液相色谱-串联质谱法测定牛排产品中大豆蛋白含量
液相色谱-串联质谱法测定牛排产品中大豆蛋白含量液相色谱-串联质谱法测定牛排产品中大豆蛋白含量李莹莹，张颖颖，任 南，李石磊，赵文涛，田寒友，王守伟*（中国肉类食品综合研究中心，北京 100068）摘 要：建立液相色谱-串联质谱技术测定牛排产品中大豆蛋白含量的方法。首先利用高分辨质谱结合Unitprot数据库，对大豆特异性多肽进行鉴别及筛选，获得可用于大豆准确定性的多肽序列信息，并利用skyline软件将多肽序列转换为离子对信息；其次利用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）对大豆蛋白特异性多肽进行确证，构建大豆蛋白LC-MS/MS定性判别方法；进一步开展用于定量多肽的筛选研究，最终筛选到线性和回收率较好的定量多肽共3 条，分别为GSDLVNVR、VSDDEFNNYK、LVFCPQQAEDDK，线性相关系数均达到0.99以上，加标回收率为81.7%～115.8%，精密度小于13%，检出限为0.15%，定量限为0.5%；同时对市售28 个牛排进行大豆蛋白含量的测定，构建LC-MS/MS方法测定牛排中大豆蛋白含量的方法。结果表明，该方法特异性好，准确度高，同时可推广应用至其他肉制品。关键词： 液相色谱-串联质谱；多肽；牛排；大豆蛋白；定量牛排起源于西方国家，是历史悠久的西式菜肴。近年来我国人民生活水平提高，牛排产品市场快速增长，据行业统计，目前规模以上牛排生产企业已达200余家，牛排的产量也快速增长。目前市售的预包装牛排以牛肉为主料，同时添加淀粉、大豆蛋白等改善牛肉风味。不同工艺的牛排价格差异显著，等级也不同，目前牛排等级划分主要依据蛋白含量。大豆蛋白成本低，加入一定量的大豆蛋白，可以提高蛋白含量，但有些商贩虽然加入了大豆蛋白，但在标签上却未作标注或标注不实，也属于一种欺诈行为。目前缺少大豆蛋白定量的准确方法，在牛排定级上也存在一定的困难，因此，有必要建立适用于牛排产品中大豆蛋白含量测定的方法。大刚惊讶地说：“噫，你还懂得这些？可别瞎蒙啊。”赵大刚是特种部队转业出身，一向对公子哥形象、富二代的刘志武有些看不惯。志武不以为然地说：“我蒙？对这个可是有一定研究的，四肢发达有什么用？干刑警得有知识得有头脑才行。” CNNIC截至2017年12月的统计数据现显示，在线旅游用户规模已达3.76亿，在线旅游预定使用比例占48.7%，网上预定火车票占39.3%，线上预订机票酒店占23%，线上购买旅游度假产品的游客占11.5%。从数据可以看出，手机已经成为出行预定的主要渠道，通过手机订购旅行产品的用户规模已达3.40亿。 传统的蛋白分析方法主要为凯式定氮法。在待测对象中，当大豆蛋白和其他动物蛋白或者植物蛋白成分混合在一起时，需要对不同蛋白成分进行区分。岳巧云等采用实时聚合酶链式以应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）法，以大豆内源基因为参照基因，按比例混合奶粉和含大豆蛋白的配方营养粉进行测定，可以判断奶粉中是否掺入了豆粉。许任伟设计了大豆蛋白的特异性引物和探针，构建了real-time PCR鉴别牛肉制品掺假大豆方法。但PCR技术也存在一定问题，如DNA易受复杂基质干扰、加工过程易降解等。以特异的肽段作为生物标志物的质谱技术在物种定性定量分析展现了强大的技术优越性。该技术以特征肽段为研究对象，肽段的基础氨基酸序列在加工过程中比DNA更为稳定，使其在深加工制品的处理和定量测定方面具有不可比拟的优势。质谱多重以应监测（multiple reaction monitoring，MRM）是针对靶标分子的一种质谱分析技术，注重有限目标的蛋白质定量测定，在蛋白质分析检测应用领域极有发展潜力。国外实验室目前主要针对熟肉制品，包括猪、牛、鸡、马、火鸡等不同的动物物种开展研究工作，而植物蛋白相对研究较少。其中，Josephine等对3 种不同的小麦开展了特异性多肽的筛选，并构建液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）的鉴别方法，可以实现1%添加的鉴别。Alexander等使用Nano LC-MS/MS和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对大豆蛋白进行筛选，最终选择大豆球蛋白G4亚基A4作为鉴定的标记蛋白。Hoffmann等构建高效液相色谱-串联质谱区分肉制品中羽扇豆、豌豆和大豆成分的方法，并利用同位素内标法测定其多肽和所属蛋白的含量。该研究领域由于蛋白类型繁多，涉及蛋白家族，各种亚基，以及不同多肽质谱响应差异显著，开展定量分析难度比较大，研究较少。目前，采用同位素内标法对肉制品中过敏蛋白进行定量测定，以及非标记定量方法定量肉制品中的成分，但鲜见大豆蛋白定量分析相关研究报告。本研究采用高灵敏度、高扫描速度的高分辨质谱系统鉴定大豆蛋白，通过比较和分析寻找其特异性多肽，通过Unitprot数据库进一步筛查确认，以及LC-MS/MS系统验证，筛选大豆蛋白特异性强、稳定性好的多肽，并确证可用于定量分析的多肽，拟建立一套用于大豆蛋白定性定量分析的LC-MS/MS方法，以期实现对于牛排产品中大豆蛋白含量的测定。首先设计跟踪微分器.由于后续非线性状态误差反馈控制律设计中需要系统摆角控制误差及其微分信号，同时也为了限制误差信号的变化率，柔化控制误差信号及其变化率，系统跟踪微分器设计为 1 材料与方法1.1 材料与试剂牛排 市购；大豆分离蛋白（1#）、豌豆蛋白、玉米蛋白、花生蛋白、小麦蛋白 北京美添前景科技有限公司；大豆分离蛋白（2#、3#）、大豆浓缩蛋白（4#、5#） 山东万得福实业集团有限公司；生鲜牛肉来自屠宰场。胰蛋白酶（测序级）、二硫苏糖醇（生化级）美国Promega公司；碘乙酰胺、三氟乙酸（均为生化级） 美国Sigma公司；甲酸、乙酸、乙腈（均为色谱纯） 德国CNW科技公司；HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL） 美国Waters公司；尿素、硫脲、盐酸、碳酸氢铵均为国产分析纯。牛肉-大豆蛋白的混合体系：参照牛排通用的生产工艺，构建牛肉-大豆蛋白的混合体系，大豆蛋白含量根据实验内容适当调整，其他成分按照牛肉（10 g）、水（3.5 g）、淀粉（0.15 g）、三聚磷酸盐（0.04 g）、盐（0.2 g）比例混合备用。其次，城乡居民教育回报率出现了较为明显的“马太效应”。城镇居民教育回报率为12.4%，农村居民教育回报率为10.7%。 1.2 仪器与设备Vanquish UPLC-Q Exactive HF-X液相色谱-高分辨质谱（配有电喷雾离子源及TraceFinder 4.1数据处理系统以及Proteome Discoverer2.8软件）、TSQ ultra EMR LC-MS联用仪（配有电喷雾离子源、TraceFinder 4.1数据处理系统） 美国Thermo Fisher公司；ZWY-110X30往返式水浴恒温摇床 上海智诚分析仪器制造有限公司；JXFSTPRP-II液氮冷冻研磨仪 上海净信发展有限公司；20PR-520离心机 日本Hitachi公司。1.3 方法1.3.1 样品前处理称取0.5 g样品（精确至0.001 g），放置5 mL离心管中，加入2.5 mL缓冲盐提取液（pH 8.0，0.05 mol/L Tris-HCl、6 mol/L尿素溶液、2 mol/L硫脲溶液），打开液氮，冷冻研磨（60 Hz，45 s）2 次后，15 000 r/min离心15 min。取100 μL上清液，放置5 mL离心管，加入50 mmol/L二硫苏糖醇溶液30 μL，56 ℃振荡以应1 h，降至室温后加入100 mmol/L碘乙酰胺溶液33 μL，暗处以应30 min；向上述以应体系中加入50 mmol/L NH4HCO3 100 μL，然后加入20 μg胰蛋白酶，37 ℃以应过夜。放置室温后，加入0.4%三氟乙酸溶液终止以应，准备上样。依次用3 mL乙腈、50%乙腈溶液、0.5%乙酸溶液活化HLB固相萃取柱，全部溶液上样，再依次用3 mL水，0.5%乙酸溶液淋洗，最后用2 mL乙腈-0.5%乙酸（6∶4，V/V）洗脱，过0.22 μm滤膜，待测。1.3.2 液相色谱-高分辨质谱分析LC条件：Hypersil GOLD C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流动相：A为0.1%甲酸-水，B相为0.1%甲酸-乙腈；洗脱程序：0～2 min，5% B；2～10 min，5%～40% B；10～16 min，40%～80% B；16～18 min，80%～5% B；流速0.2 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL。MS条件：喷雾电压3.4 kV；毛细管温度320 ℃；离子源雾化温度350 ℃；鞘气压力40 arb；辅气压力15 arb；离子化模式：正模式；扫描模式：Full MS-dd-MS2；全扫描分辨率120 000 FWHM；质量扫描范围m/z 350～1 500；自动增益值为3×106，最大离子注入时间20 ms，二级质谱扫描分辨率为15 000 FWHM，topN为20（前20强），自动增益值为1×105，最大离子注入时间为100 ms，碰撞能量为27 V。学习评价 有效的学习评价有助于增强教学效果。除了传统的形成性评价和总结性评价，为了更全面了解学生的学习态度、兴趣和学习效果，可以通过蓝墨云平台的教学报告和在线测验完成情况对学生的学习过程和学习效果进行评价。通过网络学习的学情报告、课堂教学过程中拓展性学习成果评价和课程考试成绩等三个方面对学生学习效果进行综合评价。 数据分析：用蛋白质组学处理软件Proteome Discoverer（PD 2.8）对高分辨质谱采集的数据进行非标记定量分析，检索数据库为Uniprot对应物种的数据全库，搜索流程按图1进行，最多漏切位点设为2，每个多肽最大平均修饰为3，母离子质量偏差为10×10-6，多肽最小长度为6，其他参数为默认值。我国是农业大国，应该提高农业的信息化水平，实现农业现代化发展。农业信息化需要以人为本，发展农村经济科学，形成良性发展态势。农村经济是我国经济的主体，发展农村经济是增加农民收入、加快农村建设的重要保障，同时也是实现现代社会主义新农村建设的需要，农村经济管理科学化是社会发展对农村经济发展提出的新要求。 http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/fc54395ce8728ed69c935c8bb650b1f7.jpg&p=762x474&q=30 图1 PD软件分析流程图Fig. 1 Workflow of PD analysis
1.3.3 LC-MS/MS分析LC条件：Hypersil GOLD C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流动相：A相为0.1%甲酸-水，B相为0.1%甲酸-乙腈；洗脱程序：0～2 min，5% B；2～10 min，5%～40% B；10～16 min，40%～80% B；16～18 min，80%～5% B；流速0.2 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL。MS条件：喷雾电压3 000 V；离子源雾化温度350 ℃；离子传输管温度300 ℃；鞘气压力45 arb；辅气压力15 arb；碰撞气压强1.5 mTorr；离子化模式：正模式；采集方式：MRM。数据分析：通过PD软件找出大豆物种的专属性多肽链，将多肽序列列表导入到skyline软件，获得每个多肽链的母离子和子离子碎片信息，并将离子信息导入LCMS/MS中，开展MRM扫描，通过对比每组离子对的保留时间、响应强度等信息，对特异性离子对进行筛查，以确定定性离子信息。1.3.4 标准曲线的制作称取0.1 g（精确至0.000 1g）大豆分离蛋白（1#）按照1.3.1节前处理方法，第1步离心后，分别取20、50、100、150、200 μL，质量浓度以大豆蛋白质量计，对应的质量分别为0.020 0、0.050 0、0.100、0.150、0.200 g，进行后续的实验操作，待测溶液进LC-MS/MS分析。以大豆蛋白的质量作横坐标，筛选的大豆蛋白多肽峰面积作纵坐标，计算回归方程。1.3.5 检测结果计算待测样品的称样量（g）为m，将待测样品各个多肽的峰面积代入对应大豆蛋白多肽的回归方程，得到相应大豆蛋白的质量（g）为mi，待测样品中大豆蛋白质量分数X按下式计算：http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/df47ee4921dc85fdacd81e5cb1afbdc1.jpg
2 结果与分析2.1 前处理的优化2.1.1 提取溶剂的选择不同提取溶剂提取出的蛋白种类和数量不同，需优化提取溶剂以最大化地提取蛋白。3 种常见蛋白的提取溶剂分别为0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液、缓冲溶液2（0.05 mol/L Tris-HCl、6 mol/L尿素溶液）、缓冲溶液3（0.05 mol/L Tris-HCl、6 mol/L尿素溶液、2 mol/L硫脲溶液）。考察3 种溶剂对大豆蛋白中大豆专属多肽的提取效果，由图2可知，缓冲液2、3能够将大豆蛋白的12 条多肽全部提取出来，而缓冲液1对多肽3、4、6、7、11等提取效率比较低。对比缓冲液2、3可以发现，缓冲液3提取的多肽响应值大部分都高于缓冲液2，因此，Tris-HCl+尿素+硫脲组合的提取溶剂为最佳选择。高浓度的尿素能有效地使蛋白质变性，尤其破坏非共价键结合的蛋白质，可以提高蛋白质的可溶性；而加入硫脲，两者联合发挥协同作用，更增强了溶解疏水蛋白质的能力；此外，蛋白质变性后，打开多肽链成为无规构象，也便于后续溶剂接近基团进行以应。蛋白提取是在液氮条件下进行高速振荡，既破坏组织细胞，释放蛋白，又可尽量减少细胞内的酶解以应。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/ca56ae585b095e476692c795b8526e62.jpg&p=630x344&q=30 图2 不同提取溶剂对多肽的提取对比
Fig. 2 Comparative analysis of peptide extraction with different extraction solvents
2.1.2 酶解条件传统胰蛋白酶解时间一般为12～16 h（过夜），酶解时间过长影响实验效率，酶解时间不足导致获得多肽不充分。考虑到待测样品中既有动物蛋白也有植物蛋白，蛋白含量较高，酶解后得到的多肽浓度需足够，同时考虑到酶解后多肽的重复性对于定量分析很重要，因此有必要考察酶解时间和多肽含量的关系。分别考察酶解2、4、6、8 h及过夜（16 h）的条件下，目标多肽的测定情况，结果显示，不同酶解时间均能检测到目标多肽，但各多肽的含量有一定差异。短时间酶解后多肽的重复性比长时间酶解的重复性差，过夜酶解的重复性最好。因此为了确保酶解充分，选择过夜酶解。2.2 大豆蛋白定性多肽的筛选特异多肽的筛选是构建质谱方法的关键所在，也是构建大豆蛋白定性方法的前提。常用的植物蛋白主要包括大豆蛋白（1#～5#）、豌豆蛋白、玉米蛋白、花生蛋白和小麦蛋白，利用高分辨质谱准确的定性鉴别能力，将这些常见的植物蛋白按照1.3.1节前处理方法进行处理，每个样品平行3 次，按照1.3.2节检测条件进行上机分析。将得到的高分辨质谱扫描数据导入PD2.8软件，针对Unitprot对应物种蛋白搜库，可寻找到大豆蛋白特有的多肽列表，将多肽信息导入LC-MS/MS进行分析，确认母离子、子离子信息，构建MRM分析方法，并进一步开展多肽的验证。大豆蛋白含量丰富，数据库资源也比其他植物蛋白信息充分，筛选到的多肽达3 000多条。通过PD软件分析，并搜索Unitprot数据库确认，发现大约6%多肽是大豆特异性多肽。将这些多肽序列导入到skyline软件，可转化成离子对信息，再将离子对信息导入到LC-MS/MS，参照1.3.3节方法分析。3) UI交互模式：对于不同的操作系统，UI交互的特点不完全一致，需考虑在交互模式上是采用多平台一致的模式还是采用契合不同平台的交互特点的方式。 MRM是针对靶标分子的一种质谱分析技术，该技术采用三重四极杆质谱仪，检测靶标分子的母离子和子离子的质谱响应信号，从而获取较灵敏和高重复性的定性和定量信息，具有灵敏、准确和特异等特点。各个多肽的氨基酸组成不同，序列长度、等电点不同，导致在LC-MS/MS上的保留时间、离子化和质谱响应等都有明显差异，因此需要开展适用于LC-MS/MS上特异性多肽的挑选，需要满足以下条件：每个多肽母离子下子离子不少于3 个；母离子和子离子响应较高。按照此条件，共挑选出大豆定性多肽12 个，多肽信息见表1。以挑选出的多肽ESYFVDAQPK为例，相对分子质量为1 183.28，带2 个正电荷，母离子m/z 592.3，挑选出4 个子离子，分别为m/z 558.3、244.2、657.4、804.4，见图3A～D。他的老伴儿走了，初听这个消息，我身边的人都格外地轻松愉快。消息如落花般并未在我心里荡起多大波澜，我只是隐隐感到院子里一种莫名的死寂。 表1 筛选出的大豆定性多肽列表
Table 1 List of peptides selected for qualitative analysis of soybean proteinhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/07076124a45202ee0aedf3b42f4529af.jpg&q=30 多肽编号大豆定性多肽母离子m/z来源蛋白soy1# GSDLVNVR 430.2 pyruvate kinase soy2# VSDDEFNNYK 615.7 kunitz trypsin inhibitor soy3# FGPMIQCDLSSDD 742.8 2S albumin soy4# QLQGVNLTPCEK 693.9 3S albumin soy5# LVFCPQQAEDDK 725.3 kunitz trypsin inhibitor soy6# ESYFVDAQPK 592.3 α-subunit of β-conglycinin soy7# LITLAIPVNKPGR 464.6 α-subunit of β-conglycinin soy8# YQGNSGPLVNP 573.3 glycinin soy9# SQQLQNLR 493.8 beta-conglycinin alpha’ subunit soy10# LSAQYGSLR 497.8 glycinin G2 soy11# NILEASYDTK 577.3 beta-conglycinin alpha’ subunit soy12# EAFGVNMQIVR 632.3 glycinin G2
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/a99719f96f06f6c98c5c905617d7a94f.jpg&p=706x1040&q=30
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/5cea21fcdd3d2792dc3cd1ca55fd3c6f.jpg&p=650x392&q=30 图3 ESYFVDAQPK多肽提取离子流图
Fig. 3 Extracted ion current chromatogram of peptide ESYFVDAQPK
2.3 大豆蛋白定量多肽的筛选肉制品中添加的大豆蛋白越多，大豆蛋白含量越高，意味着大豆多肽含量越高。但考虑到多肽种类繁多，酶解过程复杂，影响因素较多，并不是所有特异性多肽的含量与蛋白含量呈正相关，因此需要开展定量多肽的筛选。定量多肽需要具备两大特征，第1是可以构建较好的线性关系（相关系数不应低于0.99），第2是能够满足方法构建需要的回收率。2.3.1 标准曲线目前没有大豆蛋白定性定量的标准物质，选择肉制品加工常用的大豆分离蛋白（纯度在92%以上）作为标准物质，称取0.100 9 g大豆分离蛋白1#按照1.3.4节方法，以大豆蛋白的质量作横坐标，表1筛选的12 条多肽的峰面积作纵坐标，分别构建相应的线性曲线，排除线性关系系数小于0.99的多肽，见表2。以大豆多肽LITLAIPVNKPGR为例，以大豆蛋白质量计分别为0.020 1、0.050 2、0.101、0.151、0.201 g，峰面积分别为359 551、946 798、1 879 419、2 904 559、3 811 630，其构建的线性方程为y=1.906×107x-2.485×104。筛选的8 条多肽主要来源于pyruvate kinase、α-subunit of β-conglycinin、glycinin、kunitz trypsin inhibitor、3S albumin、2S albumin大豆的主要蛋白。其中α-subunit of β-conglycinin、glycinin、3S albumin、2S albumin蛋白与Alexander等筛选的大豆蛋白的结果相符。表2 线性关系系数大于0.99的多肽列表
Table 2 List of peptides with linearity correlation coefficients greater than 0.99http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/4b15a0980693df05b2b8fe3f1626eab1.jpg&q=30 多肽编号 线性方程 线性关系系数 大豆定性多肽 母离子m/z 来源蛋白Soy1# y=1.859×106x-6.01×104 0.995 GSDLVNVR 430.2 pyruvate kinase Soy2#y=7.757×106x-8.121×1040.993 VSDDEFNNYK 615.7 kunitz trypsin inhibitor Soy3#y=3.472×106x-3.552×1040.991 FGPMIQCDLSSDD 742.8 2S albumin Soy4#y=6.525×106x-3.571×1040.992 QLQGVNLTPCEK 693.9 3S albumin Soy5#y=2.248×105x-5.223×1030.996 LVFCPQQAEDDK 725.3 kunitz trypsin inhibitor Soy6#y=7.047×106x-3.221×1040.993 ESYFVDAQPK 592.3 α-subunit of β-conglycinin Soy7#y=1.906×107x-2.485×1040.995 LITLAIPVNKPGR 464.6 α-subunit of β-conglycinin Soy8#y=1.031×107x-9.706×1040.999 YQGNSGPLVNP 573.3 glycinin
2.3.2 回收率结果参照混合不同含量的大豆蛋白，将混合后的样品按照前处理方法，选择表3中的8 条多肽进行LC-MS/MS测定，采用标准曲线定量计算加标回收率。表1中的8 个多肽，部分多肽回收率太高，超过140%，有些回收率太低，低于60%，soy1#、soy2#、soy5#多肽计算的回收率为81.7%～115.8%，精密度小于13%，见表3，证明该3 个多肽用作定量具有较高的准确度和稳定性，使用该方法能够较可靠地测定牛排样品中大豆蛋白含量。表3 3 个定量多肽的回收率和精密度
Table 3 Recoveries and precision of the three peptideshttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/7d9952f54571f5deac6eb60b182aa011.jpg&q=30 注：*.定量子离子。多肽编号大豆蛋白添加量/%平均回收率/%（n=6）精密度/%（n=6）母离子m/z 子离子m/z 2 81.7 7.2 soy1#584.6 3.5 8 91.6 6.1 430.2 618.3*，359.2 729.4，531.3 2 92.3 7.4 soy2#588.9 4.6 8 96.7 12.3 615.7 1 044.4*，685.3 159.1，187.1 2 115.8 8.5 5 109.4 7.2 8 105.6 11.8 Soy5#725.3 930.4*，185.2 213.2，1 090.4
综合以上结果，最终确认用于大豆蛋白定量的多肽为GSDLVNVR、VSDDEFNNYK、LVFCPQQAEDDK。2.3.3 LC-MS/MS方法检出限结果Beijing-Washington cooperation on the Belt and Road initiative is highly likely to be the most significant basis for global peace in the 21st century. 最严格水资源管理制度是人水关系在水资源管理制度上的反映，代表了我国当前的人水关系发展阶段。“三条红线”的提出标志着我国已进入用水的总量控制阶段。澳大利亚是世界上水资源管理非常先进的国家之一，自欧洲移民开发以来，在短短几百年时间内经历了人水关系从原始和谐到反哺自然的各个阶段，值得借鉴。按照水资源利用的技术与监测工具，水生产力的发展可分为人工阶段、机械化阶段、电气信息化阶段、社会化阶段和和谐化阶段等5个阶段，分别与人水关系的发展阶段对应。 为了测定方法的灵敏度，将大豆蛋白按质量分数0.15%添加到牛肉-大豆蛋白混合体系，进行样品处理及数据分析，结果显示大豆蛋白用于定量的3 条多肽均有检出，以3 倍和10 倍信噪比确定方法的检出限和定量限，最终确定大豆蛋白3 条定量多肽的检出限为0.15%，定量限为0.5%。2.4 真实性样品的测定表4 市售牛排中大豆蛋白含量测定结果
Table 4 Determination of soybean protein content in commercial steak based on the three peptideshttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/b96ca9d0288b35fbaf66f34934cc21b6.jpg&q=30 序号 样品名称 标签标示 大豆蛋白质量分数/%soy1# soy2# soy5# 平均值1 西冷牛排 牛肉、大豆分离蛋白 1.49 1.12 1.35 1.32 2 菲力牛排 牛肉、大豆分离蛋白 2.37 1.71 2.04 2.04 3 厚切菲力牛排 牛肉、大豆分离蛋白 0.94 0.89 0.94 0.92 4 黑椒西冷牛排 牛肉、大豆分离蛋白 0.44 0.57 0.57 0.52 5 菲力牛排 牛肉、大豆分离蛋白 0.52 0.71 1.08 0.77 6 T骨牛排 牛肉、大豆分离蛋白 0.43 0.72 0.91 0.69 7 菲力牛排 牛肉 1.18 0.98 1.23 1.13 8 特制黑胡椒牛排 牛肉 0.73 0.64 0.81 0.73 9 西冷牛排 牛肉 0.87 0.72 0.87 0.82 10 儿童牛排番茄味 牛肉、大豆分离蛋白 1.14 1.00 1.28 1.14 11 进口整切西冷牛排 牛肉、大豆蛋白 0.94 0.80 1.40 1.04
续表4http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=01c8e8c73c3ecd33d8b22523b156eb39/9bd9280da4747bea553d0a9ad10c01e5.jpg&q=30 注：/.未检测出。序号 样品名称 标签标示 大豆蛋白质量分数/%soy1# soy2# soy5# 平均值12 黑胡椒牛排 牛肉、大豆蛋白 0.72 1.22 1.67 1.21 13 原切菲力牛排 牛肉、大豆蛋白 0.69 1.01 1.33 1.01 14 沙朗牛排 牛肉 1.56 2.39 3.81 2.59 15 香骨牛排 牛肉 / / / /16 黑椒牛排 牛肉、大豆分离蛋白 0.79 0.88 1.18 0.95 17 西冷牛排 牛肉、大豆分离蛋白 1.22 0.94 1.36 1.18 18 原香西冷牛排 牛肉 1.22 1.59 1.95 1.59 19 黑椒牛排 牛肉、大豆分离蛋白 0.75 1.50 1.65 1.30 20 沙朗牛排 牛肉、大豆分离蛋白 0.97 1.28 1.67 1.31 21 菲力牛排 牛肉、大豆分离蛋白 1.16 1.01 1.66 1.28 22 眼肉牛排 牛肉、大豆分离蛋白 0.47 0.94 1.45 0.95 23 儿童牛排 牛肉、大豆分离蛋白 0.43 0.63 0.82 0.63 24 菲力牛排 牛肉、大豆分离蛋白 0.52 0.90 1.37 0.93 25 黑胡椒牛排 牛肉、大豆分离蛋白 0.80 1.40 2.05 1.42 26 浸腌西冷牛排 牛肉 / / / /27 黑椒牛排 牛肉 / / / /28 厚切西冷牛排 牛肉、大豆分离蛋白 0.40 0.49 0.39 0.43
为了进一步验证该方法的适用性，市购牛排28 件并进行检测，见表4。结果显示，绝大多数市售牛排都做了合理标示，大豆蛋白检测结果也在合理范围。但7、8、9、14、18号牛排的配料表中仅标识了牛肉，但实际测定出大豆特异性多肽，证明确实加入了大豆蛋白，尤其14号沙郎牛排，大豆蛋白含量超过2%。3 结 论本研究针对牛排产品构建基于LC-MS/MS对大豆蛋白准确定性及定量的分析方法，共筛选出大豆蛋白的特征定量多肽3 条，并经过方法学验证，检出限为0.15%，定量限为0.5%，平均加标回收率为81.7%～115.8%，精密度小于13%。采用本方法准确度高、干扰少，具有较高的灵敏度和回收率。建议研制相应大豆蛋白的标准物质，用于定性及定量分析，可拓展该方法的广泛应用，基于此原理可同时进行其他肉类食品的大豆蛋白含量及其他植物蛋白的鉴别。该研究为掺假检测提供了思路，可以同其他技术相互补充，在食品真伪鉴别领域具有广阔的市场应用前景。参考文献： 朱文静, 陈斌, 邹贤勇, 等. 基于滤光片型NIR光谱仪快速测定完整大豆蛋白含量的研究. 现代仪器与医疗, 2007, 13(6): 44-46.DOI:10.3969/j.issn.1672-7916.2007.06.014. 岳巧云, 陈定虎, 伍朝晖, 等. 实时荧光PCR在鉴别奶粉中掺入大豆成分的应用研究. 食品科学, 2009, 30(12): 190-193. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2009.12.041. 许任伟. 牛肉制品中大豆掺假的荧光PCR鉴别体系的优化. 福建轻纺, 2014(7): 44-51. DOI:10.3969/j.issn.1007-550X.2014.07.004. WOOLFE M, PRIMROSE S. Food forensics: using DNA technology to combat misdescription and fraud. Trends in Biotechnology, 2004,22(5): 222-226. DOI:10.1016/j.tibtech.2004.03.010. MUSTO M, FARAONE D, CELLINI F, et al. Changes of DNA quality and meat physicochemical properties in bovine supraspinatus muscle during microwave heating. Journal of the Science of Food &Agriculture, 2014, 94(4): 785-791. DOI:10.1002/jsfa.6441. KIM G D, SEO J K, YUM H W, et al. Protein markers for discrimination of meat species in raw beef, pork and poultry and their mixtures. Food Chemistry, 2017, 217: 163-170. DOI:10.1016/j.foodchem.2016.08.100. MONTOWSKA M, POSPIECH E. Species-specific expression of various proteins in meat tissue: proteomic analysis of raw and cooked meat and meat products made from beef, pork and selected poultry species. Food Chemistry, 2013, 136(3/4): 1461-1469. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.09.072. MIGUEL A S, ENRIQUE S. Peptide biomarkers as a way to determine meat authenticity. Meat Science, 2011, 89(3): 280-285.DOI:10.1016/j.meatsci.2011.04.028. MONTOWSKA M, ALEXANDER M R, TUCKER G A, et al.Authentication of processed meat products by peptidomic analysis using rapid ambient mass spectrometry. Food Chemistry, 2015, 187:297-304. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.04.078. VON B C, BROCKMEYER J, HUMPF H U. Meat authentication:a new HPLC-MS/MS based method for the fast and sensitive detection of horse and pork in highly processed food. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(39): 9428-9435. DOI:10.1021/jf503468t. RUIZ O A, HUSBY E, YANG C T, et al. Detection of meat species adulteration using high-resolution mass spectrometry and a proteogenomics strategy. Food Additives & Contaminants Part A Chemistry Analysis Control Exposure & Risk Assessment, 2017,34(7): 1110-1120. DOI:10.1080/19440049.2017.1329951. KIM G D, SEO J K, YUM H W, et al. Protein markers for discrimination of meat species in raw beef, pork and poultry and their mixtures. Food Chemistry, 2017, 217: 163-170. DOI:10.1016/j.foodchem.2016.08.100. SENTANDREU M A, FRASER P D, HALKET J, et al. A proteomicbased approach for detection of chicken in meat mixes. Journal of Proteome Research, 2010, 9(7): 3374-3383. DOI:10.1021/pr9008942. GIARETTA N, GIUSEPPE A M A D, LIPPERT M, et al. Myoglobin as marker in meat adulteration: a UPLC method for determining the presence of pork meat in raw beef burger. Food Chemistry, 2013,141(3): 1814-1820. DOI:10.1016/j.foodchem.2013.04.124. BARGEN C V, DOJAHN J, WAIDELICH D, et al. New sensitive high-performance liquid chromatography-tandemmass spectrometry method for the detection of horse and pork in halal beef. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2013, 61(49): 11986-11994.DOI:10.1021/jf404121b. JOSEPHINE B, HUSCHEK G, RAWEL H M. Determination of wheat, rye and spelt authenticity in bread by targeted peptide biomarkers. Journal of Food Composition and Analysis, 2017, 58:82-91. DOI:10.1016/j.jfca.2017.01.019. ALEXANDER L, FLFRENTINA C R, MARIA L M, et al.Identification of marker proteins for the adulteration of meat products with soybean proteins by multidimensional liquid chromatographytandem mass spectrometry. Journal of Proteome Research, 2006,5(9): 2424-2430. DOI:10.1021/pr060145q. HOFFMANN B, MUNCH S, SCHWAGELE F, et al. A sensitive HPLC-MS/MS screening method for the simultaneous detection of lupine, pea, and soy proteins in meat products. Food Control, 2017,71: 200-209. DOI:10.1016/j.foodcont.2016.06.021. GALLEGO M, MORA L, ARISTOY M, et al. Optimisation of a simple and reliable label-free methodology for the relative quantitation of raw pork meat proteins. Food Chemistry, 2015, 182: 74-80.DOI:10.1016/j.foodchem.2015.02.114. MONTOWSKA M, FORNAL E. Detection of peptide markers of soy,milk and egg white allergenic proteins in poultry products by LC-QTOF-MS/MS. LWT-Food Science and Technology, 2018, 87: 310-317. DOI:10.1016/j.lwt.2017.08.091. MONTOWSKA M, FORNAL E. Label-free quantification of meat proteins for evaluation of species composition of processed meat products. Food Chemistry, 2017, 237: 1092-1100. DOI:10.1016/j.foodchem.2017.06.059. 隋继学. 速冻食品加工技术. 北京: 中国农业大学出版社, 2008. 李莹莹, 张颖颖, 丁小军, 等. 液相色谱-串联质谱法对羊肉中鸭肉掺假的鉴别. 食品科学, 2016, 37(6): 204-209. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606037. 张颖颖, 赵文涛, 李慧晨, 等. 液相色谱串联质谱对掺假牛肉的鉴别及定量研究. 现代食品科技, 2017, 33(2): 230-237. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.2.035. 李阳, 龚依伊, 谢亦林, 等. 小型猪发育期牙胚蛋白提取方法探讨. 口腔生物医学, 2015(2): 31-34. DOI:10.3969/j.issn.1674-8603.2015.02.006. 王清蓉, 万德光, 国锦琳, 等. 三斑海马蛋白质组学双向电泳技术的建立与优化. 中国实验方剂学杂志, 2018, 24(5): 50-54.DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2018050050. 丁勤学, 贾宇峰, 赵从建, 等. 两种不同溶液体系提取大鼠脊髓蛋白双向电泳图谱比较. 军事医学科学院院刊, 2004, 25(1): 17-20.DOI:10.3969/j.issn.1674-9960.2001.01.005. 刘水平, 罗志勇. 分子生物学实验中使用液氮研磨组织的方法. 实验教学与仪器, 2005, 22(3): 29. DOI:10.3969/j.issn.1004-2326.2005.03.021. PURVINE S, EPPEL J T, YI E C, et al. Shotgun collision-induced dissociation of peptides using a time of flight mass analyzer.Proteomics, 2003, 3(6): 847-850. DOI:10.1002/pmic.200300362. 牟永莹, 顾培明, 马博, 等. 基于质谱的定量蛋白质组学技术发展现状. 生物技术通报, 2017, 33(9): 73-84. DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0343. LI Y Y, ZHANG Y Y, LI H C, et al. Simultaneous determination of heat stable peptides for eight animal and plant species in meat products using UPLC-MS/MS method. Food Chemistry, 2018, 245: 125-131.DOI:10.1016/j.foodchem.2017.09.066.
Determination of Soybean Protein in Steak Products by Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryLI Yingying, ZHANG Yingying, REN Nan, LI Shilei, ZHAO Wentao, TIAN Hanyou, WANG Shouwei*
(China Meat Research Center, Beijing 100068, China)Abstract: A method for the determination of soybean protein in steak products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was developed. Firstly, the specific soybean peptides were identified and screened by highresolution mass spectrometry based on the Unitprot database to obtain the peptide sequences for accurate identification of soybean protein. Then, the soybean peptide sequences were converted into ion pair information using the skyline software. Next, the specific soybean peptides were confirmed by LC-MS/MS, and further quantified. Finally, 3 peptides for quantitative analysis of soybean protein with good linearity and recovery rate were selected, which were GSDLVNVR,VSDDENNNYK, and LVCCPQQAEDDK. For all three peptides, the correlation coefficients were above 0.99, the spiked recoveries were 81.7%-115.8%, and the precision expressed as relative standard deviation (RSD) was less than 13%. The limit of detection (LOD) was 0.15%, and the limit of quantification (LOQ) was 0.5%. The soybean protein contents of 28 commercially available steaks were determined successfully using the proposed method. The results showed that the method was highly specific and accurate, and could be applied to other meat products.Keywords: liquid chromatography-tandem mass spectrometry; peptide identification; steak; soybean protein; quantitation
收稿日期：2019-10-13基金项目：“十三五”国家重点研发计划重点专项（2017YFC1601700）第一作者简介：李莹莹（1984—）（ORCID: 0000-0002-9677-0397），女，高级工程师，硕士，研究方向为食品安全与真实性分析。E-mail: ying_sky@126.com*通信作者简介：王守伟（1961—）（ORCID: 0000-0002-6390-4803），男，教授级高级工程师，硕士，研究方向为食品安全与食品加工。E-mail: cmrcwsw@126.comDOI:10.7506/spkx1002-6630-20191013-105中图分类号：TS207.3文献标志码：A文章编号：1002-6630（2020）10-0297-07引文格式：李莹莹, 张颖颖, 任南, 等. 液相色谱-串联质谱法测定牛排产品中大豆蛋白含量. 食品科学, 2020, 41(10): 297-303.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191013-105. http://www.spkx.net.cnLI Yingying, ZHANG Yingying, REN Nan, et al. Determination of soybean protein in steak products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Food Science, 2020, 41(10): 297-303. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191013-105. http://www.spkx.net.cn五分钟后，霍铁赶到了陆叔叔的工作室，着急地拍打着房门。陆叔叔打开门，费解地看着霍铁。霍铁只感到一股热浪袭来，他来不及多说什么，拉起陆叔叔就往电梯口冲去。江平不知道发生了什么事，来不及多问，也跟着他们跑起来。
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