马尾藻岩藻聚糖分离纯化及其对小鼠黑尾血栓的效果
马尾藻岩藻聚糖分离纯化及其对小鼠黑尾血栓的效果马尾藻岩藻聚糖分离纯化及其对小鼠黑尾血栓的效果刘海韵1，王维民1，谌素华1,*，吕佳桐1，陈华英1，廖森泰2（1.广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东 湛江 524088;2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东 广州 510610）摘要：研究3 种马尾藻岩藻聚糖组分（F、FD1、FS1）对小鼠黑尾血栓的效果。运用超声波辅助热水浸提法从马尾藻中提取并经过醇沉、Sevag试剂脱蛋白等初级纯化方法制得粗多糖（F）。将F过DEAE C-52纤维素层析柱得次级纯化组分（FD1），将F过Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶层析柱得次级纯化组分（FS1）。对3 种岩藻聚糖组分进行化学组成分析并运用高效液相色谱测定其单糖组成。建立小鼠黑尾模型以评价3 种组分的血栓抑制效果，并采用毛细管法测定凝血时间。结果表明：经过层析柱纯化后组分的多糖质量分数均有不同程度的提升，FD1的硫酸基质量分数最高，FS1的岩藻糖质量分数最高。3 种组分单糖组成情况差异明显，但均不含阿拉伯糖。FS1组分最为纯净。对于各组分的摄入并不会影响小鼠的体质量，说明岩藻聚糖是安全的。不同组分的各剂量组小鼠黑尾长度均短于模型对照组，且纯化后的FD1和FS1抑制小鼠血栓的效果均比粗多糖F更好，60 mg/kg mb的FD1组和15 mg/kg mb的FS1组抑制血栓的效果极显著（P＜0.01）。同时各组分均可延长小鼠的凝血时间，效果依次为FS1＞FD1＞F，FD1中、高剂量组和FS1 3 个剂量组的凝血时间均较阳性药物组更长。关键词：马尾藻;岩藻聚糖;纯化;黑尾;血栓;凝血马尾藻属于大型经济褐藻。研究表明褐藻含有岩藻聚糖、褐藻多酚、岩藻黄素等多种生物活性成分，尤其是岩藻聚糖，具有保湿、镇痛、抗菌、抗血小板聚集、抗氧化、抗肿瘤、抗癌、抗获得性免疫缺陷综合征、抗脂肪生成、保肝、保护神经、治疗胃溃疡及肺结核、免疫调节等多种功效，具有较高的开发价值。血栓是一种常见的血管疾病，血栓的形成与凝血系统息息相关。目前有不少关于岩藻聚糖抗血栓及抗凝血活性的报道，多集中在海带、萱藻、裙带菜等食用型褐藻，对马尾藻的研究报道甚少，廖敏等通过体外溶栓实验、小鼠肺栓塞实验以及出血实验对马尾藻岩藻聚糖初级纯化组分F和次级纯化组分F1进行抗血栓活性评价，结果表明两种纯化组分均能降低肺栓塞模型小鼠的死亡率且显著延长出血时间。在此基础上，本实验拟采用DEAE C-52和Sepharose CL-6B柱层析法制得多糖质量分数较高的不同岩藻聚糖组分，建立小鼠黑尾模型以探究马尾藻岩藻聚糖对黑尾长度的抑制效果，并通过毛细管法测定凝血时间，为研究马尾藻岩藻聚糖抗血栓活性提供进一步的实验数据和理论支持，同时为马尾藻资源利用及岩藻聚糖生物活性深度开发提供理论依据。1 材料与方法1.1 动物、材料与试剂SPF级雄性KM小鼠，体质量（18±2）g，日龄21～28 d，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2014-0004，购回后自由摄食，适应性喂养1 周。亨氏马尾藻，采摘于广东省湛江市硇洲岛附近海域。将采摘的新鲜马尾藻除去烂叶、黄叶、根等不可食部分，反复用自来水冲洗干净，用烘箱在50 ℃温度烘干后粉碎，过80 目筛，干燥后装袋贮藏备用。岩藻糖等7 种单糖（分析标准品）、角叉菜胶（生化试剂）、Sepharose CL-6B琼脂糖上海源叶生物科技有限公司;DEAE C-52纤维素北京鼎国昌盛生物技术有限公司;质量分数0.9% NaCl注射液 湖南科伦制药有限公司;阿司匹林 江苏平光制药有限责任公司;氯吡格雷 乐普药业股份有限公司。1.2 仪器与设备UX42OH电子天平、ATY1124电子分析天平 日本岛津公司;Evolution300紫外分光光度计 美国热电公司;1200高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 美国安捷伦公司。1.3 方法1.3.1 不同马尾藻岩藻聚糖组分的制备初级纯化组分（F）的制备：参考蔡璐的方法，略有改动。将干燥的马尾藻粉用80 ℃热水浸提，350 W超声辅助，磷酸盐缓冲液将pH值调节至6.0。粗提物使用乙醇沉淀，丙酮洗去杂质，Sevag试剂脱蛋白，最后透析除去有机溶剂，45 ℃旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到马尾藻岩藻聚糖硫酸酯的粗多糖，命名为F。次级纯化组分（FD1）的制备：参考廖敏的方法，将DEAE C-52纤维素依次用0.5 mol/L NaOH溶液、0.5 mol/L HCl溶液、0.5 mol/L NaCl溶液进行活化处理，蒸馏水反复洗涤除盐后装入层析柱（80 cm×2.6 cm），在距离柱口约10 cm处时停止装柱，蒸馏水平衡24 h。将粗多糖F配制成15 mg/mL溶液，上样量为20 mL，上样后先用蒸馏水洗脱，流速为1 mL/min，流出的组分是中性多糖，弃去。接着用1.3 mol/L NaCl溶液洗脱，对应洗脱出的组分命名为FD1。在开展异化翻译过程中，译者一般会采取和原文作者一致的表达方式，将源语和内容和差异因素尽可能地直接体现出来，保持原创的语言风格和异域文化的魅力特色。异化翻译的性质和目的决定了翻译中必然会带有浓厚的异域文化特征，其必然会出现与译语有着明显区别的新的语言表达风格和附加的文化魅力。鉴于异化翻译会尽量保持源语语言文化风格的“原汁原味”，让读者明显感受到了“洋腔洋调”的魅力，从而丰富了读者的阅读文化视野，展现了译语表达的内涵，这也就促进了不同语言文化之间的沟通交流。 2.16 请从邮局寄送单位推荐信及稿件审理费，推荐信应注明对稿件的审评意见、无一稿两投、不涉及保密、署名无争议等项。 次级纯化组分（FS1）的制备：将Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶经过蒸馏水反复洗涤干净，用0.1 mol/L NaCl溶液搅拌均匀，装入层析柱（100 cm×1.6 cm），在距离柱口约10 cm处停止装柱，洗脱液（0.1 mol/L NaCl溶液）平衡24 h。将粗多糖F配制成3 mg/mL溶液，上样量为10 mL，洗脱流速为1 mL/min，每2 min收集一管。苯酚硫酸法对糖洗脱峰进行跟踪监测，以吸光度为纵坐标，洗脱管数为横坐标，作洗脱曲线，将第一个洗脱峰对应的组分命名为FS1。1.3.2 马尾藻岩藻聚糖化学组分质量分数测定多糖质量分数测定采用苯酚-硫酸法;岩藻糖质量分数测定采用半胱氨酸盐酸盐法;硫酸基质量分数测定采用氯化钡-明胶比浊法;糖醛酸质量分数测定采用咔唑比色法。作为本系列的第二册教材，本册收录了阿伦斯基《六首儿童小曲》中的三首、贝多芬 《D大调奏鸣曲》选段、沃克曼《俄罗斯人来了》、加德《C大调进行曲》、傅契斯《降E大调圆舞曲》、安德烈《D大调小奏鸣曲》、莫舍莱斯《圆舞曲和三声中部》、库劳《快板》、舒曼《花园之歌》、赖内克 《中庸的快板》、比才《舞会》、莫什科夫斯基《西班牙舞曲》，以及弗雷《洋娃娃组曲》等15首四手联弹作品。值得注意的是，编者强调了这些作品都是原创的四手联弹，让我们感受到过去时代不同作曲家对这类重奏的理解和运用。本册的作曲家的选择均很有代表性，并且跨越多种风格。 1.3.3 马尾藻岩藻聚糖单糖组成测定HPLC条件：色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18;紫外检测波长245 nm;柱流量1 mL/min;柱温30 ℃;进样量10 μL;流动相为磷酸盐缓冲液（pH 6.74）-乙腈（83∶17，V/V）;pH 6.74。英国诗人GeorgeOrwell的诗句“East,West,home is best.”早已经成为英美人表达思乡之情的佳句,被当作谚语引用。例3-3中“张弓”酒代替了home一词,汉语广告中对偶和押韵的手法在译文的五个词中得以重现。读到本广告,不仅会让人想到无论你走到天南地北,每当你把盏举杯,总会怀念“张弓”酒。 1.3.4 角叉菜胶诱导小鼠黑尾实验小鼠分组及操作：将适应性喂养一周后的130 只小鼠随机分成13 组：空白对照组、模型对照组、阳性药物（阿司匹林和氯吡格雷）组以及岩藻聚糖硫酸酯F、FD1和FS1各3 个浓度组，每组各10 只，分别给各组小鼠做好标记，分组情况如表1所示。每次给药100 μL/10 g mb，连续灌胃7 d，每天一次。灌胃期间每隔2 d给小鼠称一次体质量。表 1 小鼠分组及操作方式Table 1 Mouse grouping and operation procedurehttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/7a949214ebabe102fc021f76e7a85487.jpg&q=30 组别 灌胃情况 灌胃7 d后是否造模空白对照组 蒸馏水 否模型对照组 蒸馏水 是阿司匹林组 30 mg/kg mb阿司匹林溶液 是氯吡格雷组 11 mg/kg mb氯吡格雷溶液 是低剂量F 15 mg/kg mb粗多糖溶液 是中剂量F 30 mg/kg mb粗多糖溶液 是高剂量F 60 mg/kg mb粗多糖溶液 是低剂量FD1 15 mg/kg mb FD1溶液 是中剂量FD1 30 mg/kg mb FD1溶液 是高剂量FD1 60 mg/kg mb FD1溶液 是低剂量FS1 15 mg/kg mb FS1溶液 是中剂量FS1 30 mg/kg mb FS1溶液 是高剂量FS1 60 mg/kg mb FS1溶液 是
试剂的配制：将阿司匹林和氯吡格雷用研钵研磨至粉末状，参考赵伟等的方法确定最终给药量，分别称量好后用蒸馏水配制成30 mg/kg和11 mg/kg。准确称量冷冻干燥后得到的马尾藻岩藻聚糖F、FD1和FS1各个剂量所需的质量后用蒸馏水溶解。角叉菜胶用生理盐水配成质量分数0.5%溶液，现配现用。注射量为100 μL/10 g。血栓模型的制备：第7天灌胃给药1 h后，除空白组外其他各组小鼠腹腔注射质量分数0.5%角叉菜胶。注射角叉菜胶后将动物置于（17±2）℃环境中，因为小鼠难以在高于20 ℃的环境下出栓。期间正常进食，之后观察、测量和记录小鼠注射角叉菜胶24、48、72 h后小鼠的黑尾长度。1.3.5 马尾藻岩藻聚糖对小鼠凝血时间的影响③鸳鸯指炕上一个包袱说道：“这是老太太的几件衣服……昨日叫我拿出两套儿送你带去，或是送人，或是自己家里穿罢，别见笑。”(第四十二回) 作为衡量药物体内抗凝血活性的重要指标之一，凝血时间是指血液离开血管后在体外凝固所需的时间。测定方法：采用毛细玻管法，待角叉菜胶注射72 h后，于室温（15 ℃）下将除空白组外的其他组小鼠用毛细管（内径1 mm）于小鼠内眦框后眼静脉丛取血，至毛细管内血柱达到5 cm开始计时。每隔30 s将毛细玻管折断约5～10 mm，观察有无血凝丝出现。凝血时间即从毛细玻管采血到凝血出现的时间。凝血时间延长率按下式计算。后来，他发现了一种带酸味的野草，就把找到的都吃了下去，可是找到的并不多，因为它是一种蔓生植物，很容易给几寸深的雪埋没。那天晚上他既没有火，也没有热水，他就钻在毯子里睡觉，而且常常饿醒。这时，雪已经变成了冰冷的雨。他觉得雨落在他仰着的脸上，给淋醒了好多次。天亮了——又是灰蒙蒙的一天，没有太阳。雨已经停了。刀绞一样的饥饿感觉也消失了。他已经丧失了想吃食物的感觉。他只觉得胃里隐隐作痛，但并不使他过分难过。他的脑子已经比较清醒，他又一心一意地想着“小棍子地”和狄斯河边的地窖了。 http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/f0e178d2e86b0552366ba13684175741.jpg
式中：ti为给药组平均凝血时间/s;t0为模型对照组平均凝血时间/s。1.4 数据统计分析实验数据采用SPSS 19.0统计软件分析，以http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/f4dd8aa07a9d24826f4b3cb9ae933e87.png±s表示，组间差异显著性采用单因素方差分析，多组间比较用t检验法。2 结果与分析2.1 粗多糖F Sepharose CL-6B洗脱曲线将粗多糖F经过Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱，苯酚-硫酸法对洗脱管数的多糖质量分数进行跟踪检测，绘制的洗脱曲线如图1所示。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/48b42f6ed86e979204b4ef5c615397bb.jpg&p=766x320&q=30 图 1 粗多糖Sepharose CL-6B洗脱曲线
Fig. 1 Elution curve of the crude polysaccharide F on Sepharose CL-6B column
由图1可以看出，粗多糖F经过柱层析后，被分离成两个不同的组分，分离度较好，从峰面积可以看出各组分的回收率差异明显。考虑到后续动物实验对原料的消耗巨大，所以只对第一个峰所对应的管数进行合并收集，并命名为FS1。2.2 马尾藻岩藻聚糖化学组成分析结果由表2可知，粗多糖F经过DEAE C-52纤维素纯化后得到的FD1多糖质量分数、硫酸基质量分数、糖醛酸质量分数均有所提高，分别上升了4.827%、16.068%、5.493%，硫酸基质量分数提高十分明显，而岩藻糖质量分数则下降了8.954%。F经过Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶层析后（FS1）多糖质量分数有明显提高，提升了15.002%，硫酸基质量分数和岩藻糖质量分数略有提高，分别为0.556%、4.419%，而糖醛酸质量分数则明显地下降了19.600%。F、FD1、FS1 3 个组分经过对比发现，采用柱层析的方式进行次级纯化均能提高岩藻聚糖多糖质量分数，即提高了纯度，且琼脂糖凝胶层析比纤维素离子交换层析的纯化效果更为显著。由于岩藻聚糖的主要成分是L-岩藻糖-4-硫酸酯，所以除了纯度指标外，对于岩藻糖和硫酸基的保护/破坏效果也是评价一种岩藻聚糖纯化方式是否优良的重要指标。DEAE C-52纤维素的纯化虽然能明显提高岩藻聚糖硫酸基质量分数，但对岩藻聚糖的岩藻糖链破坏较为严重。而Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶对硫酸基的纯化效果不明显，但对岩藻糖链的保护很好，岩藻糖质量分数略有提升，并且能极其明显地降低糖醛酸质量分数，综合纯化效果更好。由于C中包含i成员有25个,i=1,2,3，并且C中包含j成员有28个,j=4,5,6，因此每个C(ui)至少包含3种色,故C(X)⊆C2∪C3∪{{1,2,3}}, C(X)∪C(Y)⊆C∪{{1,2,3}},有10+n≤44+1,可得n≤35。从而当36≤n≤90时,45个集合不能区分X和Y中的(10+n)个顶点,矛盾。以下仅考虑31≤n≤35时的情况。 表 2 马尾藻岩藻聚糖化学组成
Table 2 Chemical composition of fucoidans from Sargassumhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/723d1fe63ff6ed057210c0143c592d34.jpg&q=30 组分 多糖质量分数/%硫酸基质量分数/%岩藻糖质量分数/%糖醛酸质量分数/%F 63.935 12.322 16.192 23.840 FD1 68.762 28.390 7.238 29.333 FS1 78.937 12.878 20.615 4.240
2.3 马尾藻岩藻聚糖单糖组成分析结果表 3 马尾藻岩藻聚糖硫酸酯各组分单糖组成
Table 3 Monosaccharide composition of fucoidans from Sargassumhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/6093b80a8f8d372077f82148776ff045.jpg&q=30 注：—.未检出。组分 甘露糖质量分数/%鼠李糖质量分数/%葡萄糖质量分数/%半乳糖质量分数/%木糖质量分数/%阿拉伯糖质量分数/%岩藻糖质量分数/%F4.079 0.803 32.168 17.258 0.796 —44.894 FD112.969 10.853 10.648 8.606 3.885 —53.039 FS13.576 2.893 6.745 17.196 1.127 —68.463
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/1a3b4fadfba29acf86f99e5cd74d0301.jpg&p=610x400&q=30 图 2 混合标准单糖HPLC图
Fig. 2 HPLC chromatogram of mixed monosaccharide standards
结合表3和图2、3可以看出，3 种岩藻聚糖组分均不含阿拉伯糖。F经过DEAE C-52纤维素层析后，FD1中的甘露糖、鼠李糖、木糖以及岩藻糖的比例明显提高，而葡萄糖和半乳糖所占比例则分别下降了21.700%和8.652%。F经过Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶纯化后得到的FS1中的葡萄糖占比下降25.423%，岩藻糖占比上升23.569%。FS1与FD1相比，除了半乳糖和岩藻糖质量分数有提升以外，其余种类的单糖均有不同程度的下降。综合分析，由于岩藻糖为岩藻聚糖的主要特征单糖，半乳糖为第二特征单糖，所以可以看出FS1是3 种岩藻聚糖中最纯净的组分。对比3 种组分的色谱图，FD1的岩藻糖峰高和峰面积均小于其他2 种组分，说明FD1的岩藻糖质量分数最低，这和化学组成测定的结果一致。30例实验组患者接受硬膜外麻醉,具体方法为:平卧,在患者L1~L2之间实施硬膜外穿刺置管,同时予以2%3m L利多卡因,若患者5min内未出现腰麻现象可追加0.75%7~10m L罗哌卡因,维持麻醉平面在T10以下,等待1h~1.5h后追加0.75%4~5m L罗哌卡因,若患者血压<60/90mm Hg,需追加6mg麻黄碱,若患者心率<50次/min,需追加0.5mg阿托品。 http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/f071c2ec78800f1c095f092981a2e114.jpg&p=684x974&q=30 图 3 各岩藻聚糖组分HPLC图
Fig. 3 HPLC chromatogram of three fucoidans
2.4 马尾藻岩藻聚糖硫酸酯对小鼠体质量的影响表 4 实验前后小鼠体质量的变化（n＝ 10）
Table 4 Changes in body mass of mice (n= 10)http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/3c937f2bcea0f943063cd2c9e359abe7.jpg&q=30 注：*.与灌胃前相比，差异显著（P＜0.05）。组别 灌胃前体质量/g 7 d后造模前体质量/g空白对照组 23.43±0.78 32.97±1.67*模型对照组 24.89±0.48 32.76±0.63*阿司匹林组 25.14±0.82 33.31±0.59*氯吡格雷组 24.89±0.76 31.55±1.31*低剂量F 25.33±1.45 32.20±1.99*中剂量F 24.83±0.75 32.25±1.77*高剂量F 24.83±1.61 32.13±1.21*低剂量FD1 24.33±1.44 31.04±1.58*中剂量FD1 24.71±1.17 31.93±1.34*高剂量FD1 24.58±0.50 32.83±1.07*低剂量FS1 25.13±0.95 32.38±1.71*中剂量FS1 24.85±1.07 32.41±1.61*高剂量FS1 24.61±0.71 32.23±1.10*
由表4可以看出，在7 d的灌胃期间，各组平均体质量一直处在增长状态。其中，给药各组体质量增长都稍低于空白组和模型对照组，但差异不明显。在实验正式开始前，各组间体质量无明显差异（P＞0.05）。灌胃7 d蒸馏水、阳性药物或马尾藻岩藻聚糖后，各组体质量都显著增加（P＜0.05）。在最后一次给小鼠称体质量时，给药组的小鼠体质量与空白组、模型对照组这两组的体质量没有显著性差异，说明岩藻聚糖对小鼠的正常生长不会造成影响。2.5 马尾藻岩藻聚糖硫酸酯对小鼠黑尾长度的影响表 5 岩藻聚糖硫酸酯对角叉菜胶引起的小鼠黑尾长度的影响（n＝10）
Table 5 Effect of fucoidans on carrageenan-induced black tail length of mice (n= 10)http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/163867ef8266318621c5f54d835be438.jpg&q=30 注：同列数据间，与模型对照组比较，*.差异显著（P＜0.05）;**.差异极显著（P＜0.01）。下同。组别 黑尾长度/cm 24 h 48 h 72 h空白对照组 — — —模型对照组 3.78±0.75 4.16±0.93 4.18±0.88阿司匹林组 3.36±1.01 3.73±0.71 3.91±0.62氯吡格雷组 2.22±0.78* 2.18±0.62** 2.22±1.13**低剂量F 3.53±0.72 3.78±0.66 4.02±0.77中剂量F 3.13±0.84 3.40±1.12 3.63±1.07高剂量F 2.91±0.81 3.02±0.53 3.31±0.34低剂量FD1 2.43±0.62* 2.54±0.69** 2.59±0.73**中剂量FD1 2.62±0.88* 2.64±0.87* 2.61±0.91*高剂量FD1 2.35±0.65** 2.18±0.59** 2.20±0.57**低剂量FS1 2.09±0.69** 2.13±0.78** 2.11±0.90**中剂量FS1 2.23±0.92** 2.47±0.64** 2.41±0.45**高剂量FS1 2.14±0.73** 2.35±0.87** 2.40±0.52**
由表5可以看出，注射角叉菜胶后，各组小鼠的黑尾长度随时间延长略有增加，高剂量FD1组的小鼠黑尾长度略有缩短，但缩短的程度不明显。从表5中明显可以看出注射角叉菜胶后的24、48 h和72 h不同组分的马尾藻岩藻聚糖各剂量组的小鼠黑尾长度均短于模型对照组，说明马尾藻岩藻聚糖可以抑制小鼠体内血栓的形成并有预防作用。纯化后的FD1和FS1抑制小鼠血栓的效果均比粗多糖显著（P＜0.05或P＜0.01），FS1抑制血栓的效果优于FD1，但差异不明显。其中，F各剂量组的结果表明：随着剂量的增加，小鼠黑尾的长度有所缩短，表现出剂量依赖性，但无统计意义（P＞0.05）;FD1各组中，高剂量FD1组抑制效果极显著（P＜0.01）;而FS1各剂量组抑制效果都极显著（P＜0.01），其中，低剂量组的抑制效果最佳。另外阳性药物组中的氯吡格雷极显著地缩短了小鼠的黑尾长度，而阿司匹林抑制血栓的效果不明显。FD1和FS1抗血栓的作用较粗多糖F的强，可能与其纯度更高有关。2.6 马尾藻岩藻聚糖硫酸酯对小鼠凝血时间的影响表 6 岩藻聚糖硫酸酯对小鼠凝血时间的影响（n＝ 10）
Table 6 Effect of fucoidans on coagulation time of mice (n= 10)http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=dbdaa6020c5b67d4600b03a2a3cf28dc/964df4a7bde963ec9de84850da892cfb.jpg&q=30 ?
由表6可以看出，与模型对照组相比较，不同组分的马尾藻岩藻聚糖硫酸酯各剂量组均可延长小鼠的凝血时间。粗多糖F各剂量组和FD1各剂量组凝血时间呈现剂量依赖性，但粗多糖F低、中剂量组与模型对照组间无统计学意义（P＞0.05），而FD1和FS1各剂量组与模型对照组间有极显著差异（P＜0.01），延长凝血时间的效果FS1＞FD1＞F（P＜0.01）。模型对照组的凝血时间为（250.50±15.41）s，阿司匹林组，氯吡格雷组，F低、中、高剂量组，FD1低、中、高剂量组，FS1低、中、高剂量组（15、30、60 mg/kg mb）的凝血时间延长率分别为12.77%、42.12%、7.58%、15.37%、27.25%、32.29%、48.75%、51.20%、57.19%、76.00%、72.60%。阿司匹林和氯吡格雷这两种药物的作用原理都是抗血小板聚集，它们都使血液不易凝固。虽然说氯吡格雷的安全性跟阿司匹林的类似，但其效力高于阿司匹林的。而马尾藻岩藻聚糖硫酸酯可以延长小鼠的凝血时间，可能与影响凝血系统有关。3 讨 论本研究采用DEAE C-52纤维素和Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶对粗多糖F进行进一步纯化，与廖敏等所制备的岩藻聚糖纯化组分相比，多糖质量分数均有较大幅度的提升，所占比均超过60%，最纯净的FS11甚至达到了近79%。胡三觉等开发出的角叉菜胶诱导鼠尾部血栓模型，是利用其致炎作用而使机体产生血栓，该模型制备方法简单易操作，所需用到的造模试剂（角叉菜胶）也容易购买，造模时在适宜的环境下即可实现较高的成功率。相对来说，这一模型对动物自身伤害不大，因为造模过程中动物不会被杀害。由于小鼠尾部是单血管供血，血栓会出现在尾部，这利于操作者的观察和测量，也便于动态观察血栓的形成过程。由于该实验需要小鼠尾部产生血栓，而低温环境会引起血管收缩，即更容易出栓;但是，过低的温度会给小鼠健康带来危害，以至于严重影响实验结果，所以，对温度的调控是本实验的核心问题之一。一般鼠尾血栓模型采用皮下注射角叉菜胶的方式造模，但小鼠的皮肤很薄，稍微用力即可刺穿，所以皮下注射具有一定的技术难度。本实验参考刘彦霞等的研究，采用相对容易的腹腔注射进行造模，取得了良好效果。研究凝血时间的过程中，最初采用的是摘眼球取血挑丝的方法，但在实验中发现此法弊端较多。一是摘眼球容易产生溶血现象，造成血液无法凝固而产生实验误差;二是摘眼球会致死小鼠，死亡的小鼠血流速变慢，易造成出血不足的现象，使实验进展受阻。所以，参考武桂娟等的研究，在后续的实验中变更为毛细管法眼眶静脉丛取血，避免了各种问题。我们重点跟踪和检查热处理装炉及回火装炉等关键节点，主要控制变形过程如下：装炉时，管板下部用3根垫铁支撑，有缝隙处用垫铁、稍铁、垫片等塞严实（见图6）。淬火时，将管板放置在4组垫铁上进行冷却。回火装炉时，根据电炉垫铁特点将管板旋转45°装炉以防止变形，有缝隙处用垫铁、垫片等塞实（见图7）。回火空冷时，不立即吊下，而是空冷8h后待温度下降后再吊下放置在垫铁上（见图8）。 综上，虽然有相关研究报道了岩藻聚糖的生物活性与硫酸基质量分数有关，且FD1的硫酸基质量分数远高于FS1，但动物实验却表明FD1的活性却弱于FS1的，究其原因，除了FD1纯度没有FS1高以外，也可能与岩藻糖和硫酸基比例有关。FD1的岩藻糖质量分数低，所以很可能其所含硫酸基很大一部分并未与岩藻糖结合形成L-岩藻糖-4-硫酸酯，而FS1虽然硫酸基质量分数并不是特别高，但岩藻糖质量分数突出，可能结合形成的L-岩藻糖-4-硫酸酯总量是要高于FD1的，所以导致FS1表现出更好的活性。本研究探究了马尾藻岩藻聚糖对小鼠尾血栓的抑制活性，并进行了凝血实验，结果具有一定的成效，但要对马尾藻岩藻聚糖抗血栓活性下定论还为时尚早，需要进行更多诸如颈动脉血栓模型、下腔静脉模型、血瘀模型等一系列的血栓模型实验共同论证，并且并不局限于动物体内实验，还需要从血管内皮细胞的分泌情况入手，探究马尾藻岩藻聚糖的抗血栓机制。4 结 论对于各组岩藻聚糖组分的摄入并不会影响小鼠的体质量，说明岩藻聚糖是安全的。角叉菜胶诱导小鼠尾血栓形成实验结果表明，不同组分的马尾藻岩藻聚糖各剂量组的小鼠黑尾长度均短于模型对照组，表明岩藻聚糖可以抑制小鼠体内血栓的形成并有预防作用。且纯化后的FD1和FS1抑制小鼠血栓的效果均比粗多糖F更好。通过比较F、FD1及FS1的化学组成、单糖组成及抗血栓效果，可以推测岩藻聚糖的抗血栓活性与其多糖质量分数、岩藻糖质量分数、硫酸基质量分数和单糖组成情况有密切关联。多糖质量分数和特征单糖（岩藻糖）的占比共同反映了岩藻聚糖组分的纯度，而岩藻糖和硫酸基的质量分数与比例则影响岩藻聚糖组分的活性。本研究结果表明岩藻聚糖能够有效缩短角叉菜胶引起小鼠尾部血栓的长度和延长凝血时间，且纯化组分FD1和FS1抗血栓效果优于粗多糖F，FS1为最佳组分。参考文献： 彭雍博, 汪秋宽, 宋悦凡, 等. 褐藻中岩藻聚糖硫酸酯构效关系研究进展. 中国实验方剂学杂志, 2018(5): 203-212. 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Isolation and Purification of Fucoidans from Sargassum and Their Effect on Tail Thrombosis in MiceLIU Haiyun1, WANG Weimin1, CHEN Suhua1,*, LÜ Jiatong1, CHEN Huaying1, LIAO Sentai2
(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety, College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China; 2. Sericulture & Farm Produce Processing Research Institute,Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510610, China)Abstract: The effects of crude (F) and purified (FD1 and FS1) fucoidans from Sargassum on tail thrombosis in mice were studied. F was prepared by ultrasonic-assisted hot water extraction, alcohol precipitation and deproteinization using Sevag reagent. FD1 and FS1 were obtained by passing F through a DEAE C-52 cellulose column and a Sepharose CL-6B agarose gel column, respectively. The chemical composition of the three fucoidans was analyzed and their monosaccharide composition was determined by high performance liquid chromatography (HPLC). A mouse black tail model was established and used to evaluate the inhibition effect of the three fucoidans on thrombus formation, and the clotting time was determined by capillary method. The results showed that the polysaccharide content of the crude fucoidans was increased to different extents after being purified by the chromatographic columns. The sulphate content of FD1 was the highest and the fucose content of FS1 was the highest among the three fucoidans. Their monosaccharide composition was significantly different from other, but none contained arabinose. FS1 showed the highest fucoidan content. Ingestion of each fucoidan did not affect the body mass of mice, indicating their safety. The black tail length of mice treated with each fucoidan at all doses investigated was shorter than that of the model control group, and FD1 and FS1 inhibited thrombus formation in mice more effectively than F, with a significant difference being observed for FD1 at 60 mg/kg mb and FS1 at 15 mg/kg mb (P ＜ 0.01).All three fucoidans could prolong the clotting time of mice in the order of decreasing effectiveness: FS1＞ FD1＞ F, and the clotting time of the high-dose FD1 group and the high-, medium- and low-dose FS1 groups were longer than that of the positive drug group.Keywords: Sargassum; fucoidan; purification; black tail; thrombus; coagulation
收稿日期：2019-05-19基金项目：广东省自然科学基金项目（2018A0303130020）;2015年广东省联合培养研究生示范基地项目（粤教研函1号）第一作者简介：刘海韵（1992—）（ORCID: 0000-0003-1889-5255），男，硕士研究生，研究方向为食品科学与工程。E-mail: liuhaiyun5106031@163.com*通信作者简介：谌素华（1973—）（ORCID: 0000-0003-1301-7648），女，高级实验师，硕士，研究方向为食品科学与工程。E-mail: cshh1111@126.comDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190519-211中图分类号：TS254.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）09-0091-07引文格式：刘海韵, 王维民, 谌素华, 等. 马尾藻岩藻聚糖分离纯化及其对小鼠黑尾血栓的效果. 食品科学, 2020, 41(9): 91-97.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190519-211. http://www.spkx.net.cnLIU Haiyun, WANG Weimin, CHEN Suhua, et al. Isolation and purification of fucoidans from Sargassum and their effect on tail thrombosis in mice. Food Science, 2020, 41(9): 91-97. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190519-211. http://www.spkx.net.cn
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