：肖盼盼（1990—）（ORCID: 0000-0003-2396-9722），女，硕士研究生，研究方向为水产加工。E-mail: 201711832019@jmu.edu.cn*通信作者简介：曹敏杰（1964—）（ORCID: 0000-0002-5774-7610），男，教授，博士，研究方向为水产品深加工、蛋白质化学。E-mail: mjcao@jmu.edu.cnDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190419-253中图分类号：TS254.1文献标志码：A文章编号：1002-6630（2020）10-0131-07引文格式：肖盼盼, 章骞, 翁凌, 等. 凡纳滨对虾蛋白酶对酱油渣蛋白质的降解作用. 食品科学, 2020, 41(10): 131-137.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190419-253. http://www.spkx.net.cnXIAO Panpan, ZHANG Qian, WENG Ling, et al. Protein degradation of soybean dregs from soy sauce production by proteinase from pacific white shrimp (Penaeus vannamei). Food Science, 2020, 41(10): 131-137. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190419-253. http://www.spkx.net.cn
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