新疆维吾尔族肠道中高产胞外多糖双歧杆菌的筛选及其抗...
新疆维吾尔族肠道中高产胞外多糖双歧杆菌的筛选及其抗氧化活性新疆维吾尔族肠道中高产胞外多糖双歧杆菌的筛选及其抗氧化活性蔡静静，徐晓裕，张 艳，张亚川，魏小晶，阚泽宇，倪永清*（石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000）摘 要：使用Wilkins-Chalgren厌氧菌琼脂和BSM培养基作为筛选平板，结合重复基因外回文序列-聚合酶链式反应和16S rRNA序列分析，对新疆维吾尔族婴儿及其母亲粪便中的双歧杆菌（Bifidobacterium）进行分离鉴定，并筛选出高产胞外多糖的双歧杆菌，测定其多糖的抗氧化活性以及菌株的耐受性和黏附性。结果显示，20 份粪便样品中共分离出52 株双歧杆菌，其中假小链双歧杆菌（B. pseudocatenulatum）14 株，假长双歧杆菌（B. pseudolongum）8 株，两歧双歧杆菌（B. bifidum）9 株，短双歧杆菌（B. breve）7 株，长双歧杆菌婴儿亚种（B. longum subsp.infantis）5 株，动物双歧杆菌乳亚种（B. animal subsp. lactis）6 株以及长双歧杆菌（B. longum）3 株。经过表型初筛和苯酚-硫酸法复筛，共筛选出7 株高产胞外多糖的双歧杆菌，37 ℃发酵36 h后胞外多糖产量均可达400 mg/L以上。抗氧化活性实验结果表明7 株双歧杆菌所产的胞外多糖对过氧化氢自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基均有一定的清除能力。此外，菌株BF66-16相较于其他几株双歧杆菌具有较强的胃肠液耐受性以及黏附性，因此来源于婴儿粪便的BF66-16可以作为潜在的抗氧化菌株应用于制药和食品工业中。关键词：双歧杆菌；重复基因外回文序列-聚合酶链式反应；胞外多糖；抗氧化活性双歧杆菌（Bifidobacterium）是人体肠道内一类重要的益生菌，具有抗肿瘤、抗氧化、降胆固醇、维持肠道菌群平衡和免疫调节等生理功能。双歧杆菌胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是其生长代谢过程中产生的次级代谢产物，属于高分子生物聚合物，它们附着在细胞表面或分泌到环境中。目前报道的产生EPS的双歧杆菌包括B. animalis、B. breve、B. longum、B. bifidum、B. longum subsp. infantis、B. pseudocatenulatum和B. adolescentis。近年来，关于乳酸菌EPS的功能及其在奶制品中的应用报道有很多，然而关于双歧杆菌EPS的研究却很少。研究表明，双歧杆菌产生的EPS不仅可以调节肠道菌群结构并发挥其生物活性作用促进宿主健康，还可以作为保护层帮助双歧杆菌在胃肠道逆环境中存活，Alp等从母乳喂养的婴儿粪便中分离出31 株双歧杆菌，发现EPS产量与其耐酸耐胆盐能力之间呈正相关。高产EPS是选择益生双歧杆菌的一个重要特征。坑道工程口部伪装是工程防护重要研究方向之一，一些工程在施工过程中破坏了原有地貌，伪装时需要轻质仿石器材来模拟口部附近的真山石，造成口部是一些普通石块的假象，从而形成有效欺骗。随着园林行业的发展、仿石技术的进步，在可见光波段模拟山石已非难事。然而军事侦察主要波段除了可见光外还有近红外、热红外、雷达等波段，而真山石的光学、热红外和雷达波段特征具有独特性，园林仿石很容易被揭露。所以，能起到伪装作用的仿石器材需要一些新技术、新材料才能达到对抗多频谱侦察的需要。 生物体内的氧化应激是由活性氧（reactive oxygen species，ROS）的负荷或积累增加引起的，当ROS在生物体中的积累过多时会对DNA、碳水化合物、脂质和蛋白质造成损害，一般使用抗氧化剂中和这些ROS。国内外许多研究表明双歧杆菌EPS具有一定的抗氧化活性，Li Shengjie等发现从人粪便内分离的B. bifidum WBIN03产生的EPS对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基有较强的清除能力；有学者比较了从广西长寿老人粪便中分离的B. animalis RH两个级分EPS（中性EPS和酸性EPS）的体外抗氧化活性，发现它们对脂质过氧化和DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基均显示出抑制作用。新疆独特的地理位置、特殊的文化习俗和饮食习惯为天然益生菌的开发提供了丰富的资源。本研究对新疆维吾尔族肠道中筛选的双歧杆菌进行EPS产量测定，并探究其所产EPS的抗氧化活性，菌株在模拟胃肠液中的存活情况以及体外黏附性，进而筛选出EPS产量高、抗氧化活性好且能够以较高的数量在胃肠道中存活的双歧杆菌，以期为后续开发适合少数民族群体的抗氧化型产品提供理论支持。1 材料与方法1.1 材料与试剂Wilkins-Chalgren厌氧菌琼脂参考文献；BSM培养基：在MRS培养基基础上每升添加0.5 g半胱氨酸盐酸盐、50 mg莫匹罗星、25 mg制霉菌素；脱脂乳培养基：每升90 g脱脂乳、3.5 g酵母提取物、3.5 g蛋白胨和10 g葡萄糖，105 ℃灭菌10 min。DNA提取试剂盒 北京全式金生物技术有限公司；Tris碱、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、邻苯三酚、浓盐酸、硫酸亚铁、过氧化氢、无水乙醇、无水甲醇、三氯化铁、铁氰化钾、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）（均为分析纯） 北京博奥拓达科技有限公司。1.2 仪器与设备多功能酶标仪 美国BioTek仪器有限公司；pH计梅特勒-托利多仪器有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 英国Techne公司；HWS智能型恒温恒湿培养箱 太仓市华美生化仪器厂；H2050R-2离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；厌氧培养箱 英国DWS公司；水平电泳仪、凝胶成像系统美国Bio-Rad公司。1.3 方法1.3.1 样品采集及预处理样品采自新疆维吾尔族的婴儿粪便及其母亲粪便。使用粪便采样器采集样品，置于车载冰箱中-20 ℃保存，24 h之内转运至实验室。1.3.2 双歧杆菌的分离、纯化和保藏样品用无菌生理盐水稀释至10-5、10-6、10-7、10-8，分别吸取原液和样品稀释液100 μL涂布均匀于Wilkins-Chalgren厌氧菌琼脂和BSM平板上，每个梯度3 个平行。将平板置于37 ℃厌氧培养箱中培养2～3 d，挑取平板上的单菌落进行革兰氏染色，并使用相差显微镜观察细胞形态，选择具有双歧杆菌典型特征的菌落在平板上继续划线纯化，直至镜检菌体细胞的形态和排列方式一致。将所选菌株液体富集后加甘油和新鲜液体培养基用2 mL冻藏管放置于-20 ℃冰箱保藏备用。1.3.3 双歧杆菌的生物学鉴定1.3.3.1 基因组DNA的提取从经济性和焊接材料使用的广泛性考虑，NiCrMo-3型焊接材料可以满足N03867超级奥氏体不锈钢管道的焊接，即GTAW焊丝选用ERNiCrMo-3，SMAW焊条选用ENiCrMo-3。 按照社会婚姻家庭工作的管理属性、服务属性，以及民生属性，“家和计划”项目也属于社会管理和公共服务综合标准化的一种。“家和计划”项目作为婚姻家庭社会工作标准化建设亮点之一，旨在为辖区居民提供专业、多样的婚姻家庭辅导服务，助力“和谐社区、幸福重庆”的建设。 使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA。1.3.3.2 重复基因外回文序列-聚合酶链式反应（repetitive extragenic palindromic-polymerase chain reaction，rep-PCR）指纹图谱去重表 1 PCR扩增体系和程序Table 1 PCR amplification system and programhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/bb9d09cd195ddba25418fdc4a58a29f5.jpg&q=30 BOXA1R引物 双歧杆菌属引物体系 程序 体系 程序Mixture 12.5 μL 95 ℃预变性7 min Mixture 12.5 μL 95 ℃预变性5 min DNA 3 μL 94 ℃变性1 min DNA 1 μL 94 ℃变性30 s ddH2O 8 μL 52 ℃退火1 min ddH2O 10.5 μL 62 ℃退火40 s BOXPrimer 1.5 μL 65 ℃延伸8 min Bifid-R 0.5 μL 72 ℃延伸1 min 65 ℃延伸16 min Bifid-F 0.5 μL 72 ℃延伸10 min
使用引物BOXA1R（5’-CTACGGCAAGG CGACGCTGACG-3’）对提取的菌株DNA进行PCR扩增。rep-PCR扩增体系和条件如表1所示，35 个循环，扩增产物用1.2 g/100 mL的琼脂糖凝胶电泳检验，电泳结束后，在紫外凝胶成像仪中观察电泳结果并拍照，用软件Gel Compar II对DNA图谱进行聚类分析。DNA带型完全一致的菌株通常被认为属于同一物种，可据此将分离所得菌株归为若干种系型，并从每组中选取至少1 株代表菌株进一步测序分析。1.3.3.3 16S rDNA片段扩增与检测②河库灌区量水测站按照经济、合理、实用原则，全面规划，统一布设，合理确定量水设施的形式和数量。各级固定渠道分水口因地制宜设置自动化、半自动化或人工量水测站。对于数量庞大的田间渠道分水口，应采用简单、实用的量水设施。 一是出台行动方案。为确保专项检查行动有序开展，该局出台了行动方案，方案中明确了专项行动的工作目标、检查范围、重点检查内容、检查步骤和时间节点，明晰了采购人、采购主管部门、采购监管部门各自的主体责任。要求各采购人建立主要领导亲自过问、分管领导具体部署、指定专人负责抓落实的专项检查工作机制。还设立了专项检查投诉举报电话（投诉箱）。 为确保准确性，使用双歧杆菌属引物（Bifid-R：5’-GGTGTTCTTCCCGATATCTACA-3’；Bifid-F：5’-CTCCTGGAAACGGGTGG-3’）对去重后的菌株DNA进一步扩增，体系和程序如表1所示，35 个循环，选择单一且明亮的条带用细菌的通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）进行16S rDNA基因片段扩增。扩增体系和程序参考Prasanna等的方法进行。扩增产物送至上海生工生物科技有限公司测序。序列在NCBI核酸数据库中进行BLAST在线分析，搜索与其相似性最高的序列，利用MEGA 5.0.5构建发育树，确定待测菌株的种属。1.3.4 产EPS双歧杆菌的筛选1.3.4.1 产糖菌株初筛菌株活化后，吸取100 μL菌液涂布于MRS平板，另取200 μL接种至100 mL脱脂乳培养基中，37 ℃厌氧培养32～48 h。观察平板上单菌落生长情况以及在脱脂乳培养基中的黏稠拉丝情况，并作记录。老道士整了整衣襟，在王祥边上坐下。王祥仔细端详起老道，老道士年纪大概在四五十岁的样子，打扮和古装剧里的道士一模一样，只是鼻梁上那个多了一副盲人常带的墨眼镜。想着老道一眼看出自己生意不顺，王祥眼中老道就平添了几分仙风道骨。 1.3.4.2 产糖菌株复筛将初筛中明显黏稠拉丝的菌株按2%（V/V）的接种量接种于MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养36 h制得发酵液。发酵液4 ℃、8 000 r/min离心20 min去除菌体，将上清液用旋转蒸发仪浓缩为原体积的1/3，并加入3 倍体积预冷无水乙醇4 ℃沉淀过夜，取沉淀用超纯水溶解，使用质量分数为6%的TCA溶液去除蛋白，8 000 r/min离心20 min后将上清液置于4 ℃超纯水中透析48 h，每8 h换一次水。1.3.4.3 EPS含量的测定采用苯酚-硫酸法测定EPS含量，参照文献配制不同质量浓度的标准葡萄糖溶液，然后测定波长490 nm处的吸光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。根据标准曲线回归方程y=0.005x-0.011 9，R2=0.996 6，计算菌株EPS的含量。1.3.5 菌株EPS体外抗氧化活性测定1.3.5.1 EPS的提取参考1.3.4.2节方法提取粗多糖，冷冻干燥得到粗多糖样品，调整糖液质量浓度为0.6 mg/mL备用。1.3.5.2 过氧化氢自由基清除能力测定参考文献，稍作修改。向0.6 mL浓度为40 mmol/L H2O2溶液中加入2.4 mL磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4），摇匀，加入1 mL样品，振荡混匀，室温反应10 min，测定体系230 nm波长处的吸光度，3 个平行实验。根据式（1）计算样品的过氧化氢自由基清除能力：http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/44ae1cfb46984b410db01be39ecc6bc9.jpg
式中：A0为未加样品的吸光度，即以水代替样品；A1为样品溶液与自由基反应后的吸光度；A2为样品溶液的吸光度，即以水代替自由基溶液，排除样品本身吸光度对结果的影响。1.3.5.3 超氧阴离子自由基清除能力测定教师是他最在意的身份。他曾和同事半开玩笑说：“在商场，顾客是上帝，在老师心里，就要把学生当上帝。”他善于发现学生的兴趣点，并根据每个学生的特点因材施教，在他的实验室里，每个学生做的都是最适合自己的研究。 参考文献，稍作修改。将3 mL 50 mmol/L pH 8.2 的Tris-HCl缓冲液与1 mL样品充分混匀，25 ℃保温30 min，加入0.3 mL 30 mmol/L邻苯三酚溶液，摇匀，25 ℃反应5 min。最后向反应体系中加入1 mL浓盐酸以终止反应。紫外分光光度计以Tris-HCl缓冲液调零，测定反应体系325 nm波长处吸光度。3 次平行实验。根据式（1）计算样品的超氧阴离子自由基清除率。1.3.5.4 羟自由基清除能力测定参考文献，稍作修改。取 1 mL样品，加入1 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、1 mL 9mol/L的水杨酸-乙醇溶液，振荡混匀，立即加入1 mL 9 mmol/L的H2O2溶液以开始发生反应，摇匀，37 ℃反应40 min，测定反应体系510 nm波长处吸光度，3 次平行实验。按式（1）计算样品的羟自由基清除率。1.3.5.5 DPPH自由基清除能力测定参考文献，稍作修改。吸取2 mL样品，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，摇匀，暗反应40 min，测定混合液517 nm波长处的吸光度，3 次平行实验。根据式（1）计算样品的DPPH自由基清除率。1.3.6 产糖菌株模拟胃肠液耐受性1.3.6.1 模拟胃液中的存活情况So L3=950×I3+475+475-200=950×I3+750,L4=Ls-A1-220-200-(950×I3+750)=Ls-A1-950×I3-1 170 人工模拟胃液：参考Liao Ning等的方法稍作修改，在每升MRS肉汤里添加3 g胃蛋白酶。将菌株以2%（V/V）的接种量接入MRS培养基，37 ℃厌氧培养28 h后，4 000 r/min离心10 min收集菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液洗涤菌体沉淀2 次后重悬于生理盐水中，混匀制得菌悬液。采用稀释涂布平板法计算此时的菌液浓度（CFU/mL）。用浓度为12 mol/L HCl溶液调节模拟胃液pH值至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0，灭菌冷却后，将1 mL菌悬液分别接入9 mL模拟胃液中，37 ℃厌氧培养3 h。记录不同条件下的活菌数（CFU/mL）。每组3 个平行实验。以0 h菌落总数为对照，根据式（2）计算菌株存活率：http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/51b6505b8d12e2722119d857c80cd34b.jpg
1.3.6.2 模拟肠液中的存活情况人工模拟肠液：在每升MRS肉汤里添加1 g胰蛋白酶和3 g牛胆盐，0.1 mol/L NaOH溶液调节pH 2.5。参照1.3.6.1节方法，制备菌悬液。将1 mL菌悬液接入9 mL模拟肠液中，37 ℃厌氧培养3 h。记录各菌株的活菌数（CFU/mL）。每组3 个平行实验。以0 h菌落总数为对照，根据式（2）计算菌株存活率。1.3.7 产糖菌株自凝聚测定将菌株发酵液4 000 r/min离心20 min，用无菌生理盐水洗涤2 次后用磷酸盐缓冲液调节菌悬液浓度为107 CFU/mL。取5 mL菌悬液于10 mL试管中旋涡振荡10 s，在室温条件下静置5 h，每隔1 h取出菌悬液置于600 nm波长处测其吸光度。每组3 个平行实验。菌株自凝聚率按照式（3）计算：项目区位于罕达罕河、绰尔河、二龙涛河阶地河谷平原区，主要开采层为第四系孔隙潜水及基岩风化带裂隙水，含水层厚4.6～61.07 m，单位涌水量一般为 30～50 m3/（h·m）， 河流上段、支流及干流河谷阶地单位涌水量一般为 10～30 m3/（h·m）， 单位涌水量最大 1 500～2 200 m3/（d·m），渗透系数22.9 m/d。 http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/c9bd9bf8d4878aae1abd371c7521ddfb.jpg
式中：At为时间t为1、2、3、4 h和5 h的吸光度；A0为0 h吸光度。1991年后，随着《中华人民共和国种子管理条例》、《中华人民共和国农业技术推广法》等农业法律法规的颁布实施，农业部门种子管理、科技措施的推广应用有了法律保障。特别是进入21世纪，党中央、国务院十分重视农业的发展，连续14年把“三农”工作写入中央1号文件。同时，陆续曝光一些坑农害农事件，重拳出击，严厉打击坑农害农者，极大地鼓舞了农业科技工作者的热情和广大农民的种田积极性，有力地促进了全县“三农”工作的有序健康发展。 1.3.8 产糖菌株表面疏水性测定英语课前的准备工作就是收集和处理的过程。学生课前准备就可以初步了解学习内容,提出教材有不懂或困惑的地方。正如爱因斯坦说过“发现问题比解决问题更重要。”，收集问题就是学生激活已有知识和经验,通过字典等工具，分析新问题，为课堂学习做好准备过程。 将菌株发酵液4 000 r/min离心20 min后，用无菌生理盐水洗涤2 次重悬于0.1 mol/L KNO3（pH 6.2）溶液中，调节菌悬液浓度为107 CFU/mL，600 nm波长处测定样品吸光度A0。分别吸取1 mL二甲苯、乙酸乙酯、氯仿溶剂加到3 mL菌液中混匀，室温静置10 min后涡旋振荡两相体系2 min，室温下放置20 min后取水相，测定其在600 nm波长处的吸光度（A1）。疏水性用细菌对溶剂的黏附百分比表示，计算如式（4）所示：http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/a55d4e451fa83f8d801ea4fc4f0e2d1a.jpg
1.4 数据分析与处理采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析；所有实验重复3 次，结果以 ±s表示，显著性分析采用Duncan检验。采用Gel Compar II凝胶分析软件进行指纹图谱聚类分析，并使用Origin 9.0.6进行相关图表绘制。2 结果与分析2.1 双歧杆菌的鉴定结果http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/ed16513f9128a1b86935899bc42cdd67.jpg&p=750x796&q=30 图 1 BOXA1R扩增菌株的rep-PCR基因指纹图谱
Fig. 1 Rep-PCR gene fingerprints of strains amplified with BOXA1R
将分离得到的73 株疑似双歧杆菌经rep-PCR（图1）去重后，挑选20 株代表菌株测序，序列在NCBI数据库进行BLAST在线分析，结果有17 株属Bifidobacterium，3 株属Propionibacterium。将17 株双歧杆菌的部分16S rRNA基因序列测序结果在NCBI数据库进行BLAST在线分析，并选取同源性最高的序列构建系统发育树，见图2。可以看出17 株双歧杆菌分属于5 个种，2 个亚种，菌株BF81-22、BF67-14和BF8-3属于假长双歧杆菌（B. pseudolongum），菌株BF79-11和MF85-2属于动物双歧杆菌乳亚种（B. animal subsp. lactis），菌株BF66-16属于长双歧杆菌婴儿亚种（B. longum subsp. infantis），菌株MFX-1属于长双歧杆菌（B. longum），菌株MF29-4、BF113-1和BF43-1属于短双歧杆菌（B. breve），菌株MF98-1、BF88-5、MF80-22和MF96-12属于假小链双歧杆菌（B. pseudocatenulatum），菌株MF49-14、BF52-1和BF87-12属于两歧双歧杆菌（B. bifidum）。由于各医学高校办学条件、师资力量、学生层次等现状不尽相同，借鉴其他医学院校模式的同时，应选择契合自身的整合方式，如先将相互平行的学科进行整合，局限在基础医学学科领域或临床医学学科领域，使学生在跨学科的知识体系内学习压力减小。再基于“以器官系统为中心”的模块，对基础和临床课程进行垂直综合整合，以问题或案例为导向，通过课堂讨论、PBL、CBL等形式，引导学生将基础知识与临床实践有效衔接，强化知识的连贯性。但模块与模块间的过渡衔接，仍需摸索总结，避免知识的不连贯或遗漏。关于整合课程中明确学习效率的证据至今尚少，也缺少明确的最佳实施路径，如何有效的实施课程整合仍有待于医学教育者的潜精研思。 BLAST比对的亲缘标准菌株和样品来源如表2所示，与之前相同序列比较，共得到52 株肠道来源的双歧杆菌，14 株B. pseudocatenulatum，8 株B. pseudolongum，9 株B. bifidum，7 株B. breve，5 株B. longum subsp.infantis，6 株B. animal subsp. lactis和3 株B. longum。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/022bb44c4b8950a0bfe830eae566dc94.jpg&p=714x962&q=30 图 2 菌株16S rRNA基因序列的系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree of strains based on 16S rRNA gene sequences
表 2 NCBI BLAST比对结果
Table 2 Results of alignment based on NCBI BLASThttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/0318c1e3995d7f1e717489cd98a0e5b3.jpg&q=30 代表菌株 样品编号相同带型数 BLAST最匹配种 相似度/% 样品来源BF67-14 f67 8 B. pseudolongum（MH719368.1） 100 婴儿粪便BF79-11 f79 2 B. animalis subsp. lactis（CP031703.1） 100 婴儿粪便MF85-2 F85 4 B. animalis subsp. lactis（MH828367.1） 99 母亲粪便BF66-16 f66 5 B. longum subsp. infantis（LR134354.1） 100 婴儿粪便MFX-1 F48 3 B. longum（LT629712.1） 99 母亲粪便BF113-1 f113 2 B. breve（KX214098.1） 99 婴儿粪便MF29-4 F29 5 B. breve（MH719067.1） 99 母亲粪便MF98-1 F98 4 B. pseudocatenulatum（MK045819.1） 100 母亲粪便BF88-5 f88 4 B. pseudocatenulatum（KX674008.1） 99 婴儿粪便MF80-22 F80 6 B. pseudocatenulatum（MH719034.1） 99 母亲粪便BF52-1 f52 2 B. bifidum（KY705018.1） 100 婴儿粪便BF87-12 f87 7 B. bifidum（KJ412981.1） 100 婴儿粪便
2.2 产EPS的双歧杆菌筛选52 株双歧杆菌经过初筛，发现有11 株双歧杆菌（B. longum MFX-1、MFX-2和MFX-3，B. longum subsp.infantis BF66-16、BF85-15、BF85-36和BF107-4，B. bifidum BF107-7、BF52-1，B. breve MF29-2、MF29-26）在MRS平板和脱脂乳培养基中有产黏拉丝的情况，图3为产糖与不产糖的菌株表型对比。通过苯酚-硫酸法对11 株双歧杆菌进行了复筛，实验结果显示有7 株双歧杆菌的EPS含量较高（图4），可以看出，所测7 株菌EPS产量均达到400 mg/L以上，尤其是来源于婴儿粪便的B. longum subsp. infantis BF66-16 EPS产量高达513.06 mg/L，具备工业生产的可能。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/6f216715cc471e25acb3c9170ed3ac8d.jpg&p=476x434&q=30 图 3 产糖与不产糖的菌株表型对比图
Fig. 3 Phenotypic comparison between EPS-producing and non-EPS-producing strains
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/796d6d976a7f25a9e260280dd7dd3909.jpg&p=618x376&q=30 图 4 菌株EPS产量
Fig. 4 EPS yields of selected strains
2.3 双歧杆菌粗多糖的体外抗氧化分析http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/31a6af59661762af5bab45373d19cdbb.jpg&p=592x316&q=30 图 5 菌株抗氧化活性
Fig. 5 Antioxidant activities of selected strains
过氧化氢自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基都属于人体内细胞衰老的诱导因子，它们能够通过细胞膜，与大量生物活性分子发生反应，缓慢地氧化机体，对机体造成氧化损伤。如图5所示，几株双歧杆菌EPS对过氧化氢自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基和DPPH自由基均有一定的清除能力，EPS质量浓度为0.6 mg/mL，7 株双歧杆菌EPS对4 种自由基的清除率都超过了20%，表明7 株双歧杆菌所产的EPS均具有一定的抗氧化活性，有作为这些自由基清除产品的可能。2.4 产EPS双歧杆菌的耐受性人体胃液的pH值通常在3.0左右，受饮食及其他因素影响，胃液pH值也会在1.5～4.0之间浮动，胃液的强酸性及胃蛋白酶会严重阻碍双歧杆菌的转运，因此双歧杆菌需要具备耐受胃液低pH值及胃蛋白酶的能力才能进入小肠发挥作用。7 株菌胃肠耐受实验结果见图6，菌株在pH值为2.0时基本无法存活。在pH值大于2.5时，7 株菌均表现出了一定的耐酸性，尤其菌株BF66-16在pH值为4.0时，存活率超过了80%，耐受胃液能力较强，具备益生菌潜质。③绩效指标与绩效评价指标。如上文所述，绩效指标是对项目绩效目标和工作内容的细化和量化。绩效评价指标则是运用一定的绩效评价标准（计划标准、行业标准、历史标准等）衡量绩效目标（含绩效指标）实现程度的考核工具，包含个性评价指标和共性评价指标两种类型。绩效指标和绩效评价指标既是考核与被考核的关系，也存在一定程度的可转化关系。如在某个培训类预算项目中，项目单位申报产出指标——完成培训人员，指标值为“**名”。项目执行完成后，可设置绩效评价指标——培训人员完成率，用实际完成培训人员情况与申报的计划完成培训人员之比来衡量绩效指标的实现程度。 http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/441db474daf0a81acda93dcb4929b9e5.jpg&p=624x336&q=30 图 6 菌株耐受胃液能力
Fig. 6 Abilities of selected strains to tolerate gastric juice
人体小肠是可食用益生菌发挥功效的场所，小肠中过高的胆盐含量限制了益生菌的使用，能够在人体肠液中存活一定数量的的菌株才可以发挥益生作用。模拟肠液结果见图7，7 株菌在模拟肠液中培养3 h后均能达到40%以上的存活率，其中BF66-16相比较于其他菌株存活率明显较高，达到了61.05%，表明菌株对酸性条件和胆汁盐环境具有很强的抵抗力，这可能与其高产EPS有关。在Yang Xin等的研究中，转录组和生理学分析显示EPS的产生使B. breve BB8的酸适应性得到改善。B. animalis subsp. lactis在0.3%牛胆盐存在的条件下诱导eps基因表达，且随着胆汁盐添加百分比的增加，EPS的合成量按比例增加。因此双歧杆菌合成这些聚合物可以作为保护机制，以应对其肠道中遇到的恶劣条件。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/5dabc35544bf108833712b31fc8f151a.jpg&p=624x316&q=30 图 7 菌株耐受肠液能力
Fig. 7 Abilities of selected strains to tolerate intestinal juice
2.5 产EPS双歧杆菌的自凝聚能力益生菌黏附于肠上皮细胞的能力在胃肠道定植中发挥着重要作用，可以防止菌株因蠕动而减少，从而在生态系统中提供竞争优势。已有研究证明，体外测量细菌的自凝聚和表面疏水性可用于初步筛选适合商业应用的潜在黏附细菌。自凝聚是同一种菌株间相互凝集形成多细胞簇的现象，益生菌通过自凝聚作用相互凝集到一定的数量时黏附才牢固，进而达到菌株发挥益生功效所需要的数量。7 株产EPS的双歧杆菌的自凝聚能力结果见表3，菌株悬液的自凝聚率随着静止时间的延长而逐渐增大，且不同的菌株间自凝聚率具有明显的差异，其中菌株BF66-16与其他菌株相比表现出较好的自凝聚能力，5 h后菌株BF66-16的自凝聚率达到95.59%，有较强的自凝聚性。表 3 产EPS菌株的自凝聚结果
Table 3 Auto-aggregation ability of EPS-producing strainshttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/266dee8309ec2268deb52e370a2faf2f.jpg&q=30 菌株 自凝聚率/%1 h 2 h 3 h 4 h 5 h BF107-7 66.85±0.2776.75±0.29 82.48±0.22 84.76±0.1986.02±0.17 BF52-1 4.90±0.04 12.78±0.9027.47±0.7227.57±0.7527.76±0.75 MF85-36 4.01±0.09 4.28±0.05 11.29±0.97 21.68±0.8624.86±0.82 BF66-16 78.72±0.39 82.20±0.74 92.23±0.10 93.50±0.0895.59±0.05 BF107-4 8.21±0.08 8.68±0.97 13.36±0.9016.89±0.8715.46±0.88 MFX-1 9.61±0.46 13.79±0.5020.69±0.3225.62±0.3024.14±0.30 MFX-2 7.93±0.527.39±0.1413.15±0.4818.74±0.4542.34±0.34
2.6 产EPS双歧杆菌的疏水性表 4 产EPS菌株的疏水性结果
Table 4 Hydrophobility of EPS-producing strainshttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/67dfb71e8afadd72ca933e4e83a3ec5d.jpg&q=30 菌株 疏水性/%氯仿 二甲苯 乙酸乙酯BF107-7 72.53±0.32 9.37±0.68 4.27±0.21 BF52-1 85.64±0.25 10.42±0.27 3.71±0.23 MF85-36 40.27±0.59 43.95±0.21 5.27±0.56 BF66-16 94.26±0.36 58.19±0.53 8.05±0.42 BF107-4 34.32±0.21 45.63±0.23 6.10±0.15 MFX-1 70.11±0.04 54.18±0.25 9.94±0.36 MFX-2 44.21±0.52 48.41±0.03 7.64±0.29
疏水性较高的菌株，会对小肠组织产生较高的黏附能力。由表4可以看出，所有菌株均表现出一定的疏水性，不同菌株的疏水性差异较大，二甲苯是一种非极性溶剂，除菌株BF107-7和BF52-1外，其余5 株菌均表现出对二甲苯较高的疏水性（＞40%），说明这些菌株都具有疏水的细胞表面。氯仿是酸性溶剂，属于电子受体，而乙酸乙酯是单碱性溶剂，属于电子供体。7 株双歧杆菌对氯仿的疏水性都明显的高于对乙酸乙酯的疏水性，尤其是菌株BF52-1和BF66-16对氯仿的疏水性均大于85%，说明这两株双歧杆菌都是电子供体。因此本研究通过自凝聚和疏水性筛选出的菌株BF66-16初步判断其能够黏附在胃肠道中，且BF66-16在模拟胃肠液中的存活能力较强，说明菌株可以在胃肠液环境中以较高的数量存活下来，发挥其抗氧化活性。3 结 论本研究从新疆维吾尔族肠道中分离出52 株双歧杆菌，分属于B. pseudocatenulatum、B. bifidum、B. breve、B. pseudolongum、B. longum五个种以及B. longum subsp.infantis、B. animal subsp. lactis两个亚种。对菌株产EPS的能力进行初筛和复筛后，共得到7 株EPS产量较高的双歧杆菌，质量浓度均在400 mg/L以上，且所产的EPS具有一定的抗氧化活性，对人体健康有益。模拟胃肠液耐受性和体外黏附性实验结果表明，菌株BF66-16耐受胃肠液能力相比于其他几株双歧杆菌较强，在pH 2.0的胃液环境下，存活率仍可达3.39%，在pH 4.0时存活率为81.13%，模拟肠液中存活率达到了61.05%；同时BF66-16对氯仿和二甲苯的黏附百分比超过60%，5 h后的自凝聚率为95.59%，证明菌株能够以较高的活菌量黏附于胃肠道中，以发挥其抗氧化活性。由此可见，来源于婴儿粪便的BF66-16可以作为潜在抗氧化菌株，为后续开发适合少数民族消费的益生型产品提供新的研究思路和菌株资源。参考文献： MILANI C, DURANTI S, BOTTACINI F, et al. 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Screening for and Antioxidant Activities of High Exopolysaccharide-Producing Bifidobacterium from the Intestinal Tract of Uygur Infants and Their Mothers in XinjiangCAI Jingjing, XU Xiaoyu, ZHANG Yan, ZHANG Yachuan, WEI Xiaojing, KAN Zeyu, NI Yongqing*
(Food College, Shihezi University, Shihezi 832000, China)Abstract: This study aimed to isolate and identify Bifidobacterium strains from the feces of Uygur infants and their mothers’in Xinjiang. Using Wilkins-Chalgren anaerobic agar and BSM medium plates, Bifidobacterium strains were isolated and they were identified by repetitive extragenic palindromic-polymerase chain reaction (rep-PCR) fingerprinting and 16S rRNA gene analysis. High-yield expolysaccharides (EPS) producing strains were selected from these isolates and the antioxidant activities of the EPS produced by the selected strains as well as their tolerance and auto-adhesion ability were evaluated.The results showed that a total of 52 stains of Bifidobacterium were isolated from 20 feces samples and they belonged to B. pseudocatenulatum (14 strains), B. pseudolongum (8 strains), B. bifidum (9 strains), B. breve (7 strains), B. longum subsp.infantis (5 strains), B. animal subsp. lactis (6 strains) and B. longum (3 strains). respectively. Through phenotype screening and secondary screening using the phenol sulfuric acid method, we found 7 strains of Bifidobacterium with higher EPS yield.The yield of EPS produced by each of the 7 strains was more than 400 mg/L after 36 h fermentation at 37 ℃. The EPS had the ability to scavenge H2O2, superoxide anion, hydroxyl and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical. Besides, strain BF66-16 had stronger tolerance to gastrointestinal juice and auto-adhesion ability than the other six strains. Thus, BF66-16 can be used as a potential antioxidant strain in the pharmaceutical and food industries.Keywords: Bifidobacterium; repetitive extragenic palindromic-polymerase chain reaction; exopolysaccharides; antioxidant activities
收稿日期：2019-03-05基金项目：石河子大学高层次人才启动项目（CZX201432R）第一作者简介：蔡静静（1993—）（ORCID: 0000-0002-2106-8165），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail: 694551934@qq.com*通信作者简介：倪永清（1969—）（ORCID: 0000-0002-7943-3882），男，教授，博士，研究方向为食品微生物学。E-mail: niyqlzu@sina.comDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190305-044中图分类号：Q938文献标志码：A文章编号：1002-6630（2020）08-0144-08引文格式：蔡静静, 徐晓裕, 张艳, 等. 新疆维吾尔族肠道中高产胞外多糖双歧杆菌的筛选及其抗氧化活性. 食品科学, 2020,41(8): 144-151. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190305-044. http://www.spkx.net.cnCAI Jingjing, XU Xiaoyu, ZHANG Yan, et al. Screening for and antioxidant activities of high exopolysaccharide-producing Bifidobacterium from the intestinal tract of Uygur infants and their mothers in Xinjiang. Food Science, 2020, 41(8):144-151. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190305-044. http://www.spkx.net.cn
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