浙江玫瑰醋不同发酵阶段特征性香气成分的确定
浙江玫瑰醋不同发酵阶段特征性香气成分的确定浙江玫瑰醋不同发酵阶段特征性香气成分的确定方冠宇，蒋予箭*，穆晓静，施 思（浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310018）摘 要：利用响应面试验对浙江玫瑰醋中挥发性成分固相微萃取条件进行优化，确定最佳条件为NaCl添加量2.4 g、萃取温度49.6 ℃、萃取时间44.4 min。利用优化条件对浙江玫瑰醋发酵过程中挥发性成分进行测定，并结合主成分分析、系统聚类分析和偏最小二乘-判别分析对挥发性成分进行分析。主成分分析和系统聚类分析将浙江玫瑰醋样品分成发酵前期、发酵中期和发酵后期三大类，并将样品按前、中、后3 个时期进行归类后，进行偏最小二乘-判别分析发现3 个发酵阶段的样品基于挥发性成分可以实现良好分离，其中R2Y为0.994、Q2为0.933说明该模型具有良好的稳定性和极高的预测能力。偏最小二乘-判别分析得到挥发性成分的变量投影重要性值，并结合偏最小二乘-判别分析因子荷载图，得出浙江玫瑰醋发酵前期的特征性香气成分为乙醇、十二酸乙酯、2-苯乙醇乙酸酯；发酵中期为丙酸-2-苯乙基酯、环己基丙酸乙酯、正丙醇、乙酸正丙酯、乙酸异戊酯、癸酸、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、月桂酸、2-乙基丁酸-3-甲基苯酯、油酸乙酯；发酵后期为(E)-9-十八碳烯酸乙酯、十八酸乙酯、苯甲醛、4-乙基苯酚、丁二酸二乙酯、十六酸乙酯、糠醛、乙酸-2-乙基己基酯、苯乙醇、2-甲基丙酸、3-羟基-2-丁酮。关键词：浙江玫瑰醋；固相微萃取技术；主成分分析；系统聚类分析；偏最小二乘-判别分析传统食醋中的风味物质主要分为挥发性和非挥发性两大类。食醋中的挥发性风味成分主要包括醇类、酸类、酯类、醛类、酚类、酮类等，主要通过人的嗅觉进行感知。食醋中的非挥发性风味成分主要包括非挥发性有机酸、氨基酸、多肽、还原糖、核苷酸等，主要通过人的味觉进行感知。食醋风味就是由人的味觉和嗅觉感官的整体效果。挥发性成分是食醋中重要的风味成分。对食醋中挥发性成分的研究也随着食品风味分析技术的不断发展不断向前推进。从最初的直接进样测定挥发性成分，到溶剂萃取法、树脂分离法和蒸馏萃取法，再到固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）技术和搅拌棒吸附萃取技术，食醋的挥发性成分测定技术向检测限更低、回收率更高、重复性更好、线性范围更广的方向发展。气相色谱-闻香（gas chromatography-olfactometry，GC-O）是分析食醋复杂风味成分的技术。近年来，电子鼻在食醋挥发性成分测定上的应用越来越多，其不需要样品制备、无试剂残留、快速无损，在通过分析挥发性成分区分食醋方面更有优势，工业化潜力巨大，重复性好，但对湿度变化敏感且易被酸腐蚀。Anklam等利用电子鼻技术区分出了不同年份的意大利香醋。国内对食醋中挥发性成分分析的研究较多，Wang Aili等利用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪和GC-O定性山西老陈醋的21 种挥发性成分。孙宗保等利用SPME和GC-MS结合GC-O确定了苯乙醇、乙酸苯乙酯、3-甲基丁酸、2,3-丁二酮等16 种化合物为镇江香醋的特征性风味物质。Chen Tao等利用顶空-SPME制样，用GC-MS分析山西老陈醋陈酿阶段风味物质的变化。浙江玫瑰醋是江浙一带的传统调味品，有着悠久的生产历史。其颜色为鲜亮的玫瑰红色，因此称为玫瑰醋，具有独特的风味。由于浙江玫瑰醋的地域局限性，一般浙江玫瑰醋只在浙江地区生产，因此研究较少。本研究对利用SPME-GC-MS对浙江玫瑰醋挥发性成分测定的条件进行优化，并对浙江玫瑰醋发酵过程中挥发性成分进行测定，找出浙江玫瑰醋发酵过程中挥发性成分变化规律，以期为浙江玫瑰醋中挥发性成分的检测和提高浙江玫瑰醋质量提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂安徽滁州产中晚籼米；β-苯乙醇、乙酸乙酯、苯甲醛、2-乙基丁酸、乙酸，均为国产色谱纯；NaCl、无水乙醇，均为国产分析纯。1.2 仪器与设备AR2140电子分析天平 奥豪斯国际贸易有限公司；7890A-5975C GC-MS联用仪 美国Agilent公司；50/30 µm DVB/CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司；HH-6数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司。各项目单位应于项目中期前完成项目任务执行的50%，并于中期后一周内向重庆市婚管中心报送项目中期报告；中期报告包括项目基本情况、管理情况、执行情况、宣传情况及经费使用情况等内容；项目中期报告需经区县（自治县）民政局审核并盖章；由重庆市婚管中心组织专家评审团赴项目单位进行中期评估。 1.3 方法1.3.1 浙江玫瑰醋酿造工艺传统浙江玫瑰醋生产工艺：以籼米为原料，常温浸米7 d（隔天换水），常压蒸饭（控制出饭率220%）；每缸投入饭220 kg，搭窝，常温（5月）发花16 d；发花结束时，按米、水质量比1∶3冲缸放水，进行为期4 个月左右的发酵，当酸度不再上升时，添加3%食盐，进行后熟。1.3.2 取样皮亚杰把人的认知发展分为了四个阶段：感知运动阶段、前运算阶段、具体运算阶段和形式运算阶段，对应的年龄段分别为：0—2、2—7、7—11、11—成年。很明显，初中生的认知发展水平属于形式运算阶段，在这一阶段的学生，能够根据逻辑推理、归纳或演绎的方式解决问题，抽象概括化水平高，思维发展接近成人水平，此外一个特征便是青春期自我中心：青少年并不否认他人有不同的感知和信念，并开始关注他们自己的观点、信念、态度。 日本的增加值出口主要面向发达国家和地区，但对于新兴市场的出口比重也在逐步提高。从表2中可以看出，日本增加值出口前六位经济体分别为美国、中国、韩国、中国台湾、德国、英国， 2009年对这六大经济体的增加值出口占日本增加值出口总额的比重高达52.94%。从地区来看，来自东亚、欧盟、北美、亚太的比重非常高，平均值分别为：23.09%、15.64%、28.58%、56.38%；另外对于印度、印尼、俄罗斯、土耳其等新兴经济体的比重也增长较快，比重平均为20.74%。 每次取样前先对玫瑰醋发酵液进行充分混匀，并在液面以下取样。取样后，按照0～90 d进行编号，每10 d取1 次样，每次取3 个平行样。1.3.3 SPME条件优化对浙江玫瑰醋挥发性成分检测过程中SPME条件：萃取温度、萃取时间、NaCl添加量进行优化，并设计3因素3水平响应面试验。1.3.4 香气物质测定GC条件：DB-WAX色谱柱（60 m×0.25 mm，0.5 µm）；进样口温度240 ℃，不分流进样，载气为氦气，恒流模式；柱流速1 mL/min；程序升温：柱温30 ℃保持6 min，以2 ℃/min升到140 ℃，然后以4 ℃/min升到220 ℃，保持10 min。MS条件：电子电离源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围33～500 u。1.3.5 玫瑰醋中香气成分的定量分析以2-乙基丁酸为内标物，计算各香气组分的相对校正因子，得出各组分的保留时间和峰面积。相对校正因子（fi）按式（1）计算：http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/e1bc46ec07646285af786adfaaf27bc8.jpg式中：ΔWi和ΔAi分别为组分标准品i的增加质量浓度/（μg/L）和对应增加峰面积；Ws和As为内标物s的质量浓度/（μg/L）与峰面积。分散性土造成了许多堤防结构的破坏或病害。国外研究这些问题范围，包括堤防整个洪水过程破坏和各级控制建筑物结构运行条件。破坏问题可分为以下两大种类。 面对严峻的形势，林洋多次主持召开会议，广泛征求职工意见，最终达成共识：在配合政府征地拆迁的同时，因势利导，初步理出了适合本单位转型发展的工作思路——将剩余土地转型发展，建日光温室大棚。他将上述工作思路形成报告后，上报了市政府和市国资委，赢得市政府大力支持。2011年，云城乳业“日光温室大棚建设项目”顺利实施，当年建起标准化日光温室大棚131座。 待测风味物质的含量按式（2）计算：http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/4523c840ad86d3daf37549a3e7dd177a.jpg
式中：Wi和Ai分别为被测组分的质量浓度/（μg/L）与峰面积；Ws和As分别为内标物的质量浓度/（μg/L）与峰面积。1.4 数据处理采用Origin 8.5和Excel对实验数据进行处理、分析。采用SIMCA-P进行聚类分析、主成分分析、偏最小二乘-判别分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA），及相关图形绘制。作为一个级别的开创者，BMW X5必须拥有前瞻的视野和引领趋势的技术，而作为一个级别的强者，BMW X5更需要过人的实力。考虑到全新BMW X5 xDrive40i M运动套装82万元的建议预售价格和全新BMW X5 xDrive40i尊享型M运动套装92万元的建议预售价，应该会有不少消费者对于全新BMW X5带来的崭新感官体验有兴趣。 2 结果与分析2.1 SPME条件单因素试验结果http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/545055c52159fa91547c35338d219d68.jpg&p=658x996&q=30 图 1 NaCl添加量、萃取温度、萃取时间对总峰面积和色谱峰数的影响
Fig. 1 Effect of NaCl amount, extraction temperature and extraction time on total peak area and peak number
如图1所示，NaCl添加量2～3 g、萃取温度40～60 ℃、萃取时间35～55 min条件下色谱峰数和总峰面积都达到峰值。选取NaCl添加量分别为2、2.5、3 g，萃取温度分别为40、50、60 ℃，萃取时间分别为35、45、55 min，进行3因素3水平响应面试验。当前，世界格局加快演变，世界各国相互依存、休戚与共。推动 “一带一路”建设，各国要秉承 “共商、共建、共享”，牢牢抓住发展这个 “最大公约数”，在国际上， “中国欢迎各方搭乘中国发展的 ‘快车’、 ‘便车’，欢迎世界各国和国际组织参与到合作中来”；在国内，各省市积极响应“一带一路”建设，审时度势、抢抓机遇、顺势而为。湖南作为红色资源大省，充分发挥红色文化中所蕴含的民族精神和历史价值，是坚定文化自信，推动社会主义文化繁荣兴盛的客观要求，也是湖南省开放崛起和建设富饶美丽幸福新湖南的必然需求。 2.2 响应面法对SPME条件优化结果利用Design Expert 8.05软件，以总峰面积为响应值，以NaCl添加量、萃取温度、萃取时间为自变量，设计3因素3水平试验，结果见表1、2和图2。表 1 萃取效果回归方程的方差分析
Table 1 Analysis of variance of quadratic polynomial regression modelhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/c7eef7375c8e5d8ba15d75b30ebf9a51.jpg&q=30 注：**. P＜0.01，极显著水平；*. P＜0.05，显著水平。方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值模型 8.19×1016 9 9.09×1015 56.41 ＜0.000 1**A萃取时间 8.61×1014 1 8.61×1014 5.34 0.054 1 B萃取温度 1.13×1014 1 1.13×1014 0.7 0.431 1 C NaCl添加量 9.90×1014 1 9.90×1014 6.14 0.042 3*AB 2.25×1014 1 2.25×1014 1.4 0.276 0 AC 6.50×1014 1 6.50×1014 4.03 0.084 6 BC 1.30×1015 1 1.30×1015 8.04 0.025 2*A2 2.83×1016 1 2.83×1016 175.71 ＜0.000 1**B2 1.82×1016 1 1.82×1016 112.99 ＜0.000 1**C2 2.31×1016 1 2.31×1016 143.11 ＜0.000 1**残差 1.13×1015 7 1.61×1014失拟项 7.40×1014 3 2.47×1014 2.54 0.195 1净误差 3.89×1014 4 9.72×1013总误差 8.30×1016 16
表 2 模型可信度分析
Table 2 Analysis of reliability of modelhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/e6922df9fe12633d38dcbeef600ebc7a.jpg&q=30 指标 结果 指标 结果平均值 1.270×107 决定系数 0.986 4标准差 1.310×109 校正拟合度 0.968 9变异系数/% 0.97 预测拟合度 0.85预测残差平方和 1.244×1016 信噪比 19.541
由表1可知，该方程模型的F值为56.41，达到极显著水平，这说明回归方程在其试验点上而且与试验结果拟合较好，该方程失拟项的F值为2.54，P值为0.195 1，则失拟检验不显著，这表明整个拟合区域的拟合情况良好，证明了该模型的合理性。全娃和我一同考进了县城初中。第一学期，他每天只吃一顿饭，晚饭的时候，常常一个人躲到操场去。班主任姓杨，是隔壁一条沟里的人。他看着全娃心疼，有时他会去操场把全娃叫到他宿舍，用一个搪瓷缸子给全娃煮面条吃。第二学期，全娃勉强上了几个礼拜就不去了。他让父亲想办法买头牛来放养，养壮实了给别家犁田打耙，兴许能换些粮食回来。 将17 个试验点的数据用Design Expert 8.05软件进行回归分析，以总峰面积为响应值，经多元回归拟合后，各试验因素对总峰面积的影响可以通过二次回归方程表示：总峰面积=1.416×109-1.038×107A-3.750×106B-1.113×107C-7.500×106AB-1.275×107AC＋1.800×107BC-8.202×107A2-6.578×107B2-7.403×107C2。由表2可知，变异系数为0.97%，在可接受范围内，说明试验操作可行；决定系数为0.986 4，表明该模型理论上可以反映响应值的98.64%，其与校正拟合度两者接近并且都接近1，表示回归方程效果好；信噪比值大于4是可行的，响应面试验信噪比为19.541，说明此模型可对试验结果进行准确预测。李莉没有提出任何要求，许峰请她去看起来特高档的餐厅吃饭，她第一次跟着许峰坐上了奔驰，许峰给她订了豪华的酒店套房，她想开个玩笑顺便问许峰这是真赚钱了，对她这么大方。还没开口，许峰先说了话：“李莉，我有件事骗了你，就是，我家还是很有钱的，大学毕业的时候，我想自己闯荡，和家里闹得很僵，只是最后我还是一败涂地，你走后，是父亲帮助了我。” http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/51b27f19a9d1f60423f0274b2b4e0cb8.jpg&p=536x942&q=30 图 2 各因素交互作用响应面图
Fig. 2 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on total peak area
由Design Expert 8.05软件对SPME条件进行响应面试验优化，得到最佳SPME条件为NaCl添加量2.4 g、萃取温度49.6 ℃、萃取时间44.4 min，为确保优化后条件的可靠性，利用上述优化后的条件进行重复实验结果总峰面积为1.423×109、1.422×109、1.424×109，预测值（1.422×109）与实际值无显著差异。因此上述优化后得到的SPME条件参数准确，对实际浙江玫瑰醋中挥发性成分的萃取有指导意义。2.3 浙江玫瑰醋发酵过程中挥发性成分变化分析2.3.1 挥发性成分含量变化分析某抽水蓄能电站总装机4×320 MW，其最高净水头502.7 m，输水系统水平总长度2 449 m，其中中平洞衬砌后直径为9.2 m，衬砌厚60 cm，静水头约300 m。中平洞存在长约40 m的V类围岩洞段，该洞段发育有f24、f20和f80三条较大断层。断层均为全风化构造角砾岩，围岩见高岭土化，地下水多呈渗滴～线流状，最大渗水量约5 L/min～6 L/min。断层外围岩裂隙发育，裂隙走向总体与断层垂直。该洞段地质平面展布图见图1。 浙江玫瑰醋的风味物质产生分为2 个时间段。第1个时间段为玫瑰醋的“发花”过程，在这个阶段，主要是空气中的霉菌、酵母菌等微生物在蒸熟的米饭表面生长、繁殖，使淀粉糖化，这个过程会有大量的风味物质产生。第2个阶段为玫瑰醋在“冲缸放水”后的液态发酵过程，这个阶段为三边发酵过程，同时进行由淀粉转化为糖、糖转化为乙醇、乙醇转化为醋酸，这个过程时间很长（3～4 个月），由于微生物的代谢，可以积累大量风味物质。利用上述优化后的SPME条件，采用SPMEGC-MS对玫瑰醋中的挥发性成分进行测定，并对其进行定量计算，其结果见表3。在浙江玫瑰醋发酵过程的10 个样品中，共检出69 种挥发性成分。其中醇类11 种，酸类9 种，酯类36 种，醛类8 种，酚类3 种，酮类2 种。玫瑰醋中主要的醇类物质为乙醇、苯乙醇、3-甲基正丁醇。这些醇是醋中风味的重要贡献者。苯乙醇是苯丙氨酸在酵母作用下经Strecker降解产生醛后进一步还原生成，这种化合物目前被鉴定为酒中主要的芳香族化合物。乙醇的含量呈现先上升后降低的趋势。这与玫瑰醋“三边发酵”的情况相符。含量较高的酸类物质为3-甲基丁酸、辛酸、癸酸。由于乙酸的含量较高，因此在此不进行讨论。酸类物质的总含量基本呈现先下降后上升的趋势。3-甲基丁酸是以支链氨基酸L-亮氨酸为前体经微生物降解生成，被认为是酵母蛋白质代谢的副产物，具有牛奶香气、酸味香气、水果香气和脂肪香气的组合风味，可以赋予玫瑰醋良好风味。3-甲基丁酸质量浓度在发酵过程中呈现持续上升趋势，在发酵结束时，达到58.57 μg/L。主要的酯类物质为乙酸乙酯、2-苯乙酸乙酯、乙酸异戊酯。酯类化合物的形成途径主要有两条：一是在酯酶的催化下由酸类化合物和相应的醇类化合物缩合而成；二是乙酰辅酶A在醇酰基转移酶的作用下和相应的醇类化合物缩合形成。酯类物质大多具有花香和果香味，可以赋予玫瑰醋良好的香味。发酵过程中酯类物质含量呈现持续上升状态，到发酵结束时最高，可以赋予玫瑰醋良好风味。玫瑰醋中检测出的醛类、酚类和酮类物质的种类很少。除了苯甲醛外，其他的醛类物质都很低，苯甲醛在发酵前期呈现缓慢下降状态，发酵后期快速上升。3-羟基-2-丁酮含量在玫瑰醋中较高。随着发酵进行3-羟基-2-丁酮质量浓度呈现不断增加的趋势，由“冲缸放水”后（0 d）的13.12 μg/L增加到550.02 μg/L。3-羟基-2-丁酮含量在刚“冲缸放水”后很低，说明3-羟基-2-丁酮主要由玫瑰醋“冲缸放水”后的发酵中产生。酚类物质含量是所有香气成分中最低的，但由于气味阈值低，其味道是食醋特有的香气。表 3 浙江玫瑰醋发酵过程中挥发性成分含量变化
Table 3 Changes of volatile components in Zhejiang rosy vinegar during fermentationhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/48dcf4753ce0a9b7c30e224fa42fe6ba.jpg&q=30 质量浓度/（μg/L）0 d 10 d 20 d 30 d 40 d 50 d 60 d 70 d 80 d 90 d 2-甲基丙醇 12.48±0.62 9.31±0.46 17.77±0.88 10.21±0.51 19.35±0.96 14.09±0.70 26.06±1.30 1.49±0.07 15.09±0.75 9.14±0.45 2-乙基己醇 334.31±16.71 271.88±13.59 ─ 440.02±22.00 37.05±1.85 ─ 28.54±1.42 15.83±0.79 ─ 90.1±4.50 2-乙基正己硫醇 ─ ─ 2.36±0.11 ─ 4.92±0.24 ─ ─ ─ ─ ─3-甲基正丁醇 ─ 79.83±3.99 152±7.60 127.76±6.38 ─ 110.27±5.51 ─ 76.91±3.84 134.89±6.74 67.07±3.35 3-甲硫基-1-丙醇 1.7±0.08 0.85±0.04 1.41±0.07 1.27±0.06 1.42±0.07 1.88±0.09 ─ ─ ─ 1.58±0.07 3-辛醇 ─ ─ 10.19±0.50 ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─苯甲醇 ─ ─ ─ 3.47±0.17 ─ ─ ─ ─ ─ ─苯乙醇 137.34±6.86 126.47±6.32 249.08±12.49 215.74±10.78 303.54±15.17 300.2±15.01 308.97±15.44 310±15.54 447.88±22.39 417.64±20.8丙醇 1.85±0.09 ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─乙醇 443.66±22.18 496.25±24.81 840.51±42.02 871.44±43.57 902±45.10 805±40.25 610±30.50 575.66±28.78 252.99±12.64 113.33±5.66正丙醇 ─ ─ 4.6±0.23 6.07±0.30 9.02±0.45 3.93±0.19 8.03±0.40 4.31±0.21 ─ ─2-甲基丙酸 ─ 1.17±0.05 1.89±0.09 2.47±0.12 5.19±0.25 ─ 8.03±0.40 6.39±0.31 12.42±0.62 10±0.53 2-乙基己酸 ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ 4.4±0.22 ─化合物
续表3http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/613a316d0c34c063c7de83b28f642461.jpg&q=30 质量浓度/（μg/L）0 d 10 d 20 d 30 d 40 d 50 d 60 d 70 d 80 d 90 d癸酸 8.78±0.43 11.94±0.59 19.24±0.96 22.02±1.10 30±1.50 35±1.75 40±2.01 45.8±2.29 45±2.25 45±2.25己酸 8.53±0.42 4.67±0.23 9.04±0.45 6.97±0.34 2.56±0.12 2.66±0.13 14.79±0.73 5.25±0.26 10.04±0.50 5.97±0.29壬酸 2.02±0.10 0.88±0.04 1.51±0.075 2.03±0.10 1.93±0.09 ─ 6.92±0.34 ─ ─ 1.84±0.09十二烷酸 13.66±0.68 ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ 4.81±0.24辛酸 222.11±11.10 197.03±9.85 259.34±12.96 136.57±6.82 13.49±0.67 11.02±0.55 244.76±12.26 240±12 230±11.53 222.91±11.14月桂酸 10±0.50 15.77±0.78 49.2±2.46 60±3.09 65.02±3.25 80.2±4.01 85±4.25 84.6±4.23 85±4.25 80.09±4.00 3-甲基丁酸 ─ ─ 4.46±0.22 2.46±0.12 9.49±0.21 15.57±0.27 24.16±0.12 35.86±0.45 40.32±0.67 58.57±2.92(E)-9-十八碳烯酸乙酯 16.48±0.82 17.95±0.89 17.23±0.86 17.15±0.85 ─ 4.52±0.22 ─ ─ 36.66±1.83 40±2.12 2-苯乙醇乙酸酯 18.5±0.92 ─ 53.47±2.67 52.82±2.64 ─ ─ ─ ─ ─ ─2-甲基丙酸乙酯 ─ ─ 31.1±1.55 30.09±1.50 ─ ─ 13.4±0.67 ─ ─ ─2-甲基丁酸异丁酯 ─ ─ ─ ─ ─ ─ 2.08±0.10 ─ ─ ─2-羟基丙酸乙酯 41.33±2.06 78.55±3.92 119.91±5.99 76.72±3.83 88.66±4.43 54.56±2.72 ─ 16.76±0.83 27.41±1.37 20±1.12 2-乙基丁酸-2-乙基己酯 ─ ─ ─ ─ 22.29±1.11 0±0 14.01±0.70 ─ ─ ─2-乙基丁酸-3-甲基苯酯 3.24±0.16 4.19±0.20 8.55±0.42 8.86±0.44 17.18±0.85 7.83±0.39 18.37±0.91 8.15±0.40 8.77±0.43 7.53±0.37 2-乙基丁酸丁酯 3.2±0.16 4.03±0.20 8.13±0.40 7.96±0.39 13.93±0.69 ─ 15.26±0.76 7.78±0.38 9.6±0.48 10±0.52 2-乙基丁酸乙酯 17.16±0.85 15.15±0.75 33.42±1.67 ─ 45.63±2.28 ─ 57.85±2.89 31.67±1.58 44.77±2.23 27.51±1.37 9-十六碳烯酸乙酯 1.35±0.06 1.52±0.07 2.23±0.11 1.1±0.05 ─ ─ ─ 1.54±0.07 2.13±0.10 ─N-辛酸异丁酯 2.51±0.12 2.08±0.10 ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─苯乙酸乙酯 6.55±0.32 6.33±0.31 11.17±0.55 10.16±0.50 36.89±1.84 26.18±1.30 34.45±1.72 11.46±0.57 31.89±1.59 30.95±1.54丙酸-2-苯乙基酯 ─ ─ ─ ─ 94.15±4.70 112.91±5.64 140.01±7.00 180.02±9.00 ─ ─丁二酸二乙酯 2.71±0.13 2.56±0.12 6.12±0.30 7.02±0.35 23.69±1.18 10.18±0.50 30.87±1.54 19.28±0.96 47.01±2.35 50±2.51二乙基丙二酸二乙酯 55.79±2.78 57.08±2.85 108.49±5.42 98.95±4.94 149.76±7.48 80±4.02 80±2.10 89.15±4.45 90±4.56 62.55±3.12癸酸乙酯 118.45±5.92 123.37±6.16 56.45±2.82 52.42±2.62 8.19±0.40 4.78±0.23 80.77±4.03 25.19±1.25 35.72±1.78 8.54±0.42环己基丙酸乙酯 ─ ─ ─ ─ 41.1±2.05 42±2.17 51.79±2.58 18.65±0.93 ─ ─己酸乙酯 28.09±1.40 11.25±0.56 7.91±0.39 5.43±0.27 9.46±0.47 5.34±0.26 11.1±0.55 2.54±0.12 3.1±0.15 5.5±0.27壬酸乙酯 7.86±0.39 4.95±0.24 1.79±0.08 1.73±0.08 2.32±0.11 ─ 3.23±0.16 ─ 2.78±0.13 ─十八酸乙酯 2.5±0.12 2.81±0.14 3.41±0.17 3.87±0.19 ─ ─ 2.97±0.14 ─ 6.43±0.32 16.87±0.84十二酸乙酯 156.24±7.81 153.62±7.68 250.76±12.53 100±5 1.81±0.09 3.57±0.17 5±0.25 5.21±0.26 13.79±0.68 6±0.32十六酸乙酯 2.22±0.11 148.3±7.41 112.92±5.64 115.7±5.78 23.54±1.17 100±5.05 89.03±4.45 120±6 234.87±11.74 200±1.23十四酸乙酯 22.57±1.12 23.88±1.19 18.46±0.92 21.33±1.06 4.67±0.23 6.65±0.33 19±0.95 3.87±0.19 31.04±1.55 2.35±0.11十五烷酸-3-甲基丁酯 2.97±0.14 1.66±0.08 ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─十五烷酸乙酯 0.77±0.03 0.87±0.04 ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─辛酸-3-甲基丁酯 9.95±0.49 7.2±0.36 0.84±0.04 ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─辛酸乙酯 600±30.01 544.01±27.20 182.07±9.10 96.61±4.83 27.22±1.36 14.55±0.72 10±0.57 8±0.42 6±0.34 4±0.22亚油酸乙酯 21.84±1.09 22.43±1.12 17.03±0.85 14.44±0.72 ─ 5.67±0.28 21.48±1.07 4.03±0.201 ─ ─乙酸-2-乙基己基酯 51.39±2.56 63.63±3.15 101±5.05 110.03±5.50 130±6.58 150.02±7.50 160.05±8.00 230.3±11.51 270.2±13.51 280.06±14.00乙酸二乙酯 551.4±27.57 ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─乙酸乙酯 312.11±15.60 414.12±20.70 618.14±30.90 900±45 1 009.11±50.451 202.24±60.111 003.12±50.161 211.56±60.571 121.68±56.081 104.24±55.21乙酸异丁酯 6.23±0.31 10.59±0.52 17.8±0.89 15.61±0.78 31.25±1.56 27.72±1.38 65.26±3.26 53.42±2.67 24.25±1.21 58.42±2.92乙酸异戊酯 52.72±2.63 65.28±3.26 137.54±6.87 145.09±7.25 230.23±11.51 221.01±11.05 223.01±11.15 231.01±11.55 235.02±11.75 231.01±11.55乙酸正丙酯 11.93±0.59 16.83±0.84 34.78±1.73 42.89±2.14 76.94±3.84 79.92±3.99 75.01±3.75 80.1±4.05 81±4.05 75.1±3.75油酸乙酯 ─ ─ ─ ─ 5.72±0.28 ─ 17.4±0.87 4.18±0.20 ─ ─正丁酸-2-乙基己基酯 ─ 1.58±0.07 5.11±0.25 6.6±0.33 13.29±0.66 ─ ─ ─ 6.53±0.32 ─2,4-二甲基苯甲醛 8.06±0.40 ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─2-乙基己醛 ─ ─ 1.59±0.07 ─ ─ ─ ─ ─ 2.89±0.14 ─3-糠醛 ─ ─ ─ 1.65±0.082 ─ ─ ─ 1.92±0.09 ─ ─苯甲醛 19.46±0.97 14.63±0.73 26.49±1.32 17.28±0.86 11.88±0.59 9.15±0.45 26.55±1.32 42.26±2.16 79.24±3.96 82.48±4.12糠醛 1.47±0.07 ─ ─ ─ 1.76±0.08 1.97±0.09 3.33±0.16 ─ 4.37±0.21 5±0.25壬醛 ─ ─ ─ ─ ─ ─ 7.36±0.36 ─ ─ ─十二（烷）醛 1.58±0.07 1.41±0.07 ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─十四烷醛 ─ ─ ─ 2.64±0.13 ─ ─ ─ ─ ─ ─2,4-二叔丁基苯酚 ─ 10.83±0.54 36.92±1.84 41.01±2.05 18.64±0.93 12.16±0.60 13.84±0.69 ─ ─ ─2,5-二(1,1-乙烷基)-苯酚 ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ 34.04±1.70 6.94±0.34 ─4-乙基苯酚 ─ ─ ─ ─ ─ 1±0.05 ─ ─ 2.14±0.10 1.49±0.074 3-羟基-2-丁酮 13.12±0.65 43.21±2.16 122.7±6.13 126.2±6.31 204.47±10.22 304.01±15.20 350±17.52 354.13±17.70 311.07±15.55 550.02±27.50苯乙酮 ─ ─ ─ 3.24±0.16 ─ ─ ─ ─ ─ ─化合物
2.3.2 浙江玫瑰醋发酵过程中挥发性成分聚类分析和主成分分析http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/4dc6b4c2e41e141c165776cfcfae5cf2.jpg&p=546x318&q=30 图 3 浙江玫瑰醋样品聚类分析
Fig. 3 Cluster analysis of Zhejiang rosy vinegar samples
由图3可以看出，聚类分析将浙江玫瑰醋发酵过程中的样品根据时间顺序分为3 类。第1类为0、10、20 d和30 d；第2类为80 d和90 d；第3类为40、50、60 d和70 d。对发酵过程中浙江玫瑰醋样品中挥发性成分进行主成分分析，共提取了4 个主成分，累计贡献率为82.10%，可以较好地反映浙江玫瑰醋中的挥发性成分。主成分分析也可以基本将发酵过程中的浙江玫瑰醋样品按时间顺序分为3 大类，结果见图4A。3 个不同发酵时期的浙江玫瑰醋样品具有明显的区域分布特征。由于主成分分析是无监督分析模型，因此各个发酵时期的玫瑰醋样品区分不明显。图4B显示，所有玫瑰醋样品都在95%Hotelling’s T2置信区间内，一般认为在99% Hotelling’s T2置信区间内是可以接受的，而在95% Hotelling’s T2置信区间内是极好的。因此所有样品都在95% Hotelling’s T2置信区间内说明没有“离散样本”，表现出显著的聚类趋势。近几年，我国气瓶充装行业得到了快速的发展，在快速发展的同时，也面临着严峻的挑战。由于气体大多数具有令人窒息、易燃、易爆、腐蚀等危险性质，再加上气瓶充装过程中涉及高压操作，稍有不慎极易引发安全生产事故。通过有效的安全设计，提升气瓶充装过程的安全性，对推动气瓶充装行业安全、稳定、健康、快速地发展具有重要意义。 http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/11d27da422d96e6a0a9300899af9882a.jpg&p=632x650&q=30 图 4 主成分得分图（A）和Hotelling’s T2分布图（B）
Fig. 4 PCA score plot (A) and Hotelling’s T2 value range plot (B)
2.3.3 浙江玫瑰醋发酵过程中挥发性成分PLS-DA结果对浙江玫瑰醋发酵过程中的挥发性成分进行主成分分析和聚类分析，可以将浙江玫瑰醋样品分为3 个阶段：前期、中期、后期。因此将发酵过程中的样品进行归类，利用PLS-DA进行分析，可以得出浙江玫瑰醋发酵各阶段的主要呈味香气成分。由表4、图5可以看出，此模型共提取4 个预测成分，这4 个预测成分的累计统计量R2X为0.752，说明该模型对挥发性成分矩阵的解释能力为0.752；R2Y为0.994，说明该模型对浙江玫瑰醋发酵过程中样品矩阵的解释能力为0.994；Q2为0.933，Q2表示模型的预测能力。通常R2和Q2高于0.50拟合准确性较好，高于0.4即可接受，预测该模型在本实验中的拟合准确性极高。表 4 PLS-DA模型分析
Table 4 Evaluation of the PLS-DA modelhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/c39449499a2a6685dde672bf17b4ebc8.jpg&q=30 类型 预测成分 N R2X R2Y Q2 PLS-DA 4 10 0.752 0.994 0.933
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/d2309986f7dba0325d6dd26a583cd856.jpg&p=598x330&q=30 图 5 PLS-DA得分图
Fig. 5 Score plot of PLS-DA
将模型建立时定义的分类Y矩阵的变量随机排列200 次，对PLS-DA模型进行检验，结果见图6。左侧的所有Q2值都低于右侧的原始点，Q2的回归线与垂直轴相交，并且相交点的值小于0，说明PLS-DA模型拟合较好，没有出现过拟合。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/39909afaa9b4e5200ec31a172aeddec8.jpg&p=694x320&q=30 图 6 置换检验图
Fig. 6 Plot of permutation test
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/3fbb8f5138d69bdc6d7bd36680f97264.jpg&p=810x410&q=30 图 7 挥发性成分VIP得分图
Fig. 7 VIP values of volatile components
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/b6660e4981e75317a2217b945511240f.jpg&p=632x354&q=30 图 8 PLS-DA因子荷载图
Fig. 8 Loading plot of PLS-DA
尹洪旭等利用PLS-DA，并通过变量投影重要性（variable importance for the projection，VIP）值确定出了不同栗香特征绿茶的特征性香气成分；吕旭聪等也利用PLS-DA并结合VIP值，确定了不同传统红曲酿造黄酒的特征性香气成分。本研究通过计算VIP值衡量各挥发性成分对浙江玫瑰醋发酵过程中的各组样本分类判别的影响强度和解释能力，从而辅助标志挥发性成分的筛选（通常以VIP值大于1.0作为筛选标准）。VIP值越大的挥发性成分，其在浙江玫瑰醋发酵过程中不同阶段含量差异越显著。从图7可以看出，VIP值大于1的挥发性成分共有25 种，因此这25 种挥发性成分可以作为浙江玫瑰醋发酵过程中不同发酵阶段的标志物。其中(E)-9-十八碳烯酸乙酯、丙酸-2-苯乙基酯、环己基丙酸乙酯、十八酸乙酯、苯甲醛、4-乙基苯酚、正丙醇、乙醇等挥发性成分VIP值较高，因此这些挥发性成分在区分浙江玫瑰醋不同发酵阶段尤为重要。因子荷载图可以反映每个变量在得分图上的贡献。从VIP值（VIP＞1）可以得到浙江玫瑰醋发酵过程中的标志挥发性成分。因此由因子和载图结合VIP值可以得到浙江玫瑰醋发酵过程中各发酵阶段的特征挥发性成分。从图8可以看出，VIP值大于1的挥发性成分中乙醇、十二酸乙酯、2-苯乙醇乙酸酯与发酵前期样品比较靠近，可作为发酵前期的特征性香气成分；VIP值大于1的挥发性成分中丙酸-2-苯乙基酯、环己基丙酸乙酯、正丙醇、乙酸正丙酯、乙酸异戊酯、癸酸、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、月桂酸、2-乙基丁酸-3-甲基苯酯、油酸乙酯与发酵中期样品比较靠近，可作为发酵中期的特征性香气成分；(E)-9-十八碳烯酸乙酯、十八酸乙酯、苯甲醛、4-乙基苯酚、丁二酸二乙酯、十六酸乙酯、糠醛、乙酸-2-乙基己基酯、苯乙醇、2-甲基丙酸、3-羟基-2-丁酮与发酵后期样品比较靠近，可作为发酵后期的特征性香气成分。3 讨 论本研究利用响应面试验，对浙江玫瑰醋中挥发性成分SPME条件进行优化，利用优化后的条件对浙江玫瑰醋发酵过程中挥发性成分进行测定，并结合多元统计分析主成分分析、系统聚类分析和PLS-DA对挥发性成分进行分析。主成分分析和系统聚类分析把浙江玫瑰醋样品分成了发酵前期、发酵中期和发酵后期3 大类，并将样品按前、中、后3 个时期进行归类后，进行PLS-DA发现3 个发酵阶段的样品基于挥发性成分可以实现良好分离，其中R2Y为0.994，Q2为0.933说明该模型具有良好的稳定性和极高的预测能力。PLS-DA得到VIP值，并结合PLS-DA因子荷载图，得出了浙江玫瑰醋发酵过程中特征性香气成分。乙醇、十二酸乙酯、2-苯乙醇乙酸酯可以作为浙江玫瑰醋发酵前期的特征性香气成分。浙江玫瑰醋在发酵前期主要进行乙醇发酵，而中后期主要进行醋酸发酵，消耗乙醇，因此在发酵前期乙醇含量较为丰富。十二酸乙酯、2-苯乙醇乙酸酯在发酵前期含量较高，说明这2 种物质主要由“发花”阶段产生，有研究表明，浙江玫瑰醋“发花”过程中具有丰富的微生物，可以产生大量的风味物质。丙酸-2-苯乙基酯、环己基丙酸乙酯、正丙醇、乙酸正丙酯、乙酸异戊酯、癸酸、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、月桂酸、2-乙基丁酸-3-甲基苯酯、油酸乙酯可以作为浙江玫瑰醋发酵中期的特征性香气成分。发酵中期的特征性香气成分主要是酸类和酯类物质，这是由于浙江玫瑰醋在发酵中期进行醋酸发酵，积累了大量的有机酸，并通过酯化反应和微生物的代谢产生酯类物质。酯类物质大多具有花香和果香味，可以赋予玫瑰醋良好的香味。2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密称取指标成分对照品各适量，加甲醇制成栀子苷、芍药苷和丹皮酚质量浓度分别为74.9、56.2、33.4 μg/mL的混合对照品溶液。 (E)-9-十八碳烯酸乙酯、十八酸乙酯、苯甲醛、4-乙基苯酚、丁二酸二乙酯、十六酸乙酯、糠醛、乙酸-2-乙基己基酯、苯乙醇、2-甲基丙酸、3-羟基-2-丁酮可以作为浙江玫瑰醋发酵后期特征性香气成分。发酵后期的浙江玫瑰醋样品中的主要呈味香气成分为酯类、醛类、酚类和酮类。苯甲醛具有甜味、果味、坚果和焦糖气味，可以赋予醋样品良好的香气。酚类物质含量虽然较低，但由于气味阈值低，其味道是食醋特有的香气。浙江玫瑰醋是江浙地区传统的发酵食醋，较好地保留了传统发酵工艺，具有独特的良好风味。由于其独特的酿造工艺，导致了浙江玫瑰醋发酵周期长、劳动强度很高、很难形成规模效益，并且很难控制玫瑰醋的品质。目前很多企业利用机械化生产工艺进行玫瑰醋的生产，但改变生产工艺会引起浙江玫瑰醋的色泽、风味的变化。阮富升等利用自吸式发酵罐进行浙江玫瑰醋的生产实验，结果表明自吸式发酵罐生产的玫瑰醋色泽、风味均显著差于传统玫瑰醋；方冠宇等利用气动搅拌发酵罐对浙江玫瑰醋进行生产实验，结果表明气动搅拌发酵罐搅拌频率分别为3 d/次和7 d/次生产的玫瑰醋挥发性成分含量显著低于传统玫瑰醋。本研究利用响应面试验，优化浙江玫瑰醋挥发性成分SPME条件，确定最佳条件为NaCl添加量2.4 g、萃取温度49.6 ℃、萃取时间44.4 min。利用PLS-DA对浙江玫瑰醋发酵过程中各发酵阶段特征性香气成分确定可以发现，发酵前期浙江玫瑰醋中的特征性香气成分种类较少，只有3 种。发酵中期和发酵后期的特征性香气成分较为丰富，发酵中期11 种、发酵后期11 种。这是由于浙江玫瑰醋发酵初期挥发性成分含量较少，而发酵中后期积累了较多的挥发性成分，因此香气成分较为丰富，这对浙江玫瑰醋生产和工艺改进中品质的监控及传统玫瑰醋的判别具有现实意义。参考文献： SMALL D M, PRESCOTT J. 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Determination of the Characteristic Aroma Components at Different Fermentation Stages of Zhejiang Rosy VinegarFANG Guanyu, JIANG Yujian*, MU Xiaojing, SHI Si
(School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China)Abstract: In this study, response surface methodology was used to optimize the solid-phase micro-extraction conditions of volatile components from Zhejiang rosy vinegar. The optimal conditions were determined as follows: NaCl amount 2.4 g,extraction temperature 49.6 ℃, and extraction time 44.4 min. The volatile components during the fermentation process of Zhejiang rosy vinegar were determined under the optimized extraction conditions. The obtained data were analyzed by principal component analysis (PCA), systematic clustering analysis (SCA) and partial least square discriminant analysis(PLS-DA). PCA and SCA divided Zhejiang rosy vinegar samples into three categories: early, middle and late fermentation.PLS-DA analysis showed that the samples at the three fermentation stages could be well separated from each other based on the volatile components with R2= 0.994, and Q2 = 0.933, indicating that the developed model has good stability andY extremely strong prediction ability. By PLS-DA analysis, the volatile components with variable importance in the projection(VIP) values larger than 1 were obtained. According to the PLS-DA factor loading plot, the characteristic aroma components at the early stage were ethanol, ethyl dodecanoate and 2-phenylethanolacetate; the characteristic aroma components at the middle stage were propionic acid-2-phenyl ethyl, cyclohexyl propionate, n-propanol, n-propyl acetate, isoamyl acetate,decanoic acid, ethyl acetate, ethyl phenylacetate, lauric acid, 2-ethylbutyrate, 3-methyl phenyl ester and ethyl oleate;and the characteristic aroma components at the late stage of fermentation were (E)-9-octadecanoic acid ethyl ester, ethyl octadecanoate, benzaldehyde, 4-ethyl phenol, diethyl succinate, ethyl hexadecate, furfural, acetate-2-ethylhexyl ester, phenyl ethanol, 2-methylpropionic acid, and 3-hydroxy-2-butanone.Keywords: Zhejiang rosy vinegar; solid phase microextraction; principal component analysis; hierarchical cluster analysis;partial least squares-discriminant analysis
收稿日期：2019-04-11基金项目：浙江省公益技术应用研究计划项目（LGG19C200001）；浙江工商大学研究生科研创新基金项目（16020000359）第一作者简介：方冠宇（1993—）（ORCID: 0000-0002-8822-2059），男，硕士，研究方向为现代食品制造。E-mail: fanggy_4216@163.com*通信作者简介：蒋予箭（1963-）（ORCID: 0000-0003-3683-1415），男，教授，学士，研究方向为现代食品制造。E-mail: 13357180599@189.cnDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190411-158中图分类号：TS264.2文献标志码：A文章编号：1002-6630（2020）08-0234-09引文格式：方冠宇, 蒋予箭, 穆晓静, 等. 浙江玫瑰醋不同发酵阶段特征性香气成分的确定. 食品科学, 2020, 41(8): 234-242.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190411-158. http://www.spkx.net.cnFANG Guanyu, JIANG Yujian, MU Xiaojing, et al. Determination of the characteristic aroma components at different fermentation stages of Zhejiang rosy vinegar. Food Science, 2020, 41(8): 234-242. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190411-158. http://www.spkx.net.cn
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