黄酒混浊蛋白组成成分及来源分析
黄酒混浊蛋白组成成分及来源分析黄酒混浊蛋白组成成分及来源分析谢广发1,2，樊世英3,4，傅建伟5，胡志明5，陆 健3,4，谭新勇3,4，孙军勇3,4,*，傅祖康2,6，王 兰5，毛青钟2,6，李国龙7（1.浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江 绍兴 312028；2.绍兴黄酒学院，浙江 绍兴 312028；3.江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122；4.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122；5.国家黄酒工程技术研究中心，浙江 绍兴 312000；6.会稽山绍兴酒股份有限公司，浙江 绍兴 312000；7.绍兴鉴湖酿酒有限公司，浙江 绍兴 312000）摘 要：采用双向电泳对混浊蛋白进行分离，并结合基质辅助激光解析电离-飞行时间串联质谱法鉴定混浊蛋白的主要种类及来源。结果表明，黄酒混浊蛋白质来源于小麦的有类燕麦蛋白A、类燕麦蛋白B、类燕麦蛋白前体、二聚α-淀粉酶抑制剂和胰蛋白酶前体等，来源于水稻的有假定蛋白OSJ_04535、假定蛋白OSI_17439和蛋白H0313F03.18。通过N-三(羟甲基)甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对黄酒酿造原料及黄酒发酵过程中蛋白质的主要组成进行分析，结果表明黄酒混浊蛋白主要来源于大米和麦曲，并且在发酵过程中难以被微生物降解，存在于发酵的整个过程中。关键词：黄酒；混浊蛋白；基质辅助激光解析电离-飞行时间串联质谱法；蛋白来源；发酵过程黄酒混浊是黄酒在贮存过程中常见的问题之一，严重影响黄酒的外观品质和销售。黄酒混浊分为生物混浊和非生物混浊。生物混浊主要由微生物引起，可以通过黄酒的生产工艺优化加以控制。非生物混浊的形成过程比较复杂，主要是黄酒中蛋白质、多肽、金属离子、糊精、多酚等物质，在温度变化、光照、振动、O2存在情况下会发生一系列变化，发生凝聚和絮凝使黄酒中胶体平衡遭到破坏，产生混浊现象。从形成的机理来说，非生物混浊可以分为蛋白质混浊、金属离子混浊、氧化混浊、酱色混浊和糊精混浊。在瓶装黄酒混浊沉淀物中蛋白质的比例高达50.56%，而黄酒酒体中蛋白质质量分数仅为1%～2%，这说明在贮存的过程中，黄酒中的蛋白质容易形成混浊。Poklar认为蛋白质和多酚类物质通过氢键或疏水键的作用形成缔合物，可形成蛋白质混浊，而形成混浊的程度与两者的浓度有关。除此之外，外界温度的变化也能引起黄酒中蛋白质的变化而引起混浊。在前期研究中，本团队发现在混浊蛋白中高分子蛋白质比例可高达70%，且蛋白质混浊的形成可能与某些特定的容易产生混浊的蛋白质有关。黄酒的酿造原料主要为稻米（糯米、粳米、籼米）、黍米等，经浸泡、蒸煮、加酒曲、糖化、发酵、压榨、过滤、煎酒（除菌）、贮存、勾兑而成。从原料及工艺可分析出，其酒体中的蛋白质来源主要为稻米和麦曲，因此通过分析发酵过程中蛋白质的变化可为后续分析黄酒混浊中蛋白质的来源提供一定理论基础。本研究通过双向电泳以及基质辅助激光解析电离-飞行时间串联质谱（matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS）对黄酒沉淀中的蛋白质进行分离与鉴定，确定黄酒混浊沉淀中蛋白质的种类。并采用N-三(羟甲基)甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，Tricine SDS-PAGE）分析不同发酵时间发酵液中蛋白质分布情况，以期从发酵过程解释黄酒混浊蛋白的来源情况，为解决黄酒蛋白质混浊提供新的思路。1 材料与方法1.1 材料与试剂瓶装黄酒购于江苏无锡当地超市，产地均为浙江绍兴。发酵过程中不同阶段的黄酒发酵液均取样于浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司。3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸、碘乙酰胺、二硫苏糖醇、尿素、固相IPG胶条（7 cm，pI 3～10，非线性）、IPG缓冲液（pH 3～10，非线性）美国GE公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸、碳酸氢铵、三氟乙酸、胰蛋白酶、乙腈 美国Sigma公司；30%丙烯酰胺单体储液、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、SDS、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、N-三(羟甲基)甘氨酸 生工生物工程（上海）股份有限公司。1.2 仪器与设备5415D高速离心机 德国Eppendorf股份公司；Mini-Protein 3 Cell蛋白电泳系统 美国Bio-Rad公司；Ultraflextreme串联飞行时间质谱仪 德国Bruker公司；UV-2100紫外-可见分光光度计 尤尼克（上海）仪器公司。1.3 方法1.3.1 黄酒混浊蛋白的制备按照文献方法进行样品制备，提取粗蛋白质，TCA-丙酮法去除杂质，得到混浊蛋白质样品。1.3.2 黄酒酿造过程发酵液中蛋白质的收集取发酵过程中不同阶段的黄酒发酵液50 mL，滤纸过滤，滤液4 ℃、12 000 r/min离心30 min，取上清液与等体积的预冷20% TCA溶液混合，振荡混匀后在冰浴条件下放置2 h沉淀蛋白质，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清液，在沉淀中加入-20 ℃预冷的丙酮，振荡混匀，-20 ℃放置1 h，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清液，如此重复洗涤3 次。收集沉淀，放于-20 ℃冰箱中至丙酮完全挥发。1.3.3 酿造原料中蛋白质样品的制备当时图灵只有23岁。他提出了一个不俗的构想，主张建构一种“通用机器”。这种机器只是一种思想实验中的装置，但它是人类历史上最具影响力的机器。图灵设想的机器，可以通过运用存在于储存器中的逻辑运算解决一切数学问题，这种机器就是“图灵机”。图灵的工作推动了一场计算与认知的实践转向。他第一个提出在计算机运行中采用逻辑代码以模拟人类的各种计算和推理过程，这成了后人设计实用计算机的思想来源，也成为当今各种计算机理论的基石。今天世界计算机科学领域的最高荣誉奖称为“图灵奖”，相当于计算机科学界的诺贝尔奖。 1.3.3.1 黄酒酿造原料浸提液的获得病毒病一般出现在油菜抽薹阶段，这一阶段的油菜一旦感染病毒病，将会严重影响油菜籽的产量。油菜感染病毒病的表现会因油菜品种的不同出现一定的差异。对于甘蓝型油菜来说，感染病毒病的表现为叶子发黄并出现黄色斑点，叶片会自斑点向外逐渐枯死；对于白菜型油菜来说，感染病毒病的表现为叶子出现褪色的现象，并且褪色是由叶脉开始逐渐扩散，还会出现明显的花叶。油菜感染病毒病需要及时防治，以免影响油菜抽薹。 总之，对社会资本的追求实现了现实人向虚拟人的转化，甚至可以将其视为整个网络民主的原点。而网络主体的形成则经历了若干阶段和形态的演变，并内含一种由低级向高级发展的线性思维。网络主体的形成将是网络民主兴起的第一要素。 二是风险意识不足，风险管理不当。长时间以来，我国公立高等院校的办学经费都是以国家财政拨款为主，学校考虑的只是招生就业、教育教学、科研及学术研究等工作，几乎不关注管理及财务风险。然而随着办学规模的扩大，资金来源渠道增多，涉及的业务也趋复杂，内外部风险增加，财务风险和管理风险并存。部分高校虽已建立起基本的风险评估体系，或形成风险清单，确定了风险的应对策略和方法，但由于教职员工普遍缺乏必要的风险意识，对风险管控的认识停留在过去的层面，使得在执行风险管理措施时常常力不从心。 分别称取5 g生麦曲、熟麦曲、蒸熟的大米于烧杯中，加入pH 4.2的0.1 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液20 mL和一片Complete蛋白酶抑制剂混合物，搅拌混匀，置于4 ℃冰箱中浸提过夜，然后用滤纸过滤，将滤液转入离心管中，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，上清液即为黄酒原料中麦曲、大米的浸提液。Study on the Teaching Total Quality Management of Management Postgraduate 1.3.3.2 原料中蛋白质样品的制备取一定量的原料浸提液于离心管内，加入同等体积的预冷20% TCA溶液，振荡混匀后在冰浴条件下放置2 h沉淀蛋白质，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清液，在沉淀中加入-20 ℃预冷的丙酮，振荡混匀，-20 ℃放置1 h，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清液，重复洗涤3 次。收集沉淀，置于-20 ℃冰箱中至丙酮完全挥发。1.3.4 双向电泳文学性是《文联》与生俱来的一种属性。它不仅以发表各种载体的文学作品吸引读者阅读，而且逐渐成了规模，支配、规范文体的成熟。《文联》中最具文学性的作家当属鲁迅，其中《关於「文坛」和智识分子(鲁迅书简)》，这里谈到文人文笔会受到环境的影响，“浙北人直爽，而失之粗，南人文雅，而失之伪”。鲁迅先生强调无论哪一种文风，都不可摒弃其文学性，强调其“首先是文学的，其次才是启蒙的”。臧克家的《斗争，前进！》就强调文艺要始终走在前线，其文学性会感染人，呼吁人走上斗争的道路。《文联》对文学性的强调是贯穿始末的，表现在直接或间接的引导、支配规范文学的发展。 将去除杂质后的混浊蛋白用样品水化液进行溶解，考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白浓度。参照GE公司的《双向电泳操作手册》水化上样，水化12 h左右，进行第一向等电聚焦，按照参考文献设定等电聚焦程序，等电聚焦完成后，用平衡液对胶条进行平衡，采用14%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行第二向SDS-PAGE，电泳结束后进行染色、脱色直至背景清晰，拍照分析。1.3.5 MALDI-TOF-MS质谱鉴定参考文献进行。1.3.6 蛋白质的PAGE适配体因与不同待测物结合后折叠构象的不同，而表现出较高的选择性，从而引起其上带负电荷的磷酸基团远离电极表面，进而引起电位的改变。适配体较高的选择性和灵敏度可将电位传感器的检测限降低至fmol·L-1。 参考文献进行。1.4 数据分析及统计采用软件Image j对SDS-PAGE胶中的蛋白条带进行灰度分析及定量计算。2 结果与分析2.1 黄酒混浊蛋白的双向电泳分析通过对不同样品进行离心去杂、TCA-丙酮沉淀获得蛋白样品，使用7 cm、pH 3～10、非线性的IPG胶条进行双向电泳实验，获得的双向电泳图谱见图1。结果表明，不同瓶装黄酒中混浊蛋白的分布基本相近，主要分为酸性蛋白区和低分子碱性蛋白区。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/f8180b013e7219b46ba017e868e396e4.jpg&p=770x556&q=30 图 1 不同酒样混浊蛋白的双向电泳图谱Fig. 1 2-DE profiles of haze-active proteins in different Chinese yellow rice wine samples
2.2 黄酒混浊蛋白的MALDI-TOF-MS分析通过表1质谱鉴定结果发现，碱性端的蛋白主要为类燕麦蛋白和水稻的假定蛋白，酸性端的蛋白为二聚α-淀粉酶抑制剂。类燕麦蛋白是小麦的贮存蛋白，分为A亚型和B亚型2 种蛋白质。A亚型蛋白质含有168 个氨基酸，其中谷氨酸数量为36 个，占氨基酸总量的21%，B亚型蛋白质含有284 个氨基酸，其中谷氨酸数量为80 个，占氨基酸总量的28%。类燕麦蛋白前体是形成燕麦蛋白的前体蛋白，含有181 个氨基酸，其中谷氨酸含量为44 个，占氨基酸总量的24%。这些蛋白中含大量谷氨酸，与氨基酸分析中谷氨酸含量偏高相符合，说明黄酒混浊中谷氨酸含量偏高与小麦的类燕麦蛋白有关。类燕麦蛋白含有一定数目的半胱氨酸，存在分子内和分子间的二硫键，可以形成高分子聚合体，对混浊形成有重要影响。研究发现类燕麦蛋白来源于小麦胚乳，属于低分子质量谷蛋白，对小麦的加工品质有重要影响。表 1 黄酒混浊蛋白质谱鉴定结果
Table 1 Identification of haze-active proteins of Chinese yellow rice wine by MALDI TOF-MShttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/988b4eebc2e0b248a4307c0092b9f7bf.jpg&q=30 注：双向电泳用IPG胶条为7 cm，pH 3～10，非线性。取点 鉴定结果 理论等电点理论分子质量/kDa 来源类燕麦蛋白B 7.8 33.3 小麦2 二聚α-淀粉酶抑制剂 5.8 15.6 小麦3 二聚α-淀粉酶抑制剂 5.7 13.9 小麦4 二聚α-淀粉酶抑制剂 5.8 15.6 小麦5胰蛋白酶前体 5.06 26.9 小麦6类燕麦蛋白A 8.42 19.2 小麦7类燕麦蛋白A 8.42 19.2 小麦8 二聚α-淀粉酶抑制剂 5.8 15.7 小麦9 类燕麦蛋白前体 8.42 20.7 小麦10 假定蛋白OSJ_04535 10.36 29.7 水稻11 假定蛋白OSJ_04535 10.36 29.7 水稻12 假定蛋白OSJ_04535 10.36 29.7 水稻13 假定蛋白OSI_17439 8.95 36.3 水稻14 二聚α-淀粉酶抑制剂 5.8 15.6 小麦15 二聚α-淀粉酶抑制剂 5.8 15.6 小麦16 类燕麦蛋白前体 8.42 20.7 小麦17 类燕麦蛋白前体 8.42 20.7 小麦18 蛋白H0313F03.18 8.88 36.1 水稻19 假定蛋白OSI_17439 8.95 36.3 水稻20 二聚α-淀粉酶抑制剂 5.8 15.7 小麦21 二聚α-淀粉酶抑制剂 5.8 15.7 小麦22 类燕麦蛋白前体 8.42 20.7 小麦23 假定蛋白OSJ_04535 10.36 29.7 水稻24 假定蛋白OSJ_04535 10.36 29.7 水稻25 假定蛋白OSI_17439 8.95 36.3 水稻26 二聚α-淀粉酶抑制剂 5.8 15.7 小麦27 二聚α-淀粉酶抑制剂 5.8 15.7 小麦28 二聚α-淀粉酶抑制剂 5.7 13.9 小麦29 假定蛋白OSJ_04535 10.36 29.7 水稻30 类燕麦蛋白前体 8.42 20.7 小麦31 假定蛋白OSI_17439 8.95 36.3 水稻32 假定蛋白OSI_17439 8.95 36.3 水稻33 类燕麦蛋白前体 8.42 20.7 小麦1
对鉴定结果中不同来源的蛋白点进行简单统计，如表2所示。在33 个蛋白点中来源于小麦的有21 个蛋白点，水稻的有12 个蛋白点，小麦蛋白在混浊蛋白中占有较大比重。来源于小麦的混浊蛋白有5 种，分别为类燕麦蛋白A、类燕麦蛋白B、类燕麦蛋白前体、二聚α-淀粉酶抑制剂、胰蛋白酶前体，以二聚α-淀粉酶抑制剂、类燕麦蛋白前体为主，来源于水稻的混浊蛋白有3 种，分别为假定蛋白OSJ_04535、假定蛋白OSI_17439和蛋白H0313F03.18，以2 种假定蛋白为主。表 2 黄酒混浊蛋白来源分析
Table 2 Source analysis of haze-active proteins in Chinese yellow rice winehttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/1c055a73d1cdfa4b67ececbec074efc4.jpg&q=30 来源 蛋白质名称 蛋白点数量小麦 类燕麦蛋白B 1小麦 二聚α-淀粉酶抑制剂 11小麦 胰蛋白酶前体 1小麦 类燕麦蛋白A 2小麦 类燕麦蛋白前体 6水稻 假定蛋白OSJ_04535 6水稻 假定蛋白OSI_17439 5水稻 蛋白H0313F03.18 1
二聚α-淀粉酶抑制剂是普遍存在于植物种子中的一种酶抑制剂，可以控制内生性淀粉酶的活性，也可以防御病原菌和昆虫的侵害。研究发现α-淀粉酶抑制剂在pH 4～11时性质稳定，在80 ℃作用30 min后活性仅降低10%左右，由于热稳定性强，在黄酒加热杀菌过程中，α-淀粉酶抑制剂没有失活变性，仍会残留在酒液中，在贮存过程中因为外界环境的变化导致其逐渐析出形成混浊。有5 种混浊蛋白来源于小麦，说明小麦对黄酒蛋白质混浊有重要影响。小麦自身含有的α-淀粉酶抑制剂在发酵过程中会抑制淀粉酶活性，导致淀粉分解不彻底，部分糊精会残留在酒液中，随着环境变化糊精会析出，加重黄酒的非生物混浊，但对于其具体的作用过程还需要进一步研究。假定蛋白是功能未知的蛋白，对于水稻中鉴定出的假定蛋白，对其功能以及在混浊形成过程中的作用还有待研究。2.3 黄酒混浊蛋白质Tricine-SDS-PAGE分析http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/9a35dbf6f0c98dd7e3c0420e37723e45.jpg&p=780x332&q=30 图 2 发酵原料及过程中黄酒蛋白质Tricine-SDS-PAGE
Fig. 2 Tricine-SDS-PAGE profiles of proteins from Chinese yellow rice wine precipitants, raw materials and fermented mash
对混浊蛋白、发酵原料（生麦曲、熟麦曲、大米）及酿造过程中的发酵液进行Tricine-SDS-PAGE分析，结果见图2。泳道1的混浊蛋白有两条比较明显的条带，经软件计算分子质量分别约为14.1 kDa和27.6 kDa，对2 个条带所占混浊蛋白的百分含量进行积分光密度计算，分别为75.4%和24.6%。从图2可以看出，在麦曲和大米中存在与混浊蛋白分子质量一致的27.6 kDa的蛋白质，说明分子质量在27.6 kDa左右的混浊蛋白质主要来源于麦曲和大米，14.6 kDa的条带存在于混浊蛋白和麦曲中，因此麦曲是分子质量14.6 kDa左右混浊蛋白的主要来源，这与表1鉴定结果中各蛋白质的来源一致。在黄酒发酵的前2 d，原料中的大部分蛋白质溶于发酵液中，主要包括5.6～14.4、23.5、27.6～35.0 kDa和55.4 kDa的蛋白质，从第3天开始，发酵液中的蛋白质变化较为明显，分子质量8.0 kDa以下的小分子蛋白质显著减少，直至完全消失，8.0～14.4、23.5 kDa和35 kDa的蛋白质也随着发酵时间的推移逐渐减少，当发酵结束后完全消失。在第21天的发酵液中，仅存在5 个条带，标记为a～e，其中a、d、e 3 个条带在发酵过程中被降解逐渐减少，而b和c两个条带的刚开始发酵时含量较低，但在发酵过程中并未减少，一直存留至发酵结束，这说明b和c这2 个条带所含有的蛋白质难以被降解，而条带c也是组成混浊蛋白的主要蛋白质。经MALDI-TOF-MS鉴定，条带a～e分别为β-淀粉酶、木聚糖酶抑制蛋白I、几丁质酶II、α-淀粉酶抑制剂、病程相关蛋白，除了木聚糖酶抑制蛋白I之外，其他几种蛋白质都在混浊蛋白中出现，由此可见，原料带入发酵过程的未完全降解的蛋白质为蛋白质混浊提供了物质基础。3 结 论黄酒混浊蛋白主要分布为酸性蛋白区和低分子碱性蛋白区，质谱鉴定发现黄酒的混浊蛋白主要来源于小麦和水稻，分子质量在13～37 kDa之间，其中5 种来源于小麦，包括富含谷氨酸的类燕麦蛋白A、类燕麦蛋白B和类燕麦蛋白前体，还有二聚α-淀粉酶抑制剂和胰蛋白酶前体，来源于水稻的假定蛋白OSJ_04535、假定蛋白OSI_17439和蛋白H0313F03.18。这些蛋白共同构成了黄酒的混浊蛋白。Tricine-SDS-PAGE分析发现混浊蛋白的分子质量约为14.1 kDa和27.6 kDa，占比分别为75.4%和24.6%。在黄酒酿造过程中，原料中的蛋白质种类随着发酵时间延长逐渐减少，黄酒中蛋白质的条带越来越少，但与混浊蛋白质分子质量一致的条带始终存在，这说明黄酒混浊蛋白质主要来源于黄酒酿造原料麦曲和大米，这与质谱鉴定的结果一致，并且在黄酒的酿造过程中一直存留于发酵液中。因此，对黄酒原料或工艺进行优化，减少发酵过程中混浊蛋白的含量，可以有效地控制黄酒的蛋白质混浊。参考文献： 陈玉颖, 邹毅, 王帅静, 等. 发酵酒储藏期间浑浊沉淀类型及澄清措施. 中国酿造, 2018, 37(6): 10-14. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2018.06.003. 顾国贤. 酿造酒工艺学. 2版. 北京: 中国轻工业出版社, 2018:454-517. 刘文容. 黄酒陈酿过程中酸败乳酸菌的分离鉴定及其特性研究.无锡: 江南大学, 2017. 李敏, 韩惠敏, 耿敬章, 等. 黄酒的混浊沉淀及其控制研究进展.酿酒, 2019, 46(2): 31-35. DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2019.02.014. 李国龙, 金一鸣. 黄酒非生物混浊的研究进展. 酿酒, 2013, 40(1):34-37. DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2013.01.010. 王一菲, 林峰, 蔡小芸. 黄酒非生物稳定性主要影响因素的研究.嘉兴学院学报, 2012, 24(3): 66-69. 蔡小云. 黄酒乙醇: 浊度法及其机理研究. 杭州: 浙江大学, 2008. 汪建国, 汪琦. 黄酒非生物混浊的原因及解决办法. 中国酿造,2006(8): 57-59. DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.2006.08.015. 刘剀, 王霖. 黄酒的非生物性混浊及预防. 酿酒科技, 2004(5): 98-99. DOI:10.3969/j.issn.1001-9286.2004.05.034. 高恩丽, 帅桂兰, 赵光鳌, 等. 黄酒中的冷混浊和氧化混浊. 酿酒,2001, 28(2): 46-47. DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2001.02.012. 谢广发, 沈斌, 胡志明, 等. 黄酒中的另一种沉淀: 草酸钙沉淀.酿酒, 2011, 38(3): 26-28. DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2011.03.009. 白少勇. 黄酒中蛋白质的沉淀机理与处理方法的研究. 杭州:浙江大学, 2005. 齐小慧, 孙军勇, 谢广发, 等. 蛋白质对黄酒品质影响的研究进展.食品与发酵工业, 2018, 44(3): 273-279. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015364. 钱俊青, 张笑麟, 张西宁. 黄酒析出物化学成份的分析测定. 食品科学, 1997(3): 45-49. 谢广发, 孟中法, 周建弟. 黄酒蛋白质的测定及其沉淀原因探讨.酿酒科技, 2002(3): 64-68. DOI:10.3969/j.issn.1001-9286.2002.03.024. 谢广发, 周建弟, 胡志明, 等. 瓶装黄酒酒脚成分的测定. 酿酒科技, 2002(6): 80. DOI:10.3969/j.issn.1001-9286.2002.06.031. 丁关海, 周建弟. 黄酒非生物性沉淀的成分及解决方法. 酿酒,2003, 30(3): 42-43. DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2003.03.021. POKLAR U N. Analytical techniques for the study of polyphenolprotein interactions. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2017, 57(10): 2144-2161. DOI:10.1080/10408398.2015.1052040. 杨国军, 俞关松, 尉冬青. 黄酒中蛋白质分布及含量与酒质稳定性关系的研究. 中国酿造, 2005(10): 47-49. DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.2005.10.017. 樊世英, 孙军勇, 谢广发, 等. 澄清剂对黄酒混浊蛋白去除效果的研究. 食品工业科技, 2015, 36(8): 167-170. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.025. 谭新勇. 黄酒非生物混浊的初步研究. 无锡: 江南大学, 2013. 国家标准化管理委员会. 黄酒: GB/T 13662—2018. 北京: 中国标准出版社, 2018. 孔令琼. 黄酒麦曲浸提液的宏蛋白质组学研究. 无锡: 江南大学,2011. 张波. 绍兴黄酒麦曲及其制曲过程的宏蛋白质组学研究. 无锡:江南大学, 2012. DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.2014.02.025. 樊世英. 黄酒蛋白稳定性的初步研究. 无锡: 江南大学, 2015. 孙军勇, 樊世英, 谢广发, 等. 绍兴黄酒混浊蛋白的分离鉴定及其氨基酸组成、二级结构分析. 食品与发酵工业, 2016, 42(2): 1-5.DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602001. 赵丹阳, 王卫东, 张嘉程, 等. 小麦新型Avenin-like type b基因克隆、功能预测及品质相关分析. 麦类作物学报, 2017, 37(10): 1265-1275. DOI:10.7606/j.issn.1009-1041.2017.10.01. PRIYA S, KUMAR S, KAUR N, et al. Specificity of α-amylase and trypsin inhibitor proteins in wheat against insect pests. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, 2013, 41(1): 49-56.DOI:10.1080/01140671.2012.722112. WANG X, APPELS R, ZHANG X, et al. Protein interactions during flour mixing using wheat flour with altered starch. Food Chemistry,2017, 231: 247-257. DOI:10.1016/j.foodchem.2017.03.115. BIRTE S, KENJI F, PETER K, et al. Proteinaceous α-amylase inhibitors. Biochimica et Biophysica Acta, 2004, 1696: 145-156.DOI:10.1016/j.bbapap.2003.07.004. 于雪慧. 新疆奶花芸豆中α-淀粉酶抑制剂及凝集素的提取、分离、鉴定. 石河子: 石河子大学, 2018. WEI Z, BENJAMIN L S, TAN X L, et al. The role of thermostable proteinaceous α-amylase inhibitors in slowing starch digestion in pasta. Food Hydrocolloids, 2018, 90: 214-217. DOI:10.1016/j.foodhyd.2018.12.023. BHARATI P, MANOJ S, PRADEEP S. Molecular phylogenetic and sequence variation analysis of dimeric α-amylase inhibitor genes in wheat and its wild relative species. Plant Gene, 2016(6): 48-58.DOI:10.1016/j.plgene.2016.03.004. LIM J, ZHANG X W, FERRUZZI M G, et al. Starch digested product analysis by HPAEC reveals structural specificity of flavonoids in the inhibition of mammalian α-amylase and α-glucosidases. Food Chemistry, 2019, 288: 413-421. DOI:10.1016/j.foodchem.2019.02.117.
Composition and Sources of Haze-Active Proteins in Chinese Yellow Rice WineXIE Guangfa1,2, FAN Shiying3,4, FU Jianwei5, HU Zhiming5, LU Jian3,4, TAN Xinyong3,4, SUN Junyong3,4,*,
FU Zukang2,6, WANG Lan5, MAO Qingzhong2,6, LI Guolong7
(1. College of Biology and Environmental Engineering, Zhejiang Shuren University, Shaoxing 312028, China;2. College of Shaoxing Huangjiu, Shaoxing 312028, China; 3. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;4. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;5. National Engineering Research Center for Chinese Huangjiu, Shaoxing 312000, China;6. Kuaijishan Shaoxing Wine Co. Ltd., Shaoxing 312000, China; 7. Shaoxing Jianhu Brewing Co. Ltd., Shaoxing 312000, China)Abstract: The main components of haze-active proteins in Chinese yellow rice wine were separated by two-dimensional electrophoresis (2-DE), and then identified by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS). The haze-active proteins derived from wheat included avenin-like protein A, avenin-like protein B, avenin-like precursor, dimeric alpha-amylase inhibitor and trypsin precursor, and those derived from rice included hypothetical protein OSJ_04535, hypothetical protein OSI_17439 and protein H0313F03.18. By analyzing the major protein components of raw materials for the rice wine and samples collected during the fermentation process by Tricine SDS-PAGE,it was found that the haze-active proteins were mainly derived from rice and wheat koji. The haze-active proteins were difficult to degrade by microorganisms during fermentation and existed throughout the whole fermentation process.Keywords: Chinese yellow rice wine; haze-active proteins; matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry; protein sources; fermentation process
收稿日期：2019-06-17基金项目：浙江省公益技术研究计划项目（LGN20C200016）；浙江树人大学“中青年学术项目团队”项目；“十三五”国家重点研发计划重点专项（2016YFD0400504）；浙江省重点研发计划项目（2017C02006）第一作者简介：谢广发（1969—）（ORCID: 0000-0001-9137-6967），男，教授级高级工程师，硕士，研究方向为黄酒酿造技术。E-mail: xiegf632@126.com*通信作者简介：孙军勇（1976—）（ORCID: 0000-0001-8045-3090），男，讲师，博士，研究方向为酿酒科学与工程。E-mail: jysun@jiangnan.edu.cnDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190617-177中图分类号：TS262.4文献标志码：A文章编号：1002-6630（2020）08-0215-05引文格式：谢广发, 樊世英, 傅建伟, 等. 黄酒混浊蛋白组成成分及来源分析. 食品科学, 2020, 41(8): 215-219. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190617-177. http://www.spkx.net.cn工程领域的三维模型设计软件有很多种，各有特点，在实践中都得到了很好的应用。其中，Smart 3D是Intergraph公司出品的工程系列软件之一，是目前国内外主推的一款工程模型软件，其内容丰富、功能强大，基于服务器可实现各专业数据模型的实时在线修改、存储和共享。通过定制三维模型，可以精确建立模型的外形尺寸，完全展现装置的真实样貌。同时，该软件支持与Excel和AUTO CAD等文件的数据交互，可以基于模型生成需要的图纸、表单。 “奉献清洁能源，打造绿色企业”，这是中国石化一直以来的倡导。在每年的公众开放日，年轻的讲解员们借助智能机器人、小视频，让大家能深刻地了解油气及石化产品从生产、加工到使用的一整套环节，也深刻地了解到了中国石化为老百姓平时的节能减排，环境保护方面做出的突出贡献。这种近距离的接触，不仅展示了企业的社会责任、技术革新，而且感染了前去参观的老百姓，让他们更深地体会到应该节约能源、绿色生活。 XIE Guangfa, FAN Shiying, FU Jianwei, et al. Composition and sources of haze-active proteins in Chinese yellow rice wine. Food Science, 2020, 41(8): 215-219. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190617-177.http://www.spkx.net.cn
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