p-茴香醛抑制柑橘酸腐病菌的作用机制
p-茴香醛抑制柑橘酸腐病菌的作用机制p-茴香醛抑制柑橘酸腐病菌的作用机制李 路，李 蔚，车金鑫，欧阳秋丽，陶能国*（湘潭大学化工学院生物与食品工程系，湖南 湘潭 411105）摘要：为探讨p-茴香醛对柑橘酸腐病菌的抑制作用和机制，本实验结合体外实验和活体实验测定了p-茴香醛对病原菌的抑制能力，以菌丝体细胞壁、细胞膜和菌丝形态为研究对象，分析了p-茴香醛对病原菌的抑菌机制。结果表明，p-茴香醛能显著抑制柑橘酸腐病菌菌丝体生长，其最低抑菌浓度和最低杀菌浓度（minimum fungicidal concentration，MFC）均为4.48 g/L;果蜡中添加10 MFC p-茴香醛能有效降低柑橘果实酸腐病发病率，接种13 d后发病率仅为30%，显著低于对照的100%（P＜0.05）。进一步研究发现，p-茴香醛诱导胞外碱性磷酸酶活力上升，破坏酸腐病菌菌丝体细胞壁完整性，添加保护剂山梨醇也无法缓解其对病原菌的抑制;碘化丙啶染色实验表明p-茴香醛对病原菌细胞膜造成损伤;通过扫描电子显微镜观察到，p-茴香醛处理的酸腐病菌菌丝呈现褶皱、干瘪、不规则扭曲状。以上结果说明：p-茴香醛能有效抑制柑橘酸腐病菌的生长，并能有效延缓柑橘酸腐病的发病进程，其作用机制可能与p-茴香醛诱导病原菌菌丝体细胞壁和细胞膜损伤有关。关键词：p-茴香醛;酸腐病菌;抑菌作用;柑橘果实;抑菌机理柑橘是世界上重要的经济作物之一，近10多年来，我国柑橘的栽培面积、产量均居世界第一。采后柑橘果实在贮运过程中极易受到病原菌如指状青霉（Penicillium digitatum）、意大利青霉（P. italicum）和酸腐病菌（Geotrichum citri-aurantii）的侵染。近年来，柑橘酸腐病在各地的发病率逐渐提高，特别是在果实褪绿阶段和多雨季节，造成巨大经济损失。目前，柑橘酸腐病的防治仍以化学杀菌剂为主，邻苯基苯酚钠、双胍盐和丙环唑虽表现出较好的防控效果，但化学杀菌剂存在损害果实品质、对人体致癌及部分国家法律限制等影响。因此，急需筛选和开发安全、高效的杀菌剂用于柑橘采后酸腐病的防治。近年来，植物精油类果蔬防腐保鲜剂的研究和应用广受关注。植物精油又称香精油、芳香油和挥发油，是从植物组织中提取的一类有较强挥发性的植物次生代谢产物。因其具有较强的抑菌能力、毒性低、对环境影响小等优点，被视为传统合成杀菌剂的替代物。据报道，一些精油对果蔬采后病原真菌的生长和病害的防控均表现出良好的应用前景，如肉桂精油对番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、苹果青霉病菌（P. expansum）等重要果蔬致病真菌的菌丝生长和孢子萌发具有较强的抑制作用;柑橘精油通过破坏意大利青霉（P. italicum）和指状青霉（P. digitatum）菌丝体的细胞膜完整性，导致胞内组分外泄，从而抑制病原菌生长;百里香精油能延缓番茄采后灰霉病、桃果实褐腐病、芒果焦腐病的发病进程;茶树精油不仅能抑制病原菌生长，还能通过提高活性氧和抗氧化酶水平来增强草莓果实本身的抗病性，从而显著降低草莓灰霉病和软腐病的病情指数。茴香精油是从茴香（Foeniculum vulgare Mill.）植株的根、叶、果实等部位提取的一类化学组分，具有抑菌和抗氧化活性，已在临床治疗和食品保鲜中有初步应用。p-茴香醛是茴香精油中的重要组分。研究表明，p-茴香醛对多种白色念珠菌属（Candida sp.）菌株表现出较好的抑制效果，最低抑菌质量浓度从250～600 µg/mL不等。Caccioni等研究发现，p-茴香醛对多种果蔬采后致病真菌有不同程度的抑制作用，其中，抑制灰霉病菌（B. cinerea）、桃褐腐病菌（Monilinia laxa）和桃软腐病菌（Rhizopus stolonifer）孢子萌发的最低质量浓度为1 000 µg/mL，抑制指状青霉（P. digitatum）孢子萌发的最低质量浓度为500 µg/mL，抑制梨形毛霉（Mucor piriformis）、扩展青霉（P. expansum）和意大利青霉（P. italicum）孢子萌发的最低质量浓度为250 µg/mL;抑制上述病原菌菌丝体生长的最低质量浓度均为1 000 µg/mL。通过建设广州皇家园林遗址公园，在充分保护遗址的基础上，建设文化主题公园，满足城市居民的科普教育、休闲功能，拓展广州的文化内涵及旅游资源。 本研究拟通过倍半稀释法评价p-茴香醛对柑橘酸腐病菌的体外抑菌效果;并通过活体实验测定p-茴香醛对人工接种酸腐病菌的柑橘果实发病情况的防控效果;进一步从病原菌菌丝体细胞壁完整性、细胞膜通透性和形态学角度对p-茴香醛抑制酸腐病菌的作用机制进行初步分析，为柑橘采后酸腐病的防治提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂柑橘酸腐病菌（Geotrichum citri-aurantii），分离自柑橘酸腐病发病果实，保存于湘潭大学化工学院生物食品工程系。砂糖橘（Citrus reticulate Blanco）于2018年11月购自湘潭大学周边柑橘种植园。此外，与电刀不同，超声刀的低温工作环境使烟雾生成少，医务人员的不适感随之减少；同时可避免送检组织的边缘碳化，提高了病理评估的准确性。而且超声刀使用时无电刺激性，易于彻底切除重要结构周围的淋巴结及软组织，避免肌肉剧烈收缩、抖动引起的血管神经损伤。 p-茴香醛（分析纯） 阿拉丁试剂（上海）有限公司;碘化丙啶（propidium iodide，PI）溶液（1 mg/mL）北京索莱宝科技有限公司;碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）试剂盒 贝博（上海）生物科技有限公司。1.2 仪器与设备WFZ UV-2802S紫外-可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司;Nikon DS-FI2荧光显微镜 尼康仪器（上海）有限公司;F97 pro荧光分光光度计 上海棱光技术有限公司;JSM-6360LV高低真空扫描电子显微镜日本JEOL公司。1.3 方法1.3.1 菌悬液的制备菌种的活化：将-80 ℃保存的柑橘酸腐病菌在PDA平板上进行活化，置于恒温培养箱中（28±2）℃培养4～5 d。孢子悬浮液的配制：在平板中加入灭菌水刮取菌丝和孢子，灭菌擦镜纸滤除菌丝后，用血球计数板将孢子悬浮液调至5×106 个/mL。1.3.2 酸腐病菌生长情况分析采用倍半稀释法测定p-茴香醛对酸腐病菌生长的影响。在灭菌后的PDA培养基中加入p-茴香醛，使其终质量浓度分别为0（对照）、0.14、0.28、0.56、1.12、2.24 g/L和4.48 g/L。加入体积分数0.05%吐温-80，混匀后迅速倒入培养皿，制成含药平板。用打孔器打取直径6 mm的酸腐病菌菌饼，并将菌饼倒贴在含药平板中央，置于恒温培养箱中（28±2）℃培养5 d。用十字交叉法每日测量菌落直径。培养2 d后菌丝生长完全被抑制的p-茴香醛最低质量浓度定义为最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），培养4 d后菌丝生长完全被抑制的p-茴香醛最低质量浓度定义为最低杀菌浓度（minimum fungicidal concentration，MFC）。按公式（1）计算p-茴香醛对酸腐病菌的生长抑制率。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/0afede10251b7f2da09c9b2e20b9678d.jpg式中：dc为对照组的菌落直径平均值/cm;dt为处理组的菌落直径平均值/cm。可以邀请各行各业的专家、学者以及老师和学科带头人在价值观中选择他们认为最基础和核心的观念和精神，也可以提供他们认为重要的价值观。由信息管理员和经典文献研究有造诣的专家系统组织形成系列专题。针对某一主题，形成以相应主题专家推荐为主的书目和对应的推荐文献。通过读者在经典注释本、评点本、赏析本的版本中梳理主题内涵的固化、发展、延伸，调整相应主题的系列内容和体系。邀请在这方面有研究的老师和专家开展系列论坛，通过主题在中西方思想长河中的位置和观点对比以及经典情节和事例引发的思想碰撞和在当代文明中的思考，进一步充实相应主题的内容。使道之器用，器聚升华为道，形成各主题的数据库信息。 1.3.3 采后柑橘果实酸腐病发病率测定采用人工接种法测定p-茴香醛对柑橘果实酸腐病发病率的影响。选择成熟度、大小一致且无伤口的柑橘果实，用体积分数2% NaClO浸泡2 min，灭菌水漂洗后晾干。用消毒后的手术刀在柑橘果实赤道板的位置划两个2 mm×2 mm大小、2 mm深的十字型伤口，并在伤口处接种10 µL孢子悬浮液（5×106 个/mL），静置4 h。将果实浸泡在含质量浓度为0、MFC、10 MFC p-茴香醛的果蜡中5 min，每个质量浓度处理组含10 个果实，在（28±2） ℃、相对湿度85%～90%条件下保湿培养13 d，根据公式（2）计算果实发病率。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/db60241734003c937f878978bc0d80e7.jpg
1.3.4 酸腐病菌细胞壁完整性分析三是检验评优，创新项目监管机制。探索治理工程质量监督检验制度，将地质灾害治理工程治理监督检验工作纳入现有的建设工程治理监督检验体系。开展地质灾害治理工程治理评比工作，推进地质灾害治理优秀工程建设15处。同时，各地不断创新工作形式，加大工程监管力度，如景宁畲族自治县“大搬快治”办专门设立治工处，指派专人负责工程治理项目监管；松阳县邀请浙江大学、省第七地质大队等专家深入治理工程现场，对勘察设计等进行“把脉问诊”。 采用山梨醇保护实验测定细胞壁完整性的恢复性。在含药平板中加入终浓度为0.8 mol/L的山梨醇，接种直径6 mm的菌饼，（28±2）℃恒温培养5 d，每日测定菌落直径并计算病原菌的生长抑制率。前面案例提及的那位孕妈妈通过医生的检查发现肿块形状规整，圆形，表面光滑，质地韧，可以活动，并做了B超检查，诊断为乳腺纤维瘤，对孕妇、宝宝均无不良影响，孕期观察就可以了，产后可以正常哺乳，停止哺乳后可以做手术切除，全家人终于放心了。 采用AKP试剂盒测定胞外AKP活力。将0.1 mL孢子悬浮液（5×106 个/mL）接种至10 mL PDB培养基中，培养1 d后，加入p-茴香醛，使其终质量浓度分别为0、1/2 MIC、MIC，（28±2）℃恒温培养，分别在0、30、60 min和120 min后取样，4 ℃、4 000×g离心10 min，取上清液依照AKP试剂盒说明书的方法测定520 nm波长处的吸光度，并按公式（3）计算AKP活力。在这种严峻的形势下，学校体育教学只有不断唤醒学生的运动体验才能彻底转变这种劣势，才能使学生在运动体验中获得强烈的快感，才能转变学生们对于体育课程的看法，才能增强学生的健康意识，使其全身心的投入到体育实践活动中来。从当前学生对于学校体育教学的认识来看，他们普遍认为学习体育对其没有任何意义，只能作为紧张忙碌的文化学习后缓解疲惫身心的一种方式。因此，学校体育教学应当使学生们对于体育教学有一个重新的认识，要让他们了解到体育可以在调节情绪的同时成为他们学习下一门学科的一大助力。学校体育教学只有通过不断缩短运动和生活的距离，才能使学生们全面了解到体育的内涵。 根据3个重修牌坊（3、5、8）的案例研究及田野调查可以推断出一条惯例：文献记载的重修牌坊会将“重修（立、建）”字样刻在门楣上。 http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/4de461aab228e8d7ad3166dafc56264c.jpg
式中：A1为样品管吸光度;A2为对照管吸光度;A3为标准管吸光度;A4为空白管吸光度。1.3.5 酸腐病菌细胞膜通透性分析采用PI染色法检测菌丝体细胞膜通透性。将1 mL孢子悬浮液（5×106 个/mL）重新接种于100 mL PDB培养基中，（28±2）℃恒温振荡培养1 d后收集菌丝体，悬浮于100 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（0.05 mol/L、pH 7.0）中。加入p-茴香醛使其终质量浓度分别为0、1/2 MIC、MIC。（28±2）℃分别培养0、30、60 min和120 min后，将混合物4 ℃、4 000×g离心10 min，收集菌丝体。PBS（0.05 mol/L、pH 7.0）冲洗2 次后，用10 µg/mL PI染色10 min，收集菌丝体并用PBS（0.05 mol/L、pH 7.0）漂洗3 次除去残余染料。用激发波长和发射波长分别为546 nm和590 nm的荧光分光光度计检测菌丝体的荧光值，并用荧光显微镜进行观察和拍摄。按公式（4）将荧光值换算成相应的荧光值倍数。表4所示为4个模拟工况下的数值计算结果, 在不改变其他条件的情况下, 讨论通入气体温度的变化对发动机性能的影响. 需要说明的是, 为了简化计算, 本文采用等熵压缩后等压加热的方式, 所以将常温、 常压的气体增温、 加压所需要的能量为: http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/1a64c0e9bd751eb14a7fcb94f13e638a.jpg
式中：N为荧光值倍数;FV1为样品管荧光值;FV2为对照管荧光值。1.3.6 酸腐病菌菌丝体形态观察用扫描电子显微镜观察酸腐病菌菌丝体的形态。按1.3.2节的方法配制p-茴香醛质量浓度分别为0、1/2 MIC、MIC的平板，将6 mm直径的酸腐病菌菌饼接种在平板中央，（28±2）℃培养4 d后切下菌落。用体积分数3%戊二醛磷酸盐缓冲液（pH 6.8）固定，4 ℃放置24 h。取出后用PBS（pH 6.8）进行漂洗，再分别在体积分数30%、50%、70%、95%乙醇溶液中进行梯度脱水，每次20 min。最后用无水乙醇处理45 min。真空冷冻干燥后喷金，用扫描电子显微镜在加速电压30 kV下观察菌丝体形态。1.4 数据统计与分析使用Excel 2010软件处理3 组平行数据，得到平均值与标准差，用Origin 7.5软件进行绘图，并用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，用Ducan新复极差测验在0.05水平分析差异的显著性。2 结果与分析2.1 p-茴香醛对酸腐病菌生长的影响表 1 不同处理对酸腐病菌生长抑制率的影响
Table 1 Effect of different treatments on the growth inhibition rate of G. citri-aurantiihttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/75e5cc4f398f7531b136240d24125492.jpg&q=30 注：同列肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。处理 生长抑制率/%1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 0.14 g/L p-茴香醛 1.59±2.75f 7.69±0.00ef 7.15±0.57f 6.45±1.34f 7.76±0.70d 0.14 g/L p-茴香醛+山梨醇 42.86±8.25cd37.28±4.10d38.15±3.90cd37.50±2.60de30.05±4.30c 0.28 g/L p-茴香醛 17.46±30.24def5.95±1.78f 6.67±0.00f 7.07±0.85f 2.82±0.00d 0.28 g/L p-茴香醛+山梨醇 46.03±14.55cd47.34±14.89cd38.52±0.64cd34.66±0.98e 31.92±1.63c 0.56 g/L p-茴香醛 6.35±2.75f 20.32±3.26e24.44±11.76e38.83±7.50de38.58±9.19b 0.56 g/L p-茴香醛+山梨醇 52.38±19.05c42.60±4.10cd40.74±2.57cd35.23±2.95e 31.46±1.63c 1.12 g/L p-茴香醛 14.29±0.00ef17.30±4.45ef36.67±5.77d 45.30±3.42c41.78±0.81b 1.12 g/L p-茴香醛+山梨醇 60.32±11.98bc51.48±2.05c 45.93±1.28c42.05±2.95cd43.19±1.63b 2.24 g/L p-茴香醛 61.91±34.34bc82.25±16.27b82.22±2.22b86.36±1.70b93.66±6.34a 2.24 g/L p-茴香醛+山梨醇 88.89±19.25ab94.08±10.25ab96.30±6.42a 97.16±4.92a 97.65±4.07a 4.48 g/L p-茴香醛 100.00±0.00a100.00±0.00a100.00±0.00a100.00±0.00a100.00±0.00a 4.48 g/L p-茴香醛+山梨醇 100.00±0.00a100.00±0.00a100.00±0.00a100.00±0.00a100.00±0.00a
p-茴香醛处理对酸腐病菌的生长具有很强的抑制作用，对照组的生长抑制率均为0，且质量浓度越大，对病原菌的生长抑制率越高（表1）。其中，2.24 g/L和4.48 g/L p-茴香醛对病原菌的抑制率显著高于其他质量浓度p-茴香醛处理组（P＜0.05）。培养2 d和4 d后，4.48 g/L p-茴香醛能完全抑制病原菌的生长，因此MIC和MFC均为4.48 g/L。2.2 p-茴香醛对采后柑橘果实酸腐病发病率的影响人工接种4 d后，对照组和p-茴香醛处理组的柑橘果实均发生腐烂现象，随着贮存时间延长，果实发病率逐渐提高（图1）。接种后10～13 d，10 MFC（44.80 g/L）p-茴香醛处理组的果实发病率均保持在30%左右。接种13 d后，其发病率（30%）显著低于对照组和MFC（4.48 g/L）p-茴香醛处理组（100%）（P＜0.05）。说明10 MFC p-茴香醛处理能有效延缓柑橘酸腐病的发病进程。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/384e6440ef7daa389d9ad5c00fbe733f.jpg&p=736x364&q=30 图 1 p-茴香醛对接种酸腐病菌柑橘果实发病率的影响
Fig. 1 Effect of p-anisaldehyde on the disease incidence of artificially inoculated citrus fruit
2.3 p-茴香醛对酸腐病菌细胞壁完整性的影响外源添加保护剂山梨醇后，p-茴香醛对病原菌的生长抑制率也见表1。与未添加山梨醇的p-茴香醛处理组相比，添加山梨醇的p-茴香醛处理组菌丝生长抑制率没有显著降低，说明山梨醇不能缓解p-茴香醛对酸腐病菌生长的抑制程度。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/9adcc9c0bf16ee3262f227a5703879a4.jpg&p=704x372&q=30 图 2 p-茴香醛对酸腐病菌菌丝体胞外AKP活力的影响
Fig. 2 Effect of p-anisaldehyde on extracellular AKPase activity of G. citri-aurantii
p-茴香醛处理对酸腐病菌胞外AKP活力的影响见图2。真菌细胞壁被破坏时，胞内AKP泄露至胞外，因此胞外AKP活力的变化能反映细胞壁的损伤情况。30 min后，MIC（4.48 g/L）和1/2 MIC（2.24 g/L）p-茴香醛处理组的AKP活力均显著高于对照组。MIC p-茴香醛处理60 min和120 min后，病原菌胞外AKP活力分别为（3.54±0.11）U/g和（3.55±0.21）U/g，显著高于1/2 MIC p-茴香醛处理组（（3.16±0.10）U/g和（3.21±0.08）U/g）和对照组（（3.11±0.19）U/g和（3.01±0.15）U/g）（P＜0.05）。综合以上结果可以看出，MIC p-茴香醛能对病原菌细胞壁造成严重损伤。2.4 p-茴香醛对酸腐病菌细胞膜通透性的影响p-茴香醛处理对病原菌细胞膜通透性的影响见图3。由于PI染料不能穿过正常的细胞膜，因此菌丝体细胞膜损伤后，在荧光显微镜下呈红色。30 min时，p-茴香醛处理的菌丝体在荧光显微镜下均未观察到明显的红色荧光（图3A），MIC p-茴香醛处理组菌丝体荧光值倍数约为对照组的1.53 倍（图3B）。而60 min时，MIC p-茴香醛处理组的菌丝体荧光值倍数约为对照组的1.49 倍，荧光显微镜下也观察到部分菌丝体呈红色，表明细胞膜被严重损伤。p-茴香醛处理120 min时，菌丝体细胞膜的破坏程度进一步加剧，此时，1/2 MIC p-茴香醛处理组荧光值倍数（1.30±0.03）显著高于对照组（1.03±0.05），但显著低于MIC p-茴香醛处理组（1.46±0.12）（P＜0.05）。PI染色后的荧光图片和荧光值倍数均证实p-茴香醛造成病原菌细胞膜的损伤。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/87cfb477e0b1e761304fdd2687119285.jpg&p=690x666&q=30 图 3 p-茴香醛对酸腐病菌菌丝体细胞膜通透性的影响Fig. 3 Effect of p-anisaldehyde on membrane permeability of G. citri-aurantii
2.5 p-茴香醛对酸腐病菌菌丝体形态的影响p-茴香醛处理对酸腐病菌菌丝体的形态有明显影响，对照组菌丝体饱满呈圆柱状，粗细均匀（图4A）;而经过p-茴香醛处理的菌丝体形态均发生改变。1/2 MIC p-茴香醛处理的菌丝体表面出现明显褶皱（图4B）;MIC p-茴香醛处理的菌丝体表面形态变化更为明显，呈现不规则扭曲和干瘪状（图4C）。这些变化说明质量浓度更高的p-茴香醛对菌丝体造成的损伤更大，导致胞内组分外泄。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/580885a4fc0687307fd14a4d024914cf.jpg&p=738x252&q=30 图 4 p-茴香醛对酸腐病菌菌丝体形态的影响
Fig. 4 Effect of p-anisaldehyde on morphology of G. citri-aurantii
3 讨 论近年来，安全而高效的柑橘酸腐病防治方法（如植物精油、生防菌等）引起广泛关注。Regnier等的研究表明，1 000 μL/L孜然、柠檬草、棕榈草等9 种植物精油能完全抑制柑橘酸腐病菌的菌丝生长，并能显著降低果实发病率。Liu等发现，人工接种5 d后，经3 200 μL/L百里香精油处理的温州蜜柑酸腐病发病率从78.1%降低至14.1%。Boubaker等指出，供试的4 种百里香精油能不同程度地抑制柑橘酸腐病菌的生长和孢子萌发，抑菌效果与精油组分和百里香植株的种类有关。大量研究表明，茴香精油具有抑菌性，且p-茴香醛是茴香精油中的重要抑菌组分，对多种采后果蔬致病真菌有一定的抑制作用。在本实验中，p-茴香醛对柑橘酸腐病菌表现出很强的抑菌性，其MIC和MFC均为4.48 g/L，且活体实验中贮存13 d的柑橘果实发病率从100%降低至30%左右，也证实了p-茴香醛对柑橘酸腐病的防治效果。值得注意的是，活体实验中的p-茴香醛抑菌质量浓度高于离体实验，这种现象在其他抑菌物质，如百里香精油、柠檬醛、壳聚（寡）糖和山梨酸钾中也有相似情况。原因可能与抑菌物质的渗透能力、病原菌在人工伤口的迅速扩繁等因素有关。杀菌剂对致病真菌的作用位点包括细胞壁、质膜、分泌因子、氨基酸生物合成、信号组分等。其中细胞壁对真菌的生长和生存适应能力至关重要。AKP通常在真菌的细胞质中合成，再被分泌到周质空间中，细胞壁的损伤会造成AKP泄漏至胞外基质。Shao等发现茶树精油处理4 h即可造成灰霉病菌（B. cinerea）的胞外AKP活力显著上升，推断此时菌丝细胞壁已被破坏。而Tang Xu等用脱氢乙酸钠处理柑橘酸腐病菌菌丝体后，胞外AKP活力并未升高，推测细胞壁不是脱氢乙酸钠的抑菌靶标。本实验中，MIC p-茴香醛处理的菌丝体胞外AKP活力在60 min时显著高于对照组，表明p-茴香醛破坏了菌丝体细胞壁完整性，导致AKP外泄。山梨醇是一种常用于维持真菌细胞渗透压的保护剂，细胞壁的损伤在高渗透压下得到缓解，因此以真菌细胞壁为作用位点的化学药剂在山梨醇的保护作用下会降低其对真菌的抑制作用。本实验中，外源添加山梨醇后，p-茴香醛对酸腐病菌菌丝的生长抑制率并没有显著降低，部分甚至增加，因此推断p-茴香醛还可能损伤病原菌细胞膜。大量研究表明，多数抑菌物质，如香芹酚、E-2-己烯醛、脱氢乙酸钠均能对病原菌细胞膜通透性造成影响，导致细胞质、核酸和蛋白质泄漏。在PI染色实验中，PI通过受损的细胞膜与DNA嵌合，在荧光显微镜下观察到红色荧光;因此，荧光的强弱能一定程度反映细胞膜损伤的程度。前人研究表明，多种精油的抑菌性与病原菌细胞膜通透性的增加有关。本实验中，随着p-茴香醛处理质量浓度的增大和处理时间的延长，荧光逐渐增强，菌丝体细胞膜损伤程度表现出浓度依赖性和时间依赖性，表明细胞膜是p-茴香醛重要的作用位点。且30 min时，MIC p-茴香醛处理组菌丝体荧光值倍数约为对照组的1.53 倍，说明此时病原菌的细胞膜已被损伤，且细胞膜损伤的发生早于细胞壁。1）建筑物竖向布置：H1/H=34.5/98.4=0.35＞0.2；B1/B=17.5/39.5=0.0.44＜0.75。超限程度：（0.75-0.44）/0.75×100%=41.3%。其中，H1为1～9层裙房高度；H为建筑物总高度；B1为标准层宽度；B为裙房宽度。 综上，p-茴香醛能显著抑制柑橘酸腐病菌的生长，并能有效降低柑橘果实酸腐病的发病率。p-茴香醛先损伤酸腐病菌的细胞膜，再损伤其细胞壁，造成胞内物质外泄，进而影响细胞代谢，导致菌丝体凋亡。关于其对细胞功能的影响以及分子机制，还有待于进一步分析。参考文献： 沈兆敏. 世界柑橘生产的变化及对我国柑橘发展的启示. 果农之友, 2018(9): 1-4. 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Antifungal Activity and Mechanism of p-Anisaldehyde aganist Geotrichum citri-aurantiiLI Lu, LI Wei, CHE Jinxin, OUYANG Qiuli, TAO Nengguo*
(Department of Biotechnology and Food Engineering, College of Chemical Engineering, Xiangtan University, Xiangtan 411105, China)Abstract: To clarify the antifungal effect and mechanism of p-anisaldehyde against Geotrichum citri-aurantii, in vitro and in vivo experiments were conducted to identify the antifungal capacity of p-anisaldehyde. Moreover, the cell wall integrity,membrane permeability and fungal morphology of G. citri-aurantii were investigated to analyze the possible antifungal mechanism of p-anisaldehyde. Results showed that p-anisaldehyde could strongly inhibit the growth of G. citri-aurantii,and the minimum inhibitory concentration (MIC) value and minimum fungicidal concentration (MFC) value were both 4.48 g/L. Waxing with 10 MFC p-anisaldehyde could effectively delay the incidence of sour rot in citrus fruit, which was only 30% at 13 days after inoculation, significantly lower than the 100% incidence of the control (P ＜ 0.05). Furthermore,p-anisaldehyde increased the activity of extracellular alkaline phosphatase (AKP), and damaged the cell wall integrity of G. citri-aurantii mycelia. Moreover, addition of sorbitol could not reverse the inhibition. Propidium iodide (PI)staining indicated that p-anisaldehyde could impair the cell membrane of G. citri-aurantii. Also, the hyphae treated with p-anisaldehyde appeared to be wrinkle, shriveled and distorted under scanning electron microscopy (SEM). It can be illustrated that p-anisaldehyde can effectively inhibit the growth of G. citri-aurantii and delay the progression of sour rot.In addition, the inhibitory mechanism of p-anisaldehyde is probably related to the damage caused by it to the cell wall and membrane of the mycelia.Keywords: p-anisaldehyde; Geotrichum citri-aurantii; antifungal ability; citrus fruit; antifungal mechanism
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190523-269中图分类号：TS255.36 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）09-0133-06引文格式：李路, 李蔚, 车金鑫, 等. p-茴香醛抑制柑橘酸腐病菌的作用机制. 食品科学, 2020, 41(9): 133-138. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190523-269. http://www.spkx.net.cn收稿日期：2019-05-23基金项目：国家自然科学基金面上项目（31772364）;湖南省教育厅重点项目（19A476）;湖南省教育厅一般项目（18C0127）第一作者简介：李路（1990—）（ORCID: 0000-0002-1138-616X），女，讲师，博士，研究方向为农产品贮藏与保鲜。E-mail: luli9003@163.com*通信作者简介：陶能国（1979—）（ORCID: 0000-0002-0668-5448），男，教授，博士，研究方向为农产品贮藏与保鲜。E-mail: nengguotao@126.comLI Lu, LI Wei, CHE Jinxin, et al. Antifungal activity and mechanism of p-anisaldehyde aganist Geotrichum citri-aurantii.Food Science, 2020, 41(9): 133-138. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190523-269.http://www.spkx.net.cn
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