酸胁迫对S-腺苷甲硫氨酸和谷胱甘肽生物合成的影响及其生...
酸胁迫对S-腺苷甲硫氨酸和谷胱甘肽生物合成的影响及其生理机制酸胁迫对S-腺苷甲硫氨酸和谷胱甘肽生物合成的影响及其生理机制王大慧，徐若烊，黎德超，卫功元*（苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏 苏州 215123）摘 要：在高密度培养条件下，考察不同pH值环境对产朊假丝酵母生物合成S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）的影响。结果发现弱酸胁迫（pH 3.5）有利于提升酵母细胞的SAM和GSH合成能力，实现SAM和GSH联合高产。通过对关键酶活性、能量物质供给和胞内氧化还原环境进行测定，发现弱酸胁迫提高了SAM合成酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、己糖激酶、ATP合成酶以及过氧化氢酶的活性，提高了胞内NADH和ATP的水平和再生能力，为SAM和GSH的过量合成提供了充足的物质和能量保障。研究结果揭示了弱酸胁迫促进SAM和GSH生物合成的生理机制，也为类似小分子活性化合物的过量合成提供可行的思路。关键词： 产朊假丝酵母；S-腺苷甲硫氨酸；谷胱甘肽；联产发酵；酸胁迫S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）均为广泛存在于细胞内的重要活性含硫小分子化合物，在生物体内发挥重要的生理功能。SAM具有转甲基、转氨丙基、转硫基等作用，参与体内基因调控、神经传导以及解毒等多种生理过程，GSH具有提高机体免疫力和抗氧化等功能，在临床医药、运动保健和食品加工等领域都有广泛的应用前景。酵母发酵法是合成SAM和GSH最常用的方法。在酵母细胞中，SAM由L-甲硫氨酸和ATP经SAM合成酶催化合成；而GSH由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS）和谷胱甘肽合成酶催化的序贯以应合成。同时，SAM和GSH的生物合成均需要ATP参与，胞内ATP的供给水平是决定SAM和GSH能否过量合成的重要因素。本实验组分别通过诱变育种、添加前体氨基酸和能量辅助物质、过量表达外源基因和敲除线粒体膜相关基因，提高了胞内SAM和GSH的含量，实现了分批发酵过程中SAM和GSH的联合高产。SAM和GSH均属于胞内物质，细胞密度的增加将有助于二者联产产量的提高。因此，有必要考察高密度培养条件下的SAM和GSH生物合成情况及其影响因素。在食品发酵工业中，许多微生物在代谢过程中会遭遇到酸胁迫环境，对酸胁迫也有一定的抵抗和适应能力。不同微生物对外界酸胁迫环境的响应情况不尽相同，导致不同代谢产物在生物合成中所需的最适pH值也会有很大的差异。近年来，随着微生物抗逆性相关的生理机制被逐渐解析，酸胁迫处理也开始应用于微生物代谢产物的过量合成。在以往针对产朊假丝酵母分批发酵的研究中，发现pH 5.0有利于细胞生长和SAM合成，弱酸胁迫（pH 3.5）有助于胞内GSH含量的提升，而强酸胁迫（pH 1.5）则明显抑制了细胞的正常代谢。然而，目前还不清楚酸胁迫对高密度培养条件下的产朊假丝酵母生物合成SAM和GSH过程将产生的影响。为此，本研究比较不同pH值条件下的产朊假丝酵母高密度培养过程，重点考察酸胁迫环境对酵母细胞合成SAM和GSH能力的影响，并对酸胁迫的作用机制进行解析，以期为深入理解产朊假丝酵母生理特性以及提高SAM和GSH生物合成能力拓展思路。1 材料与方法1.1 材料与试剂产朊假丝酵母（Candida utilis Δpor1），由苏州大学微生物生理与代谢调控研究室筛选并保藏。种子培养基：葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L；pH 6.0。发酵培养基：葡萄糖35 g/L，(NH4)2SO4 10 g/L，KH2PO4 12.3 g/L，L-甲硫氨酸4.6 g/L，CaCl2 0.05 g/L，MgSO4 0.05 g/L；pH值根据实验要求确定。流加培养基：葡萄糖600 g/L，(NH4)2SO4 100 g/L，KH2PO4 123 g/L，L-甲硫氨酸46 g/L，CaCl2 0.5 g/L，MgSO4 0.5 g/L；葡萄糖单独灭菌后与其他成分混合。1.1 对象 2012年4月，采用目的抽样法，选取上海市和杭州市4所医院助产士为参与讨论的专家，其中2所为3级甲等专科医院，1所为3级甲等医院，1所为2级甲等专科医院。入选标准:具有10年以上助产工作经验，本科及以上学历，主管护师以上职称，熟练掌握各种会阴分娩助产方式，对本研究问题熟悉，对本次研究主题感兴趣。 1.2 仪器与设备1525型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 美国Waters公司；BIOTECH-5BGZ搅拌式发酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司；HZ-2010KA恒温摇瓶柜 太仓市华利达实验仪器设备有限公司；J6-MI型冷冻离心机 美国Beckman公司；UV2300 II双光束紫外-可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司。1.3 方法1.3.1 种子培养将在-70 ℃超低温冰箱中保藏的菌种（1 mL）接种至装有50 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，于30 ℃、200 r/min摇床中培养24 h。1.3.2 高密度培养将种子液接种到装有3 L发酵培养基的发酵罐中，接种量10%（V/V），起始转速350 r/min，通气量3.0 L/min。为实现高密度培养，自第12小时起以多项式流加方式补加流加培养基至总糖质量浓度为200 g/L（至约28 h），具体流加操作方法见文献。通过手动调节搅拌转速（300～900 r/min）将溶氧水平控制在不低于30%。pH值采用梅特勒电极在位监测，并通过流加3 mol/L H2SO4溶液或3 mol/L NaOH溶液将pH值控制在实验要求的范围内。1.3.3 无细胞提取物的制备根据目前市场趋势，依据《民用建筑电气设计规范》，小区变压器选择S11系列全密封油浸式变压器，包括3台S11-M-800/10变压器和2台S11-M-500/10变压器。 取5 mL发酵液，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，得到的酵母细胞经生理盐水洗涤2 次后，再重新悬浮在5 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲溶液（pH 7.0）中，超声破碎10 min（破碎10 s，间隔10 s），4 ℃、12 000 r/min离心20 min，收集上清液（即无细胞提取物），用于测定胞内物质的质量浓度和关键酶活性。1.3.4 指标测定细胞干质量和葡萄糖质量浓度的测定参考文献。胞内SAM的提取和测定：取10 mL新鲜发酵液，3 500 r/min离心10 min，湿细胞用0.35 mol/L稀硫酸溶液萃取2 h，离心，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，获得的样品采用HPLC法测定SAM质量浓度。GSH的提取和测定：取10 mL新鲜发酵液，3 500 r/min离心10 min，湿细胞在30 ℃用体积分数40%乙醇溶液萃取2 h，离心，取上清液采用DTNB-谷胱甘肽还原酶循环法定量测定GSH质量浓度。胞内NADH、NAD+、ATP和ADP质量浓度的测定采用HPLC法。1.3.5 酶活性测定SAM合成酶（蛋氨酸腺苷转移酶（methionine adenosyltransferase，MAT））活性的测定方法参见文献。γ-GCS、己糖激酶（hexose kinase，HK）、ATP合成酶、过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量均采用南京建成生物科技有限公司的相关试剂盒进行测定，具体操作步骤参照试剂盒说明书执行。异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）活性采用上海酶联生物科技有限公司的试剂盒进行测定，具体操作步骤参照试剂盒说明书执行。1.3.6 发酵过程参数计算苦瓜根系发达，茎蔓生，分枝力强。种子盾形，有花纹，每果含种子20～30粒，千粒重150～180克。苦瓜喜温，耐热，不耐寒。种子发芽适温30～35℃，幼苗生长适温20～25℃，开花结果期适宜温度25～30℃。对光照长短要求不严格，开花结果期要求较强的光照；喜湿润，但不耐涝；对土壤肥力要求较高。 胞内SAM和GSH含量、细胞得率、SAM和GSH得率、细胞生产强度、SAM和GSH生产强度等发酵过程参数的计算方法见文献。1.4 数据统计分析所有实验数据均以3 组平行样品检测结果的 ±s表示，差异显著性检验以pH 5.0组作为对照组，用t检验双尾检验分析。Excel 2010软件作图。（2）地质灾害可预报、可监测，这也就强调积极开展生态化地质灾害防治工作的必要性与重要性。当前，随着现代科学技术的不断发展，人类在地质灾害防范上，已取得了诸多的科技成果，在很大程度上提高了地质灾害的防治能力。但是，地质灾害防治关乎一个国家、地区的稳定发展，关系到人民百姓的生产财产安全和生存环境，地质灾害防治工作是一项长期而艰巨的工作，需要逐步强化并建立完善的地质灾害防范工作体制，强化地质灾害预测及应急处理能力，最大程度地降低地质灾害对社会发展、人民群众财产安全的威胁和环境的影响。 2 结果与分析2.1 不同pH值条件下的SAM和GSH联产发酵过程分析http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/2d2bc78f1f9e1b48198a7b97cf2877db.jpg&p=670x938&q=30http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/58fc020018773d70ac68cfd679c97eb5.jpg&p=656x320&q=30 图1 不同pH值条件下的SAM和GSH联产发酵过程
Fig. 1 Time courses of high cell culture for the co-production of SAM and GSH under different pH conditions
在前期分批发酵研究的基础上，重点考察酸胁迫环境对高密度培养条件下产朊假丝酵母生物合成SAM和GSH的影响。为此，将发酵培养基的pH值分别控制在2.5（强酸胁迫）、3.5（弱酸胁迫），并以pH 5.0（适合生长）作为对照。不同pH值条件下的葡萄糖消耗、细胞生长、SAM和GSH合成情况见图1，SAM和GSH产量、含量、得率和生产强度等发酵过程参数的最大值见表1。可以看出，酵母细胞能在较宽的pH值范围内利用葡萄糖进行生长并达到较高的细胞密度，但是在pH 2.5和pH 3.5条件下的最大细胞干质量分别比pH 5.0时的水平下降10.1%和8.1%。综合细胞得率和生产强度等过程参数的结果可以发现，酵母细胞在酸胁迫环境下的生长代谢明显受到了一定程度的抑制。近几年，各类图书馆的阅读推广活动开展得如火如荼，阅读推广的平台也越来越丰富，如：基于微信公众平台的阅读推广、基于移动终端的阅读推广，基于社会化媒体的图书馆阅读推广等。显然，现代的社会媒介是阅读推广活动重要平台和手段，但是纵观国内各类型的图书馆，在阅读推广网络平台的建设方面仍然比较薄弱。据调查研究，全国39所985高校图书馆网站中设置阅读推广平台仅有21所，占总量的53.8%。图书馆的网站是展示图书馆信息资源的重要平台，也是读者了解一所图书馆的资源建设、服务手段以及活动的重要的途径。借助图书馆的网站加强阅读推广平台的建设无疑是非常有效的阅读推广方式之一。 表1 不同pH值条件下的SAM和GSH联产发酵过程参数
Table 1 Parameters involved in high cell culture for the co-production of SAM and GSH under different pH conditionshttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/4e552b81c6c9e20dd05e5519237b6b31.jpg&q=30 注：以pH 5.0为对照组，同行小写字母不同表示差异显著（P＜0.05），同行大写字母表示差异极显著（P＜0.01）。过程参数 pH 2.5 3.5 5.0细胞干质量/（g/L） 73.20±0.66B 74.84±0.74B 81.43±0.57A SAM产量/（mg/L） 682.6±4.1B 841.3±5.9B 769.8±3.8A GSH产量/（mg/L） 758.2±5.3B 1 085.3±9.7B 962.5±7.6A SAM和GSH联产量/（mg/L） 1 369.6±8.2B 1 831.2±9.1B 1 659.2±9.9A胞内SAM含量/（mg/g） 11.41±0.07B 14.33±0.10B 12.24±0.06A胞内GSH含量/（mg/g） 11.63±0.08B 16.99±0.15B 14.05±0.11A细胞得率/（g/g） 0.374±0.019b 0.377±0.019a 0.417±0.017a SAM得率/（mg/g） 3.49±0.02B 4.24±0.03B 3.95±0.02A GSH得率/（mg/g） 3.88±0.03B 5.47±0.05B 4.94±0.04A细胞生产强度/（g/（L·h）） 1.743±0.016B 2.079±0.021B 2.262±0.016A SAM生产强度/（mg/（L·h）） 9.48±0.06B 11.68±0.08B 10.69±0.05A GSH生产强度/（mg/（L·h）） 14.04±0.10B 20.10±0.18B 17.82±0.14A
与细胞生长情况不同，pH 3.5有利于SAM和GSH的生物合成（图1），胞内SAM和GSH含量分别比pH 5.0时的结果高出17.1%和20.9%，最终SAM和GSH联产量也提高了10.4%。表1中SAM、GSH得率和生产强度等结果也证明了pH 3.5可以促进SAM和GSH在酵母细胞内的合成和积累。然而，在pH 2.5条件下，酵母细胞的SAM和GSH合成能力明显下降，SAM和GSH的联产量、得率、生产强度等指标均低于pH 5.0条件下的结果。由此可见，弱酸胁迫可以提高SAM和GSH的合成能力，而强酸胁迫则对酵母细胞的代谢过程产生了不利的影响。以下将对酸胁迫在高密度联产发酵中的作用机制进行解析。2.2 SAM和GSH合成关键酶活性MAT和γ-GCS分别是SAM和GSH生物合成途径中的关键酶，图2结果表明，在同一pH值条件下，细胞生长期间（前36 h）的MAT活性均维持在相对稳定的水平，而在高密度培养后期（48、60 h）MAT的活性有所提高，但幅度不大。与此同时，γ-GCS活性在细胞生长期逐渐增加，至36 h达到最大值，之后逐渐降低。图2还表明，在任一培养阶段，pH 3.5时的MAT和γ-GCS活性均高于pH 2.5和pH 5.0时的活性，表明弱酸胁迫环境有利于将SAM和GSH生物合成关键酶的活性维持在较高水平。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/e2be3a3c2d17857044297773aa596839.jpg&p=690x634&q=30 图2 不同pH值条件下的MAT和γ-GCS活性
Fig. 2 Activities of MAT and γ-GCS under different pH conditions以pH 5.0组为对照，*.差异显著（P＜0.05）；**.差异极显著（P＜0.0 1）。下同。
2.3 能量代谢物质合成关键酶活性HK和IDH分别是糖酵解途径和三羧酸循环的关键酶之一，在好氧发酵中，其活性的大小对胞内葡萄糖消耗和NADH形成速率均能产生重要的影响。由图3可以看出，不同pH值环境下的酵母胞内HK活性均在18 h达到较高的水平，此时pH 3.5和pH 5.0条件下的HK活性相差不大。此外，在葡萄糖流加期间，IDH基本不受pH值环境和培养时间的影响，其活性一直维持在较为稳定的水平；至第30小时，IDH活性虽然有所提高，但不同pH值条件下的结果没有明显差异。综合30 h前的HK和IDH活性结果可以发现，pH 3.5和pH 5.0环境比pH 2.5更加有利于底物的消耗，并促进NADH的合成与供给。式中第一个指数项与距离向成像有关，第二个指数项主要与方位向成像有关.传统的ISAR二维成像首先进行距离向处理，再进行方位向成像处理，即可得到最终的二维成像结果.这种方法虽然简单，但是由于距离向的高分辨导致的越距离单元走动往往不能忽略，将会影响方位向的成像精度，且距离向处理后，方位向的联合稀疏信息也将被破坏，无法进行方位向联合高分辨重构.为充分利用回波信号的二维结构稀疏信息，本节首先对CFS ISAR回波信号的结构特性进行分析. 以“数据存储安全、访问权限严谨”为基础，以“安全运行、优质服务、创造价值”为目标，实现对IT环境中各类基础设施的集中式监控管理，包含网络、系统、安全设备、数据库、中间件、业务系统、存储设备和机房环境等系统的监控管理。 为研究酵母胞内ATP的合成是否受pH值的影响，检测不同培养阶段ATP合成酶的活性，结果如图4所示。可以看出，pH 2.5条件下的ATP合成酶活性一直维持在较低水平，且不同培养时间下的酶活性没有明显差异，而在pH 3.5和pH 5.0时，流加结束后的ATP合成酶活性均明显提高，其中pH 3.5更有利于将ATP合成酶活性提高到较高水平。因此，在NADH供给充足的前提下，细胞在pH 3.5条件下可以合成更多ATP，以满足生长和代谢的需要。血红素：血红素一般用作药物和保健品,有载氧、贮氧、促进氧化还原、进行电子传递等重要生物学功能、可用作半合成血卟啉(HP)及其衍生物(HPD)、原卟啉钠原料，也可用作肉类食品添加剂,主要作着色剂使用。因此可以以藏羊血为原料，进行血红素系列产品的生产，必将得到广大消费者的认可。 http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/1ddb091f4370a71a6accb5f1e926d68e.jpg&p=582x622&q=30 图3 不同pH值条件下的HK和IDH活性
Fig. 3 Activities of HK and IDH under different pH conditions
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/2a80cdefe17fb33cd749321c669d6c1a.jpg&p=618x324&q=30 图4 不同pH值条件下的ATP合成酶活性
Fig. 4 Activity of ATP synthase under different pH conditions
2.4 胞内能量代谢物质水平及比率http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/0dd9a6656c6a39f063902d9bfed128b0.jpg&p=638x612&q=30
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/70963d3fcfb56ec8bb31de03a793187b.jpg&p=600x654&q=30 图5 不同pH值条件下的胞内能量代谢物质含量及比率
Fig. 5 Intracellular levels and ratios of energy metabolism substances under different pH conditions
为了考察pH值对酵母能量代谢的影响，对胞内与能量代谢有关的辅因子物质（NADH、NAD+、ATP和ADP）含量进行测定。图5结果表明，不同pH值条件下的胞内NADH和ATP含量均在第30小时达到最高水平，且pH 3.5比pH 2.5和pH 5.0的水平更高。与此同时，NADH/NAD+和ATP/ADP比率在30 h后均处于较为稳定的水平，其中pH 3.5时的比率更高，体现出弱酸胁迫环境下NADH和ATP具有更强的再生能力，为胞内能量物质的充足供给提供有力保障。迁回后的察哈尔蒙古人仍被编为一苏木，在坤都山一带过冬，噶吉尔墩地方过夏。每一苏木由一名副总管负责管理。[注]加·奥其尔巴特、吐娜等著：《察哈尔蒙古西迁新疆史》第十五章第一节“一苏木察哈尔的戍边”，新疆人民出版社，2013年，第237页。察哈尔一苏木蒙古人继续坚守着卡伦、台站的驻防任务，从而为新疆西北边疆的稳固和社会的安定做出了贡献。 2.5 胞内氧化还原环境http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/26c2b5cfed4b0a41d23ca7cba7d0e3ea.jpg&p=602x686&q=30 图6 不同pH值条件下的CAT和SOD活性
Fig. 6 Activities of CAT and SOD under different pH conditions
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/bdf38d2c6a3d7b06085330d8022e8d5d.jpg&p=630x314&q=30 图7 不同pH值条件下的胞内MDA含量
Fig. 7 Intracellular contents of MDA under different pH conditions
为考察pH值对酵母胞内氧化还原环境的影响，测定CAT、SOD活性以及MDA含量，结果见图6、7。可以发现，当pH 2.5时的不同培养时间下CAT、SOD活性和MDA含量与对照（pH 5.0）相比没有显著差异；而pH 3.5时的CAT活性明显高于对照，SOD活性变化不大，而胞内MDA含量则相应下降。以上结果表明，弱酸胁迫有利于CAT活性的提高，同时也有助于保护细胞和细胞膜免受氧化应激损伤。3 讨 论酸胁迫常见于食品发酵工业中。一般认为，环境中较低的pH值将促使H+通过细胞膜渗漏进入胞内，导致微生物胞内pH值下降，进而影响胞内的一系列生化以应和细胞的正常生长与代谢。为适应酸胁迫环境，维持胞内pH值的相对稳定，微生物细胞已经进化出多种调节机制，主要包括：消耗ATP将H+泵出胞外、通过激活特定酶系消耗胞内的H+、诱导细胞合成伴侣蛋白以修复损伤、改变细胞膜结构以保护细胞免受伤害等。此外，有研究结果表明，GSH在微生物抵抗酸胁迫过程中也具有积极作用，GSH可以通过作为“自杀式”消耗的底物阻止胞内pH值的快速下降。本研究利用GSH的这种生理特性，通过对产朊假丝酵母进行弱酸胁迫处理，实现了高密度培养条件下的GSH过量合成，酵母细胞的SAM合成能力也有明显提高。在此基础上，对弱酸胁迫在SAM和GSH联合高产中的作用及其生理机制进行了解析。在酵母细胞内，SAM和GSH均属于甲硫氨酸代谢途径中的关键节点物质。在甲硫氨酸供给充足的前提下，关键酶MAT和γ-GCS活性的提高将有利于SAM和GSH的过量合成。本研究结果表明，强酸胁迫条件下的MAT和γ-GCS活性均受到部分抑制，而弱酸胁迫则有助于将关键酶活性维持在更高的水平。因此，弱酸胁迫提高了产朊假丝酵母合成SAM和GSH的能力，从而进一步提升了高密度培养下SAM和GSH的联产量。叶晓晓不慌不忙，眨着单眼皮的小眼睛微微一笑，说：“从我的眼神。我的眼睛告诉你的是纯真，不是隐晦和暗示什么。” 除物质代谢以外，能量代谢物质ATP的供给与消耗也是决定SAM和GSH能否过量合成的重要因素。产朊假丝酵母利用葡萄糖进行好氧生长和代谢时，中心代谢途径中HK和IDH以及ATP合成酶的活性将影响到葡萄糖的消耗、NADH和ATP的形成。通过对不同pH值条件下HK和IDH活性进行比较，发现弱酸胁迫虽然对IDH活性影响不大，但提高了HK活性，加速了葡萄糖的利用，有利于NADH的形成。同时，ATP合成酶活性在弱酸胁迫条件下也有明显的提高，从而加快了从NADH到ATP代谢的进程。结合胞内NADH和ATP水平、NADH/NAD+和ATP/ADP比率结果可以得出，弱酸胁迫促进了能量代谢物质的合成和再生，为SAM和GSH过量合成所需ATP提供了充足的保障。微生物细胞在遭遇胁迫环境时，容易产生自由基而影响到胞内氧化还原环境。胞内消除自由基损伤的机制主要包括具有抗氧化能力的酶类和还原性物质。本研究的CAT和SOD活性结果表明，产朊假丝酵母抵抗弱酸胁迫可能主要依赖于CAT活性的提高，而在强酸胁迫条件下的抵抗机制应该更多地来自于还原性物质的保护。MDA是生物体内脂质与自由基发生过氧化以应的产物，其含量的高低通常体现出细胞膜脂质的过氧化程度和细胞损伤程度。本研究弱酸胁迫下的MDA含量低于强酸胁迫和pH 5.0时的结果，表明该条件下的胞内氧化还原环境更加有利于细胞维持正常的结构和功能，这一方面得益于胞内更高的CAT活性，另一方面也要归功于胞内更高的GSH含量。综上，本实验考察并比较了不同pH值条件下的产朊假丝酵母高密度培养过程，发现弱酸胁迫有利于提升SAM和GSH的合成能力，进而提高了SAM和GSH的联产量。在分析发酵动力学参数的基础上，结合SAM和GSH生物合成关键酶活性、能量代谢物质的水平与比率，以及胞内氧化还原水平，部分解析了弱酸胁迫促进SAM和GSH联合高产的生理机制。研究结果有助于深入理解酵母细胞响应酸胁迫的生理机制，同时也为提高SAM和GSH联产发酵产量提供了一种可行的思路。参考文献： KANAI M, MIZUNUMA M, FUJII T, et al. 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Effect of Acid Stress on the Biosynthesis of S-Adenosylmethionine and Glutathione and the Underlying Physiological MechanismWANG Dahui, XU Ruoyang, LI Dechao, WEI Gongyuan*
(School of Biology and Basic Medical Sciences, Soochow University, Suzhou 215123, China)Abstract: The effect of different pH conditions on the biosynthesis of S-adenosylmethionine (SAM) and glutathione(GSH) by Candida utilis under high cell density culture was investigated. Moderate acid stress (pH 3.5) was found to be beneficial for SAM and GSH biosynthesis and consequently the high-yield co-production of SAM and GSH by the yeast cells. By measuring the key enzymes activities, energy supply, and the intracellular redox environment, moderate acid stress was shown to be able to increase the activities of SAM synthase, γ-glutamylcysteine synthase, hexokinase, ATP synthase and catalase, and elevate the intracellular levels and regeneration abilities of NADH and ATP, thereby ensuring sufficient substance and energy supply for the over-production of SAM and GSH. Results obtained in this study present adequate evidence to reveal the physiological mechanism of moderate acid stress in improving SAM and GSH biosynthesis, which may provide a feasible idea for the over-production of other similar small molecular bioactive compounds.Keywords: Candida utilis; S-adenosylmethionine; glutathione; co-production; acid stress
收稿日期：2019-03-14基金项目：国家自然科学基金面上项目（21376155；21506136）第一作者简介：王大慧（1975—）（ORCID: 0000-0001-8629-8706），女，教授，博士，研究方向为食品微生物与生物技术。E-mail: wangdh@suda.edu.cn*通信作者简介：卫功元（1975—）（ORCID: 0000-0002-7621-8407），男，教授，博士，研究方向为发酵工程。E-mail: weigy@suda.edu.cnDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190314-194中图分类号：TS201.3文献标志码：A文章编号：1002-6630（2020）10-0061-07引文格式：王大慧, 徐若烊, 黎德超, 等. 酸胁迫对S-腺苷甲硫氨酸和谷胱甘肽生物合成的影响及其生理机制. 食品科学, 2020,41(10): 61-67. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190314-194. http://www.spkx.net.cnWANG Dahui, XU Ruoyang, LI Dechao, et al. Effect of acid stress on the biosynthesis of S-adenosylmethionine and glutathione and the underlying physiological mechanism. Food Science, 2020, 41(10): 61-67. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190314-194. http://www.spkx.net.cn
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