牛骨多肽螯合物的制备及结构表征
牛骨多肽螯合物的制备及结构表征牛骨多肽螯合物的制备及结构表征高 敏1，汪建明1,*，甄灵慧1，于景华1，张伟伟2（1.天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457；2.山东天博食品配料有限公司，山东 济宁 272000）摘 要：为生产易被人体高效吸收利用的补钙剂以及提高牛骨的利用率，对实验室自制的牛骨多肽进行钙螯合处理，以螯合率、钙质量分数为考察指标，确定制备方法；采用紫外光谱法、荧光光谱法、红外光谱法、扫描电子显微镜、粒径及稳定性分析比较螯合前后的变化。结果表明：制备肽钙螯合物的最佳条件为肽钙质量比2∶1、温度60 ℃、时间40 min、pH 8.0。在此条件下，螯合率达到38.97%，钙质量分数为21.29%。对最佳条件下的多肽螯合物进行光谱结构分析，结果表明氨基与羧基参与螯合反应，且二者之间主要发生配位反应；扫描电子显微镜表明螯合后分子发生聚集，结构更加紧密。实验制备的肽钙螯合物，具有潜在保健价值。关键词：螯合钙；多肽；结构表征我国畜牧资源十分发达，随着畜禽养殖产业的兴盛，其副产物畜禽骨的产量也随之增加，而提高畜禽骨资源的开发利用程度，对于畜禽骨的综合开发具有极大的经济效益和社会效益，现今我国对畜禽骨的利用尤其是对牛骨的开发利用程度还存在一定的局限性，因此生产附加值更高且利用率更高的牛骨产品，已成为牛骨开发的重点和热点。钙对维持机体的健康起着无法替代的作用。钙提高了细胞内的代谢水平、促进了骨骼生长，对神经的调节、肌肉的收缩、心脏功能的稳定以及有丝分裂等都发挥了十分重要的作用。同时，钙还参与传导了一些重要的生理功能如激素应激反应、细胞增殖以及神经传导物质释放。大量研究表明钙摄入不充足会导致骨钙的流失，易患骨质疏松等疾病，所以研发经济、高效而又安全的补钙剂是解决这一社会热点问题的主要方法。然而，市场上现有的补钙剂均存在一定程度的不足，主要在于其进入肠道后容易与膳食中的草酸、植酸以及磷酸等物质形成沉淀，抑制钙的吸收。对比大众比较认可的能使机体同时补充氨基酸与钙的氨基酸钙，肽钙螯合物由于其特有的螯合吸收转运机制，能够显著提高机体对钙的吸收，同时，分子质量更小的肽可提高矿物类元素的生物利用度，因此研发能提高机体对钙吸收利用率的肽钙螯合物迫在眉睫。本研究以螯合率、钙质量分数为评价指标，制备促钙离子吸收肽，采用扫描电子显微镜观察其微观结构；运用多种光谱分析方法研究螯合前后二者的结构差异，以期为后续钙螯合多肽的工业化生产及应用提供一定的理论依据。人祭的牺牲者“大多是罪犯、战囚(俘虏)与儿童”。这种人祭的方式甚至在世俗世界也还要有继续，比如战争的时候，战斗之前的祭旗就是人祭，祭品往往是敌人或叛徒。 1 材料与方法1.1 材料与试剂牛骨粉（蛋白质质量分数23.618%） 天津北洋百川生物技术有限公司；碱性蛋白酶、中性蛋白酶 天野酶制剂（江苏）有限公司；氯化钙、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、乙二胺四乙酸四钠盐、三乙醇胺（triethanolamine，TEOA）、钙红指示剂（均为分析纯） 天津鼎国生物技术有限责任公司。科学技术的飞速前进，在弹性波理论与电磁波理论的基础上，涌现了大量的新型工程勘探技术，新型的与物理原理相匹配的数据采集设备不断引入。成本小而且勘探质量高、速度快。工程物探技术具有快速、信息量大等优点，与常规钻井方法相比，具有节省时间、节约成本、地形要求低、勘探精度高等优点。 1.2 仪器与设备HH-S4型恒温水浴锅 郑州长城科工贸有限公司；H05-1型恒温磁力搅拌器 天津东南仪诚科技有限公司；AB204-N型电子分析天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；FD-1-50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；TG16-WS台式高速离心机 湘仪离心机仪器有限公司；BT-90型纳米粒度仪 丹东市百特仪器有限公司；IS50型傅里叶红外光谱仪 美国尼利高公司；UV-2250PC型紫外-可见光分光光度计、RF-5301PC型荧光分光光度计 日本岛津公司；SU1510型扫描电子显微镜 日本日立公司；TURBISCAN LAB分散稳定性分析仪 法国Formulaction公司。1.3 方法1.3.1 多肽的制备将牛骨蛋白采用双酶水解法进行酶解，酶解条件：先经中性蛋白酶酶解，料水比5%、加酶量2.5%、温度50 ℃、pH 7.0、时间4 h，结束后沸水浴中灭酶15 min，等温度降低后进行碱性蛋白酶酶解，调节料水比4%、加酶量2.0%、温度50 ℃、pH 8.5、时间4 h，再次沸水浴灭酶15 min，经冷冻干燥制得多肽粉。首先要保证拌和楼的生产能力与工程规模相匹配，拌和楼必须具备全过程自动控制。选好拌和机后，再选优质沥青加热设备、外加剂添加设备及装载机等附属设备，从它们的性能和供需能力上确保与拌和机配套，以满足拌和机生产要求为准。 1.3.2 肽钙螯合物的制备及测定1.3.2.1 螯合物的制备称取0.6 g多肽粉以及0.3 g氯化钙于10 mL去离子水中充分溶解，调整pH 8.0后放入60 ℃恒温水浴锅螯合40 min后取出冷却，加入质量分数为95%的乙醇，并使乙醇体积分数达到约70%进行醇沉并于6 000 r/min离心10 min，洗涤数次后，得到沉淀物，最后经-50 ℃冷冻干燥36 h制得成品。1.3.2.2 钙质量分数的测定经醇沉得到的反应产物加适量酸于三角瓶中溶解定容至25 mL，加入大约1 mL掩蔽剂TEOA并用氢氧化钠调节pH 12，用EDTA标准溶液滴定，按式（1）计算钙质量分数：http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/8f2b1c3cf7dbad25bc5e5f7e62c68572.jpg式中：C为标定的EDTA浓度/（mol/L）；V为消耗的EDTA体积/mL；40为钙的摩尔质量（g/mol）；m为制得的复合物质量/g。1.3.2.3 肽钙螯合率的测定螯合率的测定：采用EDTA络合滴定法。螯合物中总钙含量的测定：移取螯合肽钙溶液5 mL，加入25 mL蒸馏水和1 mL的TEOA，用氢氧化钠调节pH 12，加入钙羧酸指示剂3 滴，立即用EDTA标准溶液滴定，直至颜色由酒红色变为纯蓝色。所用EDTA体积记为V1/mL。陆教授自然是爱不释手，费尽了心血想要从孟导手里买下这五枚古钱币。但孟导眼见自己光彩夺目的愿望即将实现，说什么也不愿意转让。陆教授最后也只能悻悻而归，临走更是再三嘱咐孟导，不要把钱币贱卖给别人。 螯合物中螯合态钙含量的测定：移取螯合肽钙溶液5 mL，加入8 倍体积的无水乙醇，离心取沉淀，用25 mL蒸馏水溶解沉淀并加入1 mL的TEOA，用氢氧化钠调节pH 12，加入钙羧酸指示剂3 滴，立即用EDTA标准溶液滴定，直至颜色由酒红色变为纯蓝色，所用EDTA体积记为V2/mL。按式（2）计算螯合率：1.3.1 发病症状病害发生先在叶鞘近水面处产生暗绿色水渍状的小斑点，扩大呈椭圆形，最后呈云纹状，由下向上蔓延至上部叶鞘。病鞘因组织受破坏而使上面的叶片枯黄。在干燥时，病斑中央为灰白色或草绿色，边缘暗褐色。潮湿时，病部长有许多白色蛛丝状菌丝体，逐渐形成白色绒球状菌块，最后变成暗褐色菌块，最后变成暗褐色菌核，菌核容易脱落土中。另外也能产生白色粉状霉层，即病菌的担孢子。纹枯病严重危害时引起植株倒伏或整株丛腐烂而死。 http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/9f7cf9fa66b7085d374b2e17531124c7.jpg
1.3.3 单因素试验在肽钙质量比1∶2、温度50 ℃、时间30 min条件下，考察pH值（5、6、7、8、9）对螯合率以及钙质量分数的影响，选择最合适的螯合pH值；根据单因素试验结果，在pH 8、肽钙质量比1∶2、温度50 ℃时，考察螯合时间（20、30、40、50、60 min）对螯合率以及钙质量分数的影响，选择最合适的螯合时间；同理，固定pH 8、螯合时间40 min、肽钙质量比选择1∶2时，考察螯合温度（30、40、50、60、70 ℃）对螯合率以及钙质量分数的影响，选择最合适的螯合温度；最后在固定pH 8、螯合时间40 min、螯合温度60 ℃时，考察肽钙质量比（1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1）对螯合率以及钙质量分数的影响，选择最合适的肽钙质量比。西山这个鬼地方，到处都是黑色，山黑，地黑，天黑，连风也黑，恐怕这里人的心也是黑的吧？人的心一旦黑了，就不好对付了。我只有忍着饥饿，向前走着，走着。我明明知道这里一切都是黑的，但我还是忍饥挨饿地要来到这里。这里除了一切是黑的，还有让人向往的一样东西：钱。钱啊！人活着，是离不了钱的啊！ 1)充分暖机，保证各部加热均匀。用常规启动方式适当延长暖机时间达不到暖机效果，背压宜在20 kPa以上，以增大进汽量。启动时，发生了提升转速及负荷稍快、凝汽器真空控制过高暖机流量不足等原因引起的打闸。 1.3.4 正交试验根据单因素试验结果，以钙质量分数及螯合率为指标，设计3因素3水平正交试验见表1。表 1 正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels used in orthogonal array designhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/ebff5c320e16a013ecbeda9d22ef3c1f.jpg&q=30 水平 因素A肽钙质量比 B时间/min C pH 1 1∶1 30 7 2 2∶1 40 8 3 3∶1 50 9
1.3.5 肽钙螯合物的结构表征1.3.5.1 紫外光谱分析学生渴望打破传统的班级授课制，选修课可以利用自身特点，适应学生的心理期望，打破课堂限制，走向社会，融入自然。当学生徜徉在校园和玄武湖的时候，真有风乎舞雩咏而归的感觉。学生的心情和情绪绝不是在课堂可以产生的，他们才思敏捷，确实让我惊讶。 将多肽以及肽钙螯合物配制成质量浓度为1 mg/mL的溶液后，以Tris-HCl缓冲液作参比，用紫外分光光度计扫描测定波长208～248 nm之间紫外吸收的变化。1.3.5.2 荧光光谱分析在RF-5301荧光分光光度仪进行荧光光谱分析，测定温度25 ℃，肽以及肽钙螯合物质量浓度为1 mg/mL，测定参数：激发波长280 nm，狭缝5 nm。测定溶液在不同波长条件下的荧光强度，记录溶液荧光强度随波长的变化。1.3.5.3 红外光谱分析将冻干后的干燥多肽以及肽钙螯合物取1 mg放入玛瑙研钵中再放入干燥的KBr 150 mg，混合并压制成1 mm厚的透明薄片，放入测定室内，采用傅里叶变换红外光谱仪在400～4 000 cm-1扫描得到红外光谱图，用OMNIC 8.2数据处理软件进行处理。1.3.5.4 粒径与稳定性分析笔者提出的地区电网电压控制策略，实现与电网状态同步进行无功优化，降低无功装置设备调节次数、减少网损，实现电网经济调度，满足电网系统电压合格率，提高地区电网的电压控制策略是可行且有效的。 采用动态光散射技术测量样品粒径大小，用纯净水清洗样品池直至背景清晰。将处理好的待测样品缓慢加入样液池中，至遮光率在10%～15%范围内，每个样品扫描3 次，取平均值。粉土天然状态下CBR值较低，具有水稳性差、不易成型等特点，不能满足路床的强度要求，需考虑掺加石灰或水泥来保证压实质量、提高路基稳定性，使路基能长时间具备良好的使用性能，对保证路面使用性能、节约后期维修费用、提高运输效益等具有十分重要的意义。 采用TURBISCAN LAB分散稳定性分析仪测定样品的稳定性。将待测样品加入到仪器配套的柱状透明玻璃瓶中备测，约放入容器整体容积的4/5，此实验反映被测样品的背散射光在扫描时间内随着时间变化所产生的平均变化率，即稳定性动力学参数，且稳定性动力学参数与体系稳定性呈负相关。本实验采用的测试时间为8 h，时间间隔0.5 h，根据稳定性动力学参数判断其稳定性。1.3.5.5 扫描电子显微镜观察将适量的多肽粉末与肽钙螯合物的冻干粉末样品分别均匀涂抹于样盘，喷金镀膜处理，施加电压聚焦清晰后，在放大倍数为500及5 000条件下获取图像。1.4 数据处理实验结果用SPSS进行处理分析，Excel进行绘图。2 结果与分析2.1 单因素试验结果2.1.1 pH值对螯合率及钙质量分数的影响http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/ce3ab16ee4822b247fbeb2d3efc1fb29.jpg&p=662x308&q=30 图1 pH值对螯合率及钙质量分数的影响
Fig. 1 Effect of pH on chelation rate and calcium content
由图1可知，当pH 5～8时，钙质量分数以及螯合率随pH值升高而不断增加，原因可能在于随着pH值升高氢离子的浓度减小，与金属离子争抢供电集团的能力减弱，从而使得钙离子与—NH2和—COOH的配位能力增强。而在pH 8时，钙质量分数以及螯合率都达到最大值，是由于此时有较多酸性及碱性的多肽物质处于等电点附近，受H＋和OH-影响较小，提供了充分的供电基团，从而有利于螯合物的形成。而在强碱性条件下，OH-与供电子基团争夺金属钙离子形成了羟桥化物，从而产生氢氧化物的沉淀，不利于螯合物的形成，因此选择pH 8较为合适。2.1.2 时间对螯合率及钙质量分数的影响http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/9519c8264b5d78f5b6c05d258fd38de1.jpg&p=682x312&q=30 图 2 时间对螯合率及钙质量分数的影响
Fig. 2 Effect of reaction time on chelation rate and calcium content
由图2可知，随着时间的延长，螯合率及钙质量分数均先增加后减小，在40 min达到最大值。原因在于时间过短将导致反应不彻底，致使产物中含有大量的游离金属离子和配体，造成原料浪费。而螯合时间过长不仅会降低生产效率，而且可能会使螯合物发生解离作用，同时可能会产生不利于螯合反应进行的副反应。因此选40 min为宜。目前，红寺堡区每百名农村劳动力中文盲、半文盲占 30%以上，小学程度占 35% 以上，即小学文化程度以下人员占农村总人口近 70%。劳动者文化素质低，不只是表现为思想观念落后，而且意味着科技素质偏低，缺少一技之长。加之不适应迁入地的生产生活方式，困难较多，如果遇到疾病灾害等，极易返贫。 数学学科历来皆是各国基础教育阶段的核心课程内容，其中“逻辑性”是其鲜明的学科特征之一．美国2010年发布了《统一核心州数学标准》（Common Core State Standards for Mathematics）基于数学学科“逻辑性”的基本特征，提出了美国数学课程编制的基本原则“更集中和更具连贯性”．其中，对于内容标准和课程是“连贯的”，给出了描述性的界定：“能够随着时间以一系列有逻辑的主题和行为的方式结合在一起，并能恰当地体现学科内容次序性或层次性的本质．”因此，数学课程“连贯性”的要求是结合学科具体特征，同时高于课程编制“衔接性”要求． 2.1.3 温度对螯合率及钙质量分数的影响http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/3041c517f7e719cb3ce2f15cce96c68d.jpg&p=624x316&q=30 图 3 温度对螯合率及钙质量分数的影响
Fig. 3 Effect of reaction temperature on chelation rate and calcium content
由图3可知，随着温度的升高，螯合率以及钙质量分数虽发生变化但波动幅度较小，说明温度不是反应的主要影响因素，对二者的影响不大，这与多位学者的研究结果相近。但由于螯合反应为吸热反应，适当高温有利于提高多肽的溶解度，增加多肽与钙离子的接触面积，使螯合反应进行顺利。同时温度过高出现下降趋势，可能是由于生成肽-M形式的产物时，生成了新键，释放一定热量，不利于正向反应的进行。因此综合考虑选择60 ℃为宜。2.1.4 肽钙质量比对螯合率及钙质量分数的影响http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/8780343e156734a14f4cf060687d0588.jpg&p=664x300&q=30 图 4 肽钙质量比对螯合率及钙质量分数的影响
Fig. 4 Effects of mass ratio between peptide and calcium on chelating rate and calcium content
从图4可知，肽钙质量比对螯合反应影响显著。随着质量比的增大，呈现先增加后减小的趋势，在2∶1达到最大值。加入过量的多肽时产品的得率反而下降，其显然不符合经济效益；而加入过量钙源，则有部分钙未参与到反应中。综合考虑既要保证原料充分利用，又要降低产品成本，获得最大经济效益，因此选择肽钙质量比为2∶1较为合适。2.2 正交试验结果采用极差分析法对表2正交试验结果进行分析，可知各因素对钙质量分数的主次影响顺序为肽钙质量比＞时间＞pH值，而对螯合率的影响顺序为时间＞肽钙质量比＞pH值，两者存在一应差异，优化后的最优组合为A2B2C2，即时间40 min、肽钙质量比2∶1、pH 8.0。对此条件进行验证，测得其钙质量分数为（21.29±1.21）%，螯合率为（38.97±0.80）%。既然是求E点的坐标，理所当然想到过点E作ES⊥x轴，垂足为S，则问题转化为求ES与AS的长，易知△ASE为等腰直角三角形，即ES=AS，所以问题转化为求FS的值．由正方形的特征想到延长SE交CD于点R，易证△ESF≌△DRE且△REC也为等腰直角三角形，则FS=ER=CR=BS=1，所以点E的坐标为(3，3)．依此类推，求M坐标自然要过点M作MK⊥x轴，垂足为K，则需求FK与MK的值．由△ESF≌△DRE想到ED=EF，即△DEF为等腰直角三角形，所以∠DFM= 表 2 牛骨多肽与钙离子螯合正交试验设计与结果
Table 2 Orthogonal array design with experimental resultshttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/6b5d4b6faa60c05ce14eb2e499c78b9e.jpg&q=30 试验号 A肽钙 螯合率/%1 1 1 1 1 16.04 27.552 2 1 2 2 2 19.02 35.721 3 1 3 3 3 15.23 31.073 4 2 1 2 3 18.97 37.212 5 2 2 3 1 20.07 34.020 6 2 3 1 2 17.88 31.829 7 3 1 3 2 14.88 28.077 8 3 2 1 3 17.38 34.223 9 3 3 2 1 18.08 28.910质量比B时间C pH值D空列钙质量分数/%钙质量分数k1 16.763 16.630 17.100 18.063 k2 18.973 18.823 18.690 17.260 k3 16.780 17.063 16.727 17.193 R 2.210 2.193 1.963 0.870螯合率k1 31.449 30.947 31.201 30.161 k2 34.354 34.655 33.948 31.876 k3 30.403 30.604 31.057 34.169 R 3.951 4.051 2.891 4.008
2.3 肽钙螯合物的结构表征2.3.1 紫外光谱分析http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/aa83d2e4e10d1fb7e714ae1c839437ca.jpg&p=578x324&q=30 图 5 多肽以及肽钙螯合物的紫外扫描图谱
Fig. 5 Ultraviolet absorption spectra of peptide and peptide-calcium chelate
紫外光谱是一种可用于研究物质变化以及测定是否有新的物质出现的分析方法。对多肽以及肽钙螯合物进行紫外扫描，由图5可以看出，多肽在208～233 nm波长之间有较强的吸收，这是肽键的特征吸收峰。比较两物质的紫外扫描图谱，发现多肽的吸收峰值在212 nm，肽钙螯合物的紫外吸收峰在210 nm，表明与钙结合以后，多肽的吸收峰发生了整体移动，峰的位置向短波长移动。这是由于过渡金属离子自身以及与其形成的配合体都会吸收紫外区的一部分波长而形成电子的跃迁，并且螯合物的中央离子与配位体键合造成了配位体内部的电子的跃迁与游离的配位体内部的电子跃迁所需的能量有所差别，同时相应原子的价电子的跃迁也发生了变化，因此在螯合过程中对紫外光的吸收发生了改变。这与许先猛等的研究结果相类似。由此证明了肽钙螯合物是一种不同于多肽的新物质。2.3.2 荧光光谱分析http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/3002777aa97f4ed92e033e1b587dae28.jpg&p=634x320&q=30 图 6 多肽及肽钙螯合物的荧光扫描图谱
Fig. 6 Fluorescence spectra of peptide and peptide-calcium chelate
根据现有研究可知，在蛋白质中，只有Trp、Tyr及Phe 3 个氨基酸残基由于侧链生色基团的不同，能形成不同的荧光光谱从而能发射荧光。由图6可以看出，当激发波长调整为280 nm时，多肽的荧光峰λ1emm a=x311 nm，表明是Tyr残基的典型荧光峰位置。λ2emm a=x355 nm，表明是Trp残基的典型荧光峰位置。而经过螯合反应形成的肽钙复合物由于其结构的改变，其最强峰的位置和强度产生了一定变化，并且肽钙螯合物的峰强度远低于多肽的峰强度，峰形逐渐平缓并在λmem ax=355 nm处的荧光峰消失。这些明显的荧光光谱的变化表明螯合反应可能是侧链残基基团相互作用所引起的，并且说明肽钙螯合物是一种不同于多肽的物质。2.3.3 红外光谱分析http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/1b8fedf9a314e588031d588105a903c5.jpg&p=582x624&q=30 图 7 多肽（A）及肽钙螯合物（B）的红外光谱扫描图谱
Fig. 7 Infrared spectra of peptide (A) and peptide-calcium chelate (B)
由图7可以看出，螯合前后红外光谱图谱发生了明显变化，说明螯合反应发生后，氨基酸基团的振动频率发生了变化，从而引起了吸收峰明显改变。在多肽的红外光谱特征区，1 632.68 cm-1属于酰胺I带，是由C＝O的伸缩振动所引发；1 458.23 cm-1处的振动属于酰胺II带，是由N—H键的面内弯曲振动和C—N键的伸缩振动引起；由于多肽结构的独特性，既Gly-Pro-Hyp序列的存在，使得其在范围内具有其他蛋白质所没有的特征红外光谱；1 037.78 cm-1处属于（PtNH2）吸收峰；在599.34 cm-1以及564.02 cm-1则由于C＝O面外弯曲振动。而在添加了钙离子后在1 546.91、1 408.97、1 340.59、1 240.10 cm-1等处新出现了一个较强的吸收峰，与羧酸成盐后的变化相一致，1 546.91 cm-1处为羧酸根的反对称伸缩振动，1 408.97 cm-1则为对称伸缩振动；而在1 240.10 cm-1处出现了代表C—O单键伸缩振动的典型新峰，表明肽钙螯合物中含有—NH2以及—COOH结构。在2 924.43 cm-1以及2 853.26 cm-1处的吸收峰反应后向低波段处移动，而1 632.68 cm-1处则向高波段处移动，—COO—处附近有反对称振动。在1 037.78 cm-1出现了向低波段移动，且吸收峰增强，是由于此处为典型（PtNH2）吸收峰，证明钙离子与—NH2之间存在一定的结合作用；上述峰位的转移、消失，说明在羧基中的氧原子以及氨基中的氮原子是发生螯合反应的主要配位原子，与此同时肽键也参与了螯合物的生成。由此可以推断多肽与钙离子之间发生了螯合反应，形成了螯合物。2.3.4 粒径以及稳定性分析http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/b181120f6e19ff6d90237e016a22a77e.jpg&p=558x324&q=30 图 8 多肽及肽钙螯合物的粒径分布图谱
Fig. 8 Particle size distribution of peptide and peptide-calcium chelate
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/daa1333aa67e14db1cd5ccce76c88a7e.jpg&p=610x332&q=30 图 9 多肽及肽钙螯合物的稳定性指数分布
Fig. 9 Stability index distribution of peptide and calcium-peptide chelate
由图8可知，经螯合处理后，粒径增加。原因在于小分子多肽与外源钙离子相结合，以及自身之间也发生了结合，致使分子质量增加，粒径变大。由图9可以看出，经过螯合处理后稳定性指数高于未经过处理，其代表的稳定性有所降低，而粒径越大，稳定性越低，稳定性指数越高。二者相辅相成，证明了稳定性指数与粒径大小之间的关系，从而进一步说明，多肽以及肽钙螯合物是两种不同的物质。2.3.5 扫描电子显微镜分析http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/dd9ebbd4ea4804a0803ca4fd0f42aa03.jpg&p=634x496&q=30 图 10 多肽及肽钙螯合物的扫描电子显微镜图
Fig. 10 Scanning electron micrographs of peptide and peptide-calcium chelate
从图10可以看出，多肽结构疏松，表面粗糙，凹凸不平，而经过处理的螯合物则均匀分布着“沟槽裂痕”，这是由于螯合物经冷冻干燥处理后形成的亲水区，在空气中吸潮造成的；并且在制样过程中由于点样喷金操作过程的存在，样品极易吸水，之后在电子显微镜的真空环境中又快速失水干燥，因此留下痕迹；螯合物较多肽而言其表面更加光滑，结构更紧密，是由于多肽与钙离子通过离子键、配位键从而生成了小颗粒聚集体。3 结 论本研究选用骨肽与钙进行螯合处理，综合考虑钙质量分数及螯合率，自制得到有利于人体吸收的肽钙螯合物。同时，对骨肽及其钙螯合物进行紫外光谱、荧光光谱、傅里叶红外光谱以及电子显微镜扫描，结果表明，较骨肽而言螯合物由于二价钙离子与多肽发生了配位反应、离子反应以及一部分吸附作用，形成了更稳定的环状结构，两者在化学结构上存在一定差异，分属于不同的物质，较好地证明了钙螯合物的形成，该实验可为肽钙螯合物实际应用生产提供一定的理论基础与技术支持。参考文献： 付文雯, 马美湖, 蔡朝霞, 等. 牛骨蛋白分步酶解制取胶原多肽螯合钙的研究. 食品工业, 2010, 31(1): 1-4. 付文雯, 马美湖, 蔡朝霞, 等. 牛骨蛋白酶解制取肽钙的研究进展.食品与发酵科技, 2009, 45(1): 1-5. DOI:10.3969/j.issn.1674-506 X.2009.01.001. PIEZK A, EIGNER E, LEWIS M S. The chromatographic separation and amino acid composition of the subunits of several collagens.Biochemistry, 1963, 2(1): 58-66. DOI:10.1021/bi00901a012. BASS J K, CHAN G M. Calcium nutrition and metabolism during infancy. Nutrition, 2006, 22(10): 1057-1066. DOI:10.1016/j.nut.200 6.05.014. LIU F T, WANG L, WANG R, et al. Calcium-binding capacity of wheat germ protein hydrolysate and characterization of peptidecalcium complex. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013,61(31): 7537-7544. DOI:10.1021/jf401868z. BENDICH A. Calcium supplementation and iron status of females.Nutrition, 2001, 17(1): 46-51. DOI:10.1016/s0899-9007(0)00482-2. AIT-OUKHATAR N, PERES J M, BOUHALLAB S, et al.Bioavailability of caseinophosphopeptide-bound iron. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 2002, 140(4): 290-294.DOI:10.1067/mlc.2002.128146. 贾维宝, 刘良忠, 黄婷, 等. 短肽螯合钙的制备工艺优化及其理化性质分析. 食品科技, 2016, 41(3): 275-280. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2016.03.055. 王小林, 孔祥珍, 华欲飞, 等. 大豆分离蛋白肽钙螯合物的制备及表征. 中国油脂, 2017, 42(7): 50-54. DOI:10.3969/j.issn.1003-7969.2017.07.011. PENG Z, HOU H, ZHANG K, et al. Effect of calcium-binding peptide form Pacific cod (Gadus macrocephalus) bone calcium bioavailability in rats. Food Chemistry, 2017, 221(3): 373-378. DOI:10.1016/j.foodchem.2016.10.078. ZHAO L N, HUANG S L, CAI X X, et al. A specific peptide with calcium chelating capacity isolated from whey protein hydrolysate.Journal of Functional Foods, 2014, 10(1): 46-53. DOI:10.1016/j.jff.2014.05.013. CHAROENPHUN N, CHEIRSILP B, SIRINUPONG N, et al.Calcium-binding peptides derived from tilapia (Oreochromis niloticus)protein hydrolysate. European Food Research and Technology,2013, 236(1): 57-63. DOI:10.1007/s00217-012-1860-2. 黄顺丽, 赵立娜, 蔡茜茜, 等. 乳清蛋白钙螯合肽的分离及结构性质表征. 中国食品学报, 2015, 15(11): 212-218. DOI:10.16429/j.1009-7848.2015.11.032. 韩樱. 蛋清肽-钙配合物的制备及促进钙吸收作用研究. 武汉:华中农业大学, 2011. 聂青平. 家禽胫骨灰分、钙、磷测定方法探索. 饲料与畜牧,1994, 5(3): 25-26. 丁媛媛, 王莉, 张新霞, 等. 麦胚多肽-钙螯合物制备工艺优化及其结构表征. 食品科学, 2017, 38(10): 215-221. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710036. 胡荣, 郭守立, 马宇熙, 等. 鸡蛋壳超微粉粉体性质及其对谷氨酸螯合钙制备的影响. 食品科学, 2017, 38(10): 251-257. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710041. 吴长平, 钟芳芳, 霍国昌, 等. 鳗鱼钙螯合肽制备工艺研究.现代食品科技, 2018, 34(1): 181-187. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2018.1.028. 刘闪, 刘良忠, 李小娜, 等. 白鲢鱼骨胶原多肽螯合钙的工艺优化.食品科学, 2014, 35(10): 76-81. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201410014. 汪婧瑜, 张业辉, 刘学铭, 等. 动物性短肽螯合物研究进展. 食品科技, 2015, 40(10): 236-240. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2015.10.050. LIANG J G, CHENG Y P, HAN H Y. Study on the interaction between bovine serum albumin and Cd tequantum dots with spectroscopic techniques. Journal of Molecular Structure, 2008,892(1/2/3): 116-120. DOI:10.1016/j.molstruc.2008.05.005. 许先猛, 董文宾, 孙皎皎. 猪皮胶原多肽螯合钙的制备及其结构表征. 食品工业科技, 2015, 36(20): 309-313; 330. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.055. 刘闪, 刘良忠, 陈阳明, 等. 白鲢鱼骨胶原低聚肽螯合钙的结构表征及其促细胞增殖作用. 中国食品学报, 2016, 16(9): 185-191.DOI:10.16429/j.1009-7848.2016.09.025. NARA M, TANOKURA M. Infrared spectroscopic study of the metalcoordination structures of calcium-binding proteins. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, 369(1): 225-239.DOI:10.1016/j.bbrc.2007.11.188. 陈俊, 李婷, 张萌, 等. 利用鲨鱼软骨制备钙螯合胶原肽及其性质的研究. 食品工业科技, 2016, 37(11): 53-57. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.002. 赵立娜, 汪少芸, 郭淋凯, 等. 乳清蛋白肽-钙螯合物的制备及性质研究. 中国食品学报, 2015, 15(7): 160-167. DOI:10.16429/j.1009-7848.2015.07.023. 崔宇, 王小林, 孔祥珍, 等. 大豆肽螯合钙能力影响因素的研究. 中国油脂, 2018, 43(2): 70-74. DOI:10.3969/j.issn.1003-7969.2018.02.016.
Preparation and Structural Characterization of Bovine Bone Polypeptide-Calcium ChelateGAO Min1, WANG Jianming1,*, ZHEN Linghui1, YU Jinghua1, ZHANG Weiwei2
(1. College of Food Science and Engineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China;2. Shandong Tianbo Food Ingredients Co. Ltd., Jining 272000, China)Abstract: This study aimed to produce calcium supplements that can be efficiently absorbed and utilized by the human body with high bioavailability in order to improve the utilization of bovine bone. The laboratory-made bovine bone polypeptide was subjected to calcium chelation. The preparation process was optimized based on the chelation rate and calcium content.Ultraviolet absorption spectroscopy, fluorescence spectroscopy, infrared spectroscopy, scanning electron microscopy,particle size and stability analysis were used to compare the changes before and after the reaction. The results showed that the optimum preparation conditions were as follows: mass ratio between peptide and calcium 2:1, reaction temperature 60 ℃, reaction time 40 min, and pH 8.0. Under these conditions, the chelation rate was 38.97% and the calcium content was 21.29%. Spectroscopic analysis showed that amino and carboxyl groups were involved in the chelation reaction, and the coordination reaction mainly occurred between them; scanning electron microscopy showed that the molecules were aggregated during chelation, making their structures more compact. Taken together, a novel peptide-calcium chelate with potential health benefits was formed.Keywords: chelated calcium; polypeptide; structural characterization
收稿日期：2018-12-17基金项目：国家自然科学基金面上项目（31671876）第一作者简介：高敏（1993—）（ORCID: 0000-0003-0721-2068），女，硕士研究生，研究方向为蛋白资源开发与功能食品。E-mail: 1459353644@qq.com*通信作者简介：汪建明（1972—）（ORCID: 0000-0003-0650-6259），女，教授，博士，研究方向为蛋白资源开发与功能食品。E-mail: wangjianming@tust.edu.cnDOI:10.7506/spkx1002-6630-20181217-183中图分类号：TS251.94文献标志码：A文章编号：1002-6630（2020）08-0256-06引文格式：高敏, 汪建明, 甄灵慧, 等. 牛骨多肽螯合物的制备及结构表征. 食品科学, 2020, 41(8): 256-261. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181217-183. http://www.spkx.net.cnGAO Min, WANG Jianming, ZHEN Linghui, et al. Preparation and structural characterization of bovine bone polypeptidecalcium chelate. Food Science, 2020, 41(8): 256-261. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181217-183. http://www.spkx.net.cn
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