离子液体结合超声辅助和双水相萃取提取分离柑橘果皮中...
离子液体结合超声辅助和双水相萃取提取分离柑橘果皮中黄酮类化合物离子液体结合超声辅助和双水相萃取提取分离柑橘果皮中黄酮类化合物范晓伟，冉 露，郭 箐，李 迪，孙颖迪，周宋蕊，陈 宁，许美琳，易伦朝，任达兵*（昆明理工大学农业与食品学院，云南 昆明 650500）摘 要：利用离子液体作为提取溶剂，结合超声辅助提取以及双水相萃取技术对柑橘果皮中的黄酮类化合物进行提取、分离及纯化。通过比较9 种离子液体的提取率，发现三丁基己基溴化膦（Br）对柑橘果皮中的黄酮类化合物具有最高的提取率（56.15 mg/g）。采用单因素试验结合响应面分析法优化超声辅助提取条件，获得最佳提取条件为：Br质量分数54%、料液比1∶10（g/mL）、提取温度50 ℃、超声时间10 min。最佳条件下，柑橘果皮中的黄酮类化合物提取率为69.13 mg/g。超声辅助提取结束后，添加柠檬酸钠构建Br-柠檬酸钠双水相体系，通过双水相萃取进一步分离纯化提取液中的黄酮类化合物。考察双水相体系的系线长度和相比对萃取率的影响，结果表明系线长度为71.95且相比为1.13时，黄酮类化合物的萃取效率最高，可达98.20%。双水相萃取结束后，采用正丁醇对黄酮类化合物进行以萃取，回收率可达80.11%。关键词： 柑橘果皮；黄酮；离子液体；双水相；萃取分离柑橘是世界产量第一的水果种类，也是我国产量第二的水果。柑橘加工过程中，会产生大量的果皮和果渣，约占湿质量的40%～50%。然而，除少数柑橘果皮用于中药生产和香精油提取外，大部分柑橘皮渣被当作废料直接丢弃。值得指出的是，柑橘废弃皮渣中含有黄酮、果胶、天然色素等多种有效成分。张玉等测定了宫川温州蜜柑、衢州桠柑、哈姆林甜橙、常山胡柚和蕉柑果皮中橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷3 种黄烷酮化合物，其含量在4.730 4～8.798 1 mg/g之间。其中，黄酮类化合物如橙皮苷和芸香柚皮苷具有抗氧化、抗炎、抗癌等重要的生物活性，在食品、化妆品及医药等领域具有重要的开发价值。提取、分离和纯化对柑橘黄酮的开发利用具有重要意义。传统的柑橘黄酮提取分离技术有冷凝回流提取法、超声波辅助提取法、水浴浸提法、微切变-助剂互作技术辅助提取法等。“物联网”概念由国际电信联盟(ITU)在《ITU:2005:物联网》报告中被提出来，这是一种集合了多种设备信息的智能化网络，其中包括全球定位信息、红外感应器以及射频识别等，它们经过传感器处理后赋有了自动管理与识别的功能。在这个物联网时代背景下，各项业务工作与信息系统逐渐实现了融合，出现了越来越多的信息系统解决方案。传统设备管理固然有一定的优势，但随着信息技术的发展，很多企业在比较设备管理与标识方法中都统一性的制定出了以物联网技术为中心的设备智能化管理系统方案，同时将当下应用最为普遍的二维码贴于所有设备上，设备管理与维修工作的开展通过移动端的扫描功能就得以实现。 离子液体被认为是21世纪的绿色溶剂之一，其主要由有机阳离子和无机阴离子构成，具有蒸汽压低、热稳定性和化学稳定性高、潜在回收率高等特点。目前，离子液体作为提取溶剂已经成功应用在医药、化妆品以及食品领域。Gutowski等基于离子液体提出了一种新型的液液萃取分离技术，即离子液体双水相萃取技术。双水相萃取技术是近年来出现的一种极有前途的新型分离技术，具有分相时间短、条件温和、易于工艺放大和连续操作等优点。基于离子液体的各种优点，离子液体双水相溶液酸度范围较宽、不易乳化、界面清晰、黏度小、不需要挥发性有机溶剂、生物相容性好、离子液体经简单处理可重复再利用。鉴于离子液体的不易挥发性，很难像传统有机溶剂一样通过蒸发手段回收离子液体提取液中的目标化合物。目前，离子液体双水相体系已经成功应用于萃取分离不同类型的化合物，如蛋白质、抗菌素、金属离子、医药生物分子等。主爆孔：孔径90mm、间排距4m×3m，单耗0.4g/m3，堵塞长度 3.0m，单孔装药量 40kg。 由于离子液体在萃取分离领域具有广阔的应用前景，本研究拟采用离子液体作为提取溶剂，结合超声辅助提取技术以及双水相萃取技术对柑橘果皮中的黄酮类化合物进行提取、分离及纯化。本研究不仅为水果加工副产物中活性成分的回收提供一种技术支持，还可为实现水果加工副产物的高值化利用研究提供一定的参考依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂蜜橘 浙江市购；正丁醇、氯仿、异丙醇、乙酸乙酯（均为分析纯） 天津市大茂化学试剂厂；甲醇、乙腈（均为质谱级） 德国默克公司；橙皮苷（纯度＞98%）、芸香柚皮苷（纯度＞99%） 成都曼思特生物科技有限公司；三丁基己基溴化膦（Br）、三丁基乙基溴化膦（Br）、四丁基溴化膦（Br）、氯化三甲基羟乙基胺（Cl）、三甲基羟乙基胺高氯酸盐（）、三甲基羟乙基胺硝酸盐（）、三甲基羟乙基胺双腈铵盐（）、三甲基羟乙基氢氧化铵（）、三甲基羟乙基胺四氟硼酸盐（）（纯度均＞99%） 上海成捷化学有限公司。1.2 仪器与设备NexeraXR超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）仪 日本岛津公司；LGJ-12型真空干燥冷冻机 北京松源华兴科技发展有限公司；HSZ-A型水浴恒温振荡器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TGL-16M高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；HU-20500B超声波清洗器 天津市恒奥科技发展有限公司；FAMO-10F超滤型超纯水机南京权坤生物科技有限公司；FE28 pH计 上海梅特勒-托利多仪器有限公司。1.3 方法1.3.1 样品的收集与前处理将购买回的蜜橘进行果皮和果肉的分离后，蜜橘果皮进行冷冻干燥48 h。干燥后的果皮打粉并过80 目筛后放置于干燥阴凉处备用。1.3.2 标准溶液的制备准确称取芸香柚皮苷和橙皮苷标准品各2 mg，用纯甲醇溶解后定容至10 mL，获得质量浓度为0.2 mg/mL的混标溶液。标准溶液用于柑橘果皮提取物中主要黄酮类化合物的定量分析。1.3.3 离子液体-超声辅助提取准确称取0.100 g柑橘果皮粉末于5 mL离心管中，随后按照特定的料液比加入一定量的离子液体溶液，涡旋混合均匀后进行超声波辅助提取（100 W，10 min）。提取结束后，将提取液进行离心（8 000 r/min，10 min），收集上清液。取1 mL上清液，加入50%乙腈溶液稀释5 倍，过0.22 μm微孔滤膜后进行UPLC分析。根据UPLC定量分析结果，计算柑橘果皮中黄酮类化合物的提取率。由于芸香柚皮苷和橙皮苷是柑橘果皮提取物中的重要成分，本实验利用两者的含量之和代替总黄酮含量考察各试验因素。每个样品需做3 次平行。提取率（Y）通过式（1）进行计算：http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/e4f6ebc394c34f24e041282c5b20f1e9.jpg式中：mt为体系中加入的柑橘果皮粉末总质量/g；C为提取液中黄酮类化合物质量浓度/（mg/mL）；V为提取液的体积/mL。1.3.4 相图的绘制及系线的测定本研究采用柠檬酸钠和离子液体Br构建双水相体系，在常温常压下采用浊点滴定法测定和绘制双水相体系的相图。操作方法简单说明如下：1）于5 mL离心管中加入0.5 mL质量分数40%柠檬酸钠溶液，然后向离心管中逐滴加入质量分数70%的Br溶液，记录离心管中溶液变浑浊时所用Br的溶液质量；2）继续逐滴加入纯水至溶液变澄清，记录所用水的质量。重复上述步骤，直至获得足够的数据，以柠檬酸钠的质量分数为横坐标，Br的质量分数为纵坐标作图，即可获得双水相体系的双结线。相图中的系线根据Salamanca等提出的重量分析法进行测定。在双水相相图的两相区域选择合适的点，根据离子液体和有机盐的质量分数配制两相体系。待两相体系静置2 h完全平衡后，离心分层，分别称取上、下相的质量，最后根据杠杆原理计算系线的组成。系线长度按式（2）计算：本研究结合不同的植物mtDNA提取方法，并对前期本实验室使用的提取方法作出改进，优化了差速离心过程中的离心力与离心时间，最大程度地去除了经组织捣碎机捣碎后的一些细胞杂质，从而获得了大量非纯化线粒体，并进一步针对蔗糖密度梯度铺设比例作出改进。结果表明，改进后的方法能够完全去除叶绿体等杂质污染，最终获得纯净的线粒体。 http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/d35ee65aaad4c7ef07559d3d4a54cb9b.jpg
式中：TLL为系线长度；W1t、W1b分别代表离子液体在上相和下相中的质量分数；W2t、W2b分别代表盐在上相和下相中的质量分数。学生对教学的配合是其“主动性”发挥的重要表现，这可以从学生的气质上、情绪上以及交流方式的变化上观察到：比如，微笑、赞同的眼光、专注及微带严肃的神情；又如，情绪稳定、较为兴奋、专注且表情自然；另外，愿意交流、自愿讨论、接受评价、好问等等，这些都视为学生主动配合的表现。反之，就意味着着“主动性”不足，教学过程出现了异常，需要紧急调整和改变方法、步骤。值得一提的是气馁、萎靡不振是“主动性”下降或开始降低的标志。 1.3.5 双水相萃取分离柑橘果皮中的黄酮类化合物在含有Br提取液的离心管中加入一定量的柠檬酸钠溶液，充分混合后8 000 r/min离心10 min。离心分层后，记录上、下相体积，并取上、下相各1 mL进行UPLC分析。利用UPLC分析获得黄酮类化合物的质量浓度后，通过式（3）、（4）计算体系的相比（R）和萃取率（EE）。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/f3c686d25c44d8929dfd8893b652dfd0.jpg
式中：Vt和Vb分别代表上相和下相的体积/mL。Ct和Cb分别代表上相和下相中黄酮类化合物的质量浓度/（mg/mL）。1.3.6 UPLC分析色谱柱：C18柱（2.0 mm×75 mm，2.2 μm），柱温35 ℃。流动相A为0.1%（V/V）甲酸溶液，B为乙腈溶液，流速0.2 mL/min，进样量1 μL，检测波长280 nm。洗脱梯度为0～4 min，20%～30% B；4～4.1 min，30%～50% B；4.1～10 min，50%～60% B；10～11 min，60%～20% B。1.4 数据统计分析显著性差异采用IBM SPSS Statistics 21.0进行分析，P＜0.05，差异显著。响应面试验数据采用Design-Expert 8.0.6进行分析。Origin 2018软件用于所有的图形绘制。10月23日，世界上最长的跨海大桥开通，横跨珠江口蜿蜒34英里，形成了中国规划的连通11个城市的南部经济区（粤港澳大湾区）的支柱。 2 结果与分析2.1 标准溶液和柑橘果皮样品的UPLC分析本研究首先通过UPLC分析柑橘果皮提取物的成分，结果如图1所示。根据和标准品的保留时间相比，共鉴定出芸香柚皮苷与橙皮苷2 种主要化合物。峰面积结果表明芸香柚皮苷与橙皮苷的峰面积之和占到总峰面积的90%以上，因此使用芸香柚皮苷与橙皮苷作为柑橘黄酮的代表，用于评价后续试验因素。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/62d145e93aff5937cd8bdb4e12afe6d1.jpg&p=594x334&q=30 图1 混合标准品溶液（a）和柑橘果皮样品（b）的UPLC图
Fig. 1 UPLC of mixed standard solution (a) and flavonoids extracted from citrus peel (b)
2.2 离子液体-超声辅助提取2.2.1 离子液体的筛选《“一带一路”沿线资源环境与社会发展特征分析》汲取最新研究成果，运用多学科交叉和集成创新思路.在技术方案设计上，涵盖“数据采集-信息提取-模型方法-应用分析”全链条；同时聚焦重点区域、典型问题，面向目标设定切实可行的设计方案，充分利用中国科学院地理科学与资源研究所已有的基础地理、资源环境、人文与发展等空间大数据成果，强调学科和理论方法的综合与互补，综合集成研究团队在资源环境与人文发展领域方面研究的优势，充分利用丰富的研究基础和大量的数据、技术积累，拓展研究视野，形成重大产出成果. 本研究对6 种胆碱类离子液体和3 种季鏻盐类离子液体的提取率进行了比较，结果如图2所示。方差分析结果表明，除外，3 种季鏻盐类离子液体对柑橘果皮黄酮的提取率显著高于其余胆碱类离子液体（P＜0.05）。其中，Br的提取率最高，对柑橘果皮黄酮的提取率达到56.15 mg/g。与Br和Br相比，Br具有更长的碳链长度。碳链长度的增加能够增强离子液体的疏水性，有利于其与疏水性黄酮类化合物间的相互作用，提高黄酮类化合物提取率。因此，选择Br作为提取溶剂进行后续研究。最广泛的墙板竖向连接方法，是预埋钢筋和灌浆套筒的连接方式。也就是说要在上层墙板内底部，把套筒预埋其上，并在下层墙板顶把竖向插筋预留于其上，同时将在和底部有一定距离的地方，把灌浆孔预留于其上。在灌浆前，需固定好，并确定墙板位置的精准性。通常情况下，水泥为选取灌浆材料，主要原因是其整体性好，强度高，可实现对多种预制装配式混凝土构件的连接，同时有效控制裂缝的产生，流动性好，操作方便快捷。但是，不乏会有一定的缺点存在于其中，也就是说灌浆套筒的高价会整体上提升造价。 http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/6edc00a9c066060243e595f6c2bc113f.jpg&p=668x540&q=30 图2 离子液体类型对柑橘果皮黄酮提取率的影响
Fig. 2 Effects of IL types on the extraction yield of flavonoids from citrus peel
2.2.2 单因素试验结果http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/d895adf60ed7bda5b0c393e8cc68740f.jpg&p=650x1562&q=30 图3 离子液体质量分数（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）和pH值（E）对柑橘果皮黄酮提取率的影响
Fig. 3 Effects of IL concentration (A), solid-to-liquid ratio (B),ultrasonication time (C), extraction temperature (D), and pH (E) on the extraction yield of flavonoids from citrus peel
本研究对离子液体质量分数（30%～70%）、料液比（1∶10～1∶50（g/mL））、提取时间（5～40 min）、提取温度（20～60 ℃）、pH值（3～11）共5 个单因素进行考察。不同单因素条件下，柑橘果皮中黄酮类化合物的提取率如图3所示。方差分析结果表明，离子液体浓度、料液比、提取时间以及提取温度均对柑橘果皮黄酮的提取率存在显著性影响（P＜0.05），而pH值无显著性影响。如图3A所示，当离子液体质量分数低于40%时，随着离子液体质量分数的增加，提取率有明显的提升，当离子液体质量分数高于50%时，提取率开始下降。离子液体质量分数增加会导致溶剂体系的黏度增加，降低溶剂渗透到植物组织的能力，从而阻碍了黄酮类化合物在溶液中的溶解。如图3B所示，当料液比为1∶20（g/mL）时，溶剂可能渗透不完全，使得其提取率低。随着液体使用量的增加，样品和溶剂之间的接触面积随之增加，提高了溶剂对目标黄酮的提取量。然而，料液比低于1∶20时，可能存在稀释效应导致提取率缓慢下降。因此，最优料液比为1∶20（g/mL）。如图3C所示，超声时间在10 min时达到最好的提取效果。超声时间越长，溶剂与柑橘果皮粉末中的组织接触越彻底，然而黄酮类化合物在较长的超声时间下可能会降解，从而导致提取率降低。如图3D所示，随着温度从20 ℃升至40 ℃，柑橘果皮中的黄酮类化合物的提取率随着温度升高而增加。这是因为适当的高温可以降低离子液体溶液的黏度，加速溶质的传质。但是，当温度高于40 ℃时，提取率下降，可能是由于较高的温度导致黄酮类化合物的结构受到破坏。参照AACC 76-21.01方法进行测定，测试中淀粉和魔芋胶的质量比为 10：0，9.5：0.5，9.0：1.0，8.5：1.5，8.0：2.0。准确称量后转移到样品筒中，测试开始前通过搅拌桨搅动样品使其充分分散、混合。 我完全被搞蒙了，抬起头才发现，爸妈的视线并没有停在我身上，而是在瞪着秦晴。妈妈的声音更高了：“我在你房间里找到你画的漫画了，马上就要大考了，怎么又分心？你和你姐又不一样……” 2.2.3 响应面法优化离子液体-超声辅助提取条件综合单因素试验结果，选择离子液体质量分数、料液比以及提取温度为考察因素，根据响应面分析法Box-Behnken原理进行响应面试验。响应面试验设计方案及结果见表1。表1 Box-Behnken试验设计与结果
Table 1 Arrangement and results of three-factors/three-level Box-Behnken designhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/6fc0773f410caef70f8441e6a823da05.jpg&q=30 试验号 A离子液体质量分数/%Y黄酮提取率/（mg/g）1 40 1∶20 30 58.78 2 50 1∶20 40 60.48 3 60 1∶30 40 58.17 4 50 1∶30 50 60.35 5 40 1∶10 40 58.58 6 40 1∶20 50 60.35 7 60 1∶20 30 53.40 8 40 1∶30 40 58.31 9 60 1∶10 40 57.13 10 50 1∶20 40 60.44 11 50 1∶10 30 51.93 12 50 1∶30 30 61.46 13 50 1∶20 40 60.27 14 50 1∶10 50 69.76 15 50 1∶20 40 61.67 16 50 1∶20 40 60.48 17 60 1∶20 50 64.17 B料液比（g/mL）C超声温度/℃
运用Design-Expert 8.0.6数据分析软件对表1中的试验结果进行多元回归分析，得到黄酮提取率（Y）与离子液体质量分数（A）和提取温度（C）的二次回归方程为：Y＝60.67-0.39A+0.11B+3.63C+0.33AB+2.30AC-4.74BC-2.16A2-0.46B2+0.67C2。对回归模型进行方差分析，由表2可知，该回归模型影响极为显著（P＜0.000 1），且失拟项不显著（P=0.196 0＞0.05），模型的回归系数R2为0.984 7，表明模型对实验值拟合结果良好。因此，可以利用拟合得到的模型对试验结果进行分析和预测，获得最佳试验条件。分别对各因素进行显著性分析，发现C、AC、BC、A2对应的P＜0.05，说明这几个因素对柑橘果皮中黄酮类化合物的提取率产生显著性影响。表2 响应面二次回归模型的方差分析
Table 2 Analysis of variance for the response surface quadratic regression modelhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/5ca59003502c1dba12d285cdb2d1df10.jpg&q=30 变异来源 自由度 平方和 均方 F值 P值模型 9 240.30 26.70 50.01 ＜0.000 1 A离子液体质量分数 1 1.24 1.24 2.31 0.172 0 B料液比 1 0.098 0.098 0.18 0.681 8 C提取温度 1 105.49 105.49 197.58 ＜0.000 1 AB 1 0.43 0.43 0.81 0.397 1 AC 1 21.16 21.16 39.64 0.000 4 BC 1 89.69 89.69 168.00 ＜0.000 1 A2 1 19.65 19.65 36.80 0.000 5 B2 1 0.89 0.89 1.68 0.236 5 C2 1 1.87 1.87 3.51 0.103 2残差 7 3.74 0.53失拟项 3 2.45 0.82 2.53 0.196 0纯误差 4 1.29 0.32总误差 16 244.04
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/42fb1622f709f9cadea13c7f1f516478.jpg&p=554x768&q=30
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/b95e4f9b23a42d5148aa0310795a4dae.jpg&p=528x354&q=30 图4 各因素交互作用对黄酮类化合物提取率的响应面分析
Fig. 4 Response surface plots for the interactive effect of various factors on the extraction yield of flavonoids
图4 为以黄酮提取率为响应值，离子液体质量分数、料液比和提取温度之间交互作用的三维响应面图。通过响应面分析法优化出离子液体-超声辅助提取柑橘果皮黄酮的最佳条件为离子液体质量分数53.68%、料液比1∶10（g/mL）、提取温度50 ℃，在此条件下柑橘果皮中黄酮的提取率理论上可达69.42 mg/g。实际提取时，调整试验条件为离子液体质量分数54%、料液比1∶10（g/mL）、提取温度50 ℃，在此条件下柑橘果皮黄酮的实际提取率为69.13 mg/g，与理论值非常接近，说明模型预测结果比较准确。2.3 离子液体双水相萃取分离柑橘果皮黄酮2.3.1 双水相体系相图的绘制针对表2的统计内容，不得不说的就是贯穿全文的“自然之道”，但在分析这个问题之前必须要理解“道”在《文》中的含义。学者们对“道”这个概念的阐述可谓众说纷纭，其中我个人比较同意郭宝军先生的见解，即“道”在全书中主要有三个含义：一是宇宙本源的道；二是道家自然而然的道；三是儒家的社会伦常之道。 浙江省“2018 寻找最美田野”航拍摄影大赛评选揭晓(胡盛东等） ................................................................7-15 本研究采用双水相萃取对Br提取液中的黄酮类化合物进行进一步的分离和纯化。柠檬酸钠属于有机盐，易于生物降解，对环境污染小。因此，采用柠檬酸钠和Br构建双水相体系，并测定其相图，结果如图5所示。可以看出，柠檬酸钠能够很好地和Br形成两相体系，具有较宽的两相区域，该双水相能够应用于Br提取液中黄酮类化合物的萃取分离。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/11555cb48cf08f2444cb33319cf3765d.jpg&p=684x312&q=30 图5 Brhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/defd35860d9bde3b3e9b5909fc05c8f2.png柠檬酸钠http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/2bf5e3f68567669eeb4576c02ab90bd5.png水ATPS体系相图（25 ℃）
Fig. 5 Phase diagram of ATPS composed of Br, sodium citrate and water at 25 ℃
2.3.2 系线长度对萃取率的影响不同的系线对应着不同的溶剂组成，因此系线长度是影响双水相萃取率的重要参数。通过控制上、下相体积比约为1，本研究考察了4 种不同系线长度（58.63、71.95、80.29和83.88）对黄酮萃取率的影响。如图6A所示，当相比相等或相近时，黄酮类化合物的回收率随着系线长度的增加呈现先增加后几乎不变的趋势。具体而言，系线长度由58.63增加到71.95时，黄酮类化合物的回收率显著增加（P＜0.05），系线长度超过71.95，黄酮类化合物的回收率没有明显变化（P＞0.05）。根据双水相相图，系线长度增加表明柠檬酸钠含量增加，因此盐析能力增强，有利于化合物分配到离子液体相，提高萃取效率。因此，选取系线长度为71.95的双水相体系进行后续实验。2.3.3 相比对萃取率的影响如图6A所示，系线相同时，系线所有的点均具有相同的上、下相溶剂组成，但它们的相比不同。为了考察上、下相溶剂组成相同时相比对萃取率的影响，本研究在系线长度为71.95的系线上选择5 个不同的点进行测试。如图6B所示，黄酮类化合物的萃取率随着相比的增加呈现先增加后降低的趋势。当相比由0.34增加到1.13时，黄酮类化合物的萃取率随相比增加而增加，相比在1.13时萃取率达到最大（98.20%），这是由于上相体积的增加能够溶解更多的溶质。而当相比高于1.13达到1.46时，黄酮类化合物的萃取率有所降低，这主要是因为过多的上相可能存在稀释效应，不利于溶质的萃取。因此，选择系线长度为71.95且相比为1.13的双水相体系对黄酮类化合物进行萃取分离，萃取率最终达到98.20%。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/2a8f3a4586d81a1ccdd4d5a838f2763e.jpg&p=642x682&q=30 图6 系线长度（A）和相比（B）对黄酮萃取率的影响
Fig. 6 Effects of tieline length (A) and phase ratio (B) on the extraction efficiency of flavonoids
2.4 黄酮类化合物的分离以及离子液体的回收以萃取是一种从离子液体溶液中分离溶质的有效方法。Bogdanov等曾报道了一种用疏水有机溶剂分离和回收离子液体的方法。本研究考察了正丁醇、氯仿、乙酸乙酯、正己烷和乙醚5 种以萃取溶剂的以萃取效果。如图7所示，正己烷和乙醚没有以萃取能力（回收率为0.00%），氯仿和乙酸乙酯均具有一定的以萃取效果，但两者的回收率明显低于正丁醇的回收率。最终，选择正丁醇为以萃取溶剂对双水相中的黄酮类化合物进行分离，回收率能够达到80.11%。将正丁醇萃取液进行旋转蒸发后干燥，测定出以萃取的黄酮类化合物纯度为76.10%。收集以萃取后的离子液体溶液，循环使用其作为提取溶剂，可降低实验成本。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/1eb3382f65068a7c7b4e4af807af2fe8.jpg&p=618x322&q=30 图7 不同有机溶剂对黄酮类化合物的反萃取效果
Fig. 7 Back-extraction efficiencies of flavonoids using different organic solvents
3 结 论本研究利用离子液体-超声辅助提取结合双水相萃取，建立了一种提取、分离和纯化柑橘果皮中黄酮类化合物的有效方法。首先，通过单因素试验和响应面法优化离子液体-超声辅助提取条件，确定最佳提取条件为离子液体质量分数54%、料液比1∶10（g/mL）、提取温度50 ℃、提取时间10 min，在此条件下，柑橘果皮黄酮的提取率为69.13 mg/g。其次，采用柠檬酸钠和离子液体提取液构建双水相体系对提取液中黄酮类化合物进行萃取分离，当系线长度为71.95且相比为1.13时，萃取率高达98.20%。最后，利用正丁醇作为以萃取溶剂，对离子液体富集相中的黄酮进行分离，回收率可达80.11%。本研究为柑橘加工副产物中活性成分的制备分离提供了一种新的方法。参考文献： 方政, 高彦祥. 柑橘加工副产物中有效成分开发利用的研究进展. 中国食品添加剂, 2005(4): 9-13. DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.2005.04.003. 吴剑. 柑橘活性成份及皮渣再利用研究进展. 食品与发酵科技,2013(3): 93-96. DOI:10.3969/j.issn.1674-506X.2013.03-026. SENORANSFJ, RUIZ-RODRIGUEZ A, CAVERO S, et al. Isolation of antioxidant compounds from orange juice by using countercurrent supercritical fl uid extraction (CC-SFE). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(12): 6039-6044. DOI:10.1021/jf010762t. 张玉, 吴慧明, 王伟, 等. 不同品种柑橘果皮中类黄酮含量及其采后变化. 食品科学, 2010, 31(6): 202-204. 吴梅青, 刘捷频, 陈丹. 柑橘黄酮抗氧化和抗肿瘤作用研究进展.亚太传统医药, 2017, 13(1): 83-85. DOI:10.11954/ytctyy.201701034. 陆蓓, 凌明, 应佳, 等. 柑橘黄酮抑菌作用研究. 中华中医药学刊,2010, 28(10): 2042-2043. YI L Z, MA S S, REN D B. Phytochemistry and bioactivity of Citrus fl avonoids: a focus on antioxidant, anti-inflammatory, anticancer and cardiovascular protection activities. Phytochemistry Reviews, 2017,16(3): 479-511. DOI:10.1007/s11101-017-9497-1. 刘洋. 冷凝回流法柑橘皮总黄酮提取工艺的研究. 化工管理,2017(4): 160-161. DOI:10.3969/j.issn.1008-4800.2017.04.108. 李敏, 何亚萍, 柴娟. 柑橘皮总黄酮的提取及抗氧化性研究. 应用化工, 2016, 45(3): 501-503. 李文艺, 张海. 零陵宽皮柑橘果皮中黄酮的提取工艺研究.湖南科技学院学报, 2016, 37(5): 49-54. DOI:10.3969/j.issn.1673-2219.2015.10.018. 吴菲菲, 赵良忠, 徐永平, 等. 微切变-助剂互作技术辅助提取柑橘皮总黄酮的工艺研究. 食品安全质量检测学报, 2016(8): 3234-3239. AO Y Y, YUAN W J, YU T L, et al. Radiolysis of crown ether-ionic liquid systems: identification of radiolytic products and their effect on the removal of Sr(2+) from nitric acid. Physical Chemistry Chemical Physics: PCCP, 2015, 5(17): 3457-3462. DOI:10.1039/C4CP04294H. OLKIEWICZ M, CAPORGNO M P, FONT J, et al. A novel recovery process for lipids from microalgæ for biodiesel production using a hydrated phosphonium ionic liquid. Green Chemistry, 2015, 17(5):2813-2824. DOI:10.1039/c4gc02448f. VANDER HOOGERSTRASTRAETE T, BLOCKX J, DE COSTER H,et al. Selective single-step separation of a mixture of three metal ions by a triphasic ionic-liquid-water-ionic-liquid solvent extraction system. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany), 2015,21(33): 11757-11766. DOI:10.1002/chem.201500825. 汪亚美, 王新承, 李顺杰, 等. 聚合离子液体在催化转化果糖制备乳酸中的应用. 有机化学, 2015, 35(2): 404-410. DOI:10.6023/cjoc201408034. GUTOWSKI K E, BROKER G A, WILLAUER H D, et al. Controlling the aqueous miscibility of ionic liquids: aqueous biphasic systems of water-miscible ionic liquids and water-structuring salts for recycle,metathesis, and separations. Journal of the American Chemical Society, 2003, 125(22): 6632-6633. DOI:10.1021/ja0351802. 曾颖, 曾臻, 陈仲巍, 等. 超声波辅助双水相萃取鲍鱼内脏的β-葡萄糖苷酶. 食品研究与开发, 2019, 40(2): 74-80. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2019.02.015. HAN X X, ARMSTRONG D W. Ionic liquids in separations. Accounts of Chemical Research, 2007, 40(11): 1079-1086. DOI:10.1021/ar700044y. PASSOS H, TRINDADE M P, VAZ T S M, et al. The impact of selfaggregation on the extraction of biomolecules in ionic-liquid-based aqueous two-phase systems. Separation & Purification Technology,2013, 108(16): 174-180. DOI:10.1021/ar700044y. SHA O, ZHU X, FENG Y, et al. Aqueous two-phase based on ionic liquid liquid-liquid microextraction for simultaneous determination of five synthetic food colourants in different food samples by highperformance liquid chromatography. Food Chemistry, 2015, 174:380-386. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.11.068. TAN Z J, LI F F, XU X L, et al. Simultaneous extraction and purification of aloe polysaccharides and proteins using ionic liquid based aqueous two-phase system coupled with dialysis membrane.Desalination, 2012, 286: 389-393. DOI:10.1016/j.desal.2011.11.053. 曾颖, 朱新儒, 余磊, 等. 响应面法优化离子液体双水相萃取木瓜蛋白酶. 食品研究与开发, 2018, 39(20): 36-41. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2018.20.006. 崔丽影, 冯志彪, 姜彬. 离子液体双水相萃取高效液相法检测青霉素G. 食品工业, 2016, 37(1): 294-297. TAN Z J, WANG C Y, YANG Z Z, et al. Ionic liquid-based ultrasonicassisted extraction of secoisolariciresinoldiglucoside from flaxseed(Linum usitatissimum L.) with further purification by an aqueous twophase system. Molecules, 2015, 20(10): 17929-17943. DOI:10.3390/molecules201017929. 宋飞跃, 薛高欣, 白玲, 等. 不同离子液体双水相萃取钯. 应用化学,2019, 36(3): 335-340. DOI:10.11944/j.issn.1000-0518.2019.03.180227. ZAFARANI-MOATTAR M T, GASEMI J. Phase diagrams of some aliphatic alcohols + ammonium dihydrogen phosphate or diammonium hydrogen phosphate + water. Journal of Chemical & Engineering Data, 2002, 47(3): 525-528. DOI:10.1021/je0102863. SALAMANCA M H, MERCHUK J C, ANDREWS B A, et al. On the kinetics of phase separation in aqueous two-phase systems. Journal of Chromatography B Biomedical Sciences & Applications, 1998,711(1/2): 319-329. DOI:10.1016/s0378-4347(98)00173-x. YANG L, GE H, WANG W, et al. Development of sample preparation method for eleutheroside B and E analysis in Acanthopanax senticosus by ionic liquids-ultrasound based extraction and high-performance liquid chromatography detection. Food Chemistry, 2013, 141(3):2426-2433. DOI:10.1016/j.foodchem.2013.05.094. YANG L, LIU Y, ZU Y G, et al. Optimize the process of ionic liquid-based ultrasonic-assisted extraction of aesculin and aesculetinfrom Cortex fraxini by response surface methodology. Chemical Engineering Journal, 2011,175: 539-547. DOI:10.1016/j.cej.2011.09.110. BI W T, TIAN M L, ZHOU J, et al. Task-specific ionic liquid-assisted extraction and separation of astaxanthin from shrimp waste. Journal of Chromatography B, 2010, 878(24): 2243-2248. DOI:10.1016/j.jchromb.2010.06.034. LEI Y, HAN W, ZU Y G, et al. Ultrasound-assisted extraction of the three terpenoid indole alkaloids vindoline, catharanthine and vinblastine from Catharanthus roseus using ionic liquid aqueous solutions. Chemical Engineering Journal, 2011, 172(2): 705-712.DOI:10.1016/j.cej.2011.06.039. YANG Z Z, TAN Z J, LI F F, et al. An effective method for the extraction and purification of chlorogenic acid from ramie (Boehmeria nivea L.) leaves using acidic ionic liquids. Industrial Crops and Products, 2016, 89: 78-86. DOI:10.1016/j.indcrop.2016.05.006. VERMA R, BANERJEE T. Liquid-liquid extraction of lower alcohols using menthol-based hydrophobic deep eutectic solvent: experiments and COSMO-SAC predictions. Industrial & Engineering Chemistry Research, 2018, 57(9): 3371-3381. DOI:10.1021/acs.iecr.7b05270. WONG K H, LI G Q, LI K M, et al. Optimisation of Pueraria isoflavonoids by response surface methodology using ultrasonicassisted extraction. Food Chemistry, 2017, 231: 231-237.DOI:10.1016/j.foodchem.2017.03.068. BOGDANOV M G, KEREMEDCHIEVA R, SVINYAROV I. Ionic liquid-supported solid-liquid extraction of bioactive alkaloids. III. Ionic liquid regeneration and glaucine recovery from ionic liquid-aqueous crude extract of Glaucium fl avum Cr. (Papaveraceae). Separation &Purification Technology, 2015, 155: 13-19. DOI:10.1016/j.seppur.2015.02.003.
Extraction and Separation of Flavonoids from Citrus Peel by Successive Ultrasound-Assisted with Ionic Liquids and Aqueous Two-Phase ExtractionFAN Xiaowei, RAN Lu, GUO Jing, LI Di, SUN Yingdi, ZHOU Songrui, CHEN Ning, XU Meilin, YI Lunzhao, REN Dabing*
(College of Agriculture and Food, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China)Abstract: In this work, ionic liquids (ILs) were used as extraction solvents to extract, separate and purify fl avonoids from citrus peel by successive ultrasound-assisted extraction and aqueous two-phase extraction. Among nine ILs tested, it was found that tributylhexylphosphonium bromide (Br) gave the highest yield (56.15 mg/g) of fl avonoids from citrus peel.Using single factor experiments and response surface methodology, the optimum extraction conditions were determined as follows: Br concentration 54%, solid-to-liquid ratio 1:10 (g/mL), extraction temperature 50 ℃, and ultrasonication time 10 min. Under these optimum conditions, the yield of flavonoids was 69.13 mg/g. After the ultrasound-assisted extraction, an aqueous two-phase system of Br and sodium citrate was constructed by adding sodium citrate and used to further separate and purify the extracted fl avonoids. The results showed that the extraction efficiency of fl avonoids reached 98.20% when the tether length was 71.95 and the phase ratio was 1.13. After the aqueous two-phase extraction, butyl alcohol was used to back extract the fl avonoids with a recovery of 80.11%.Keywords: citrus peel; fl avonoid; ionic liquid; aqueous two-phase system; extraction and separation
收稿日期：2019-04-03基金项目：云南省应用基础研究计划项目（2018FD033）第一作者简介：范晓伟（1995—）（ORCID: 0000-0001-8873-4575），男，硕士研究生，研究方向为食品分离分析。E-mail: 435679895@qq.com*通信作者简介：任达兵（1987—）（ORCID: 0000-0002-7610-7838），男，讲师，博士，研究方向为食品分离分析。E-mail: rendabing425@163.comDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190403-048中图分类号：TS255.1文献标志码：A文章编号：1002-6630（2020）10-0265-07引文格式：范晓伟, 冉露, 郭箐, 等. 离子液体结合超声辅助和双水相萃取提取分离柑橘果皮中黄酮类化合物. 食品科学, 2020,41(10): 265-271. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190403-048. http://www.spkx.net.cnFAN Xiaowei, RAN Lu, GUO Jing, et al. Extraction and separation of flavonoids from citrus peel by successive ultrasoundassisted with ionic liquids and aqueous two-phase extraction. Food Science, 2020, 41(10): 265-271. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190403-048. http://www.spkx.net.cn
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