清酱香型白酒陶坛发酵细菌群落结构多样性分析
清酱香型白酒陶坛发酵细菌群落结构多样性分析清酱香型白酒陶坛发酵细菌群落结构多样性分析胡小霞1，黄永光1,2,*，蒋 想2，朱家合2，金 磊3（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州岩博酒业有限公司，贵州 盘州 553523；3.无锡市振太酒业有限公司，江苏 无锡 214092）摘 要：利用高通量测序并结合数理统计对清酱香型白酒陶坛发酵过程中酒醅的细菌群落结构进行分析。结果表明，其发酵过程的优势细菌门为Firmicutes和Proteobacteria，主要细菌属为Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea，优势细菌属为Weissella、Staphylococcus、Lactobacillus和Gluconobacter。清酱香型白酒酿造过程的主要细菌群落结构兼具了清香和酱香白酒酿造主要细菌的群落结构特点。其发酵过程平均73.53%的主要细菌属含量呈高度显著上升，20.59%呈高度显著下降。发酵结束阶段，主要细菌属的群落组成结构相对稳定，相对丰度均在25.97%以下。且平均81.12%的主要细菌属之间呈显著正相关，18.88%呈拮抗相关。关键词：清酱香型白酒；高通量测序；细菌群落；陶坛发酵中国白酒是世界上最古老的蒸馏酒之一，在其发展进程中，基于酿酒原料、酿造工艺、自然环境、糖化发酵剂等因素的差异，逐渐形成了各具特色、风格典型的酱香、浓香、清香等12 种香型白酒。随着消费需求发展，白酒酿造工艺和科技也随之进步，白酒香型不断创新，清酱香型白酒正是香型创新的代表产物，目前在全国已获得广大消费者认可和青睐。清酱香型人民小酒采用本地产糯高粱为原料，高温水泡粮煮粮，小曲糖化培菌、大曲堆积发酵生香，陶坛发酵或窖池长期发酵，分级取酒，分类贮存，陈酿勾兑而成。其酿造工艺有机融合了清香型、酱香型白酒酿造之精华，酒体风格“清亮透明，清酱协调，香气幽雅，醇厚丰满，细腻柔顺，回味悠长，空杯留香”，既满足了清香型白酒的幽雅、净爽，又富有酱香白酒的醇厚、细腻、回味悠长风格。王祥被老道伤得不轻，但是也激发了他不服输的秉性。越是在古董上跌倒，越是要这这行里找回场子。反正生意也懒得做了，王祥一咬牙就答应了钱总。 二是探索生态补偿制度。研究建立上下游行政区之间的生态补偿机制，建立由政府主导、受益区域参与、上下游责任与权利明确的生态补偿制度。上游地区完成重点水污染物排放总量削减和控制计划、行政区域边界断面水质达到水质目标的，由下游地区对上游地区予以补偿；反之，则上游地区应当对下游地区予以赔偿。 众所周知，白酒酿造的产质量与酿造过程微生物菌群结构及其代谢密不可分，清酱香型白酒风格之所以不同于典型的清香型和酱香型白酒，除在酿造工艺上的创新和不同外，更根本原因在于其酿酒微生物结构的差异和酿造环境的独特。目前研究普遍认为，在白酒酿造微生物体系中，细菌有产酶和产香的能力，通过代谢产生丰富的风味物质决定白酒的香型和品质。白酒酿造过程中细菌群落结构也一直是白酒界的研究热点。由图3可知，不同适应活化条件对酵母菌产气能力有较大影响，随活化基质中碳源和氮源含量的增加，酵母菌的产气量基本呈上升趋势。尽管有氧呼吸时CO2的产量远高于厌氧条件下，但厌氧条件活化所得酵母菌在随后的发酵试验中展现了远高于有氧条件活化菌株的产气能力，这可能是由于厌氧条件下，某些参与TCA循环的酶仍然保持活性，这些额外的代谢途径能够合成细胞功能所需的重要前体物质，并决定最终产气体积。 清酱香白酒作为创新香型白酒，还处于发展起步阶段，酿造过程的细菌群落结构体系尚不明确，这在一定程度上制约了它的发展。因此，为揭示酿酒微生态、功能微生物多样性结构对清酱香型人民小酒酿造及其酒体风格影响的机理以及清酱香型白酒酿造过程中重要发酵微生物的调节机制，本研究通过高通量测序策略并结合数理统计系统，分析清酱香型白酒陶坛发酵过程中的细菌群落结构，并进一步研究其主要细菌群落在发酵过程中的变化规律及调控机制，以期推动清酱香型白酒的创新发展。1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 样品样品采集自贵州省YB酒业有限公司2 个陶坛发酵生产车间（分别记为YB1和YB2，其入坛发酵时间和发酵工艺一致）2018年6—7月生产发酵酒醅，发酵期为21 d。每个车间同一天有50 坛酒醅入坛发酵，从中随机抽取10 坛进行跟踪取样，由于陶坛质地、糟醅入坛温度、水分、酸度、糟醅疏松度等相关因素影响，酒醅上层、中层、下层及内层、外层微生物分布存在一定差异，因此，每次采集酒醅上、中、下3 个发酵酒醅层次的发酵酒醅样品，每个发酵酒醅层采集中间和边缘位置（图1），然后将6 个点样品均匀混合为一个样品以消除取样误差，混合后取200 g存于无菌自封袋中。再将从10 个发酵坛中采集的样品各取20 g混合为综合样。每次采集酒醅样品样均采用专业的取样器定时定位取样，取样器消毒灭菌后，瞬间打开封坛盖膜，取样器刺穿到糟醅层面，迅速、严格进行取样操作，因取样器直径很小，只会留下1 个小孔，且取样时间很短，取样完毕后则立即将小孔密封，封坛。根据前期基础研究和生产实际，由于发酵10 d后，发酵进入稳定阶段，因此取样时间定为发酵第1、5、10、20天。综合样分别记为YB1的1F 1 d、1F 5 d、1F 10 d、1F 20 d和YB2的2F 1 d、2F 5 d、2F 10 d、2F 20 d。样品采集完毕则即时进行DNA提取。有观点认为，推特已发展为推动草根政治对话的重要力量，甚至改变了美国自上而下的政治领导模式与政治思想（Newkirk 2016）。诚然，推特用户仅代表美国人口的非多数派，但这一集群几乎囊括了美国所有政党、选举候选人、公职人员、利益集团、媒体、记者和大量关心政治的人群。由此可见推特在美国政治中扮演的角色之重要，故以推特为例分析新媒体对美政治生态的影响，颇具代表性。本文分析主要以推特为例，但推特呈现的特点及其影响也可见于其他新媒体平台，笔者认为本文的分析具有举一反三的意义。 http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/1661805330cf1942fdc4a223a36910d1.jpg&p=604x452&q=30 图 1 陶坛发酵酒醅取样图Fig. 1 Schematic of sampling positions of fermented grains from the pottery jar during fermentation
1.1.2 试剂DNA Marker 宝生物工程（大连）有限公司；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）、引物合成上海生物工程股份有限公司；E.Z.N.A. Soil DNA Kit美国Omega BioTek公司；异丙醇（分析纯）、TAE（Tris acetate-EDTA）缓冲液 北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖 南京生兴生物技术有限公司；Goldview染料 上海赛百盛有限公司；rTaq DNA聚合酶试剂盒北京全式金生物技术有限公司。1.2 仪器与设备Zealway G154DW高压蒸汽灭菌锅 致徽（厦门）仪器有限公司；台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司；GeneAmp® 9700型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国ABI公司；DYY-8C型电泳仪北京六一仪器厂；JS-680C凝胶成像仪 上海培清科技有限公司；MiSeq测序仪 美国Illumina公司；QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统 美国Promega公司。1.3 方法1.3.1 样品预处理及DNA提取分别取1.1.1节最后混匀的8 个综合样各16 g于100 mL离心管中，用30 mL灭菌后的0.1 mol/L PBS悬浮，加入3～5 颗玻璃珠，旋涡振荡7 min，400 r/min离心5 min，取上清液。沉淀用PBS洗涤，旋涡振荡4 min，400 r/min离心5 min，收集上清液。将沉淀用PBS洗涤，旋涡振荡2 min，400 r/min离心5 min，收集上清液。全部上清液于12 000 r/min离心5 min，弃上清液，收集细胞沉淀。预处理结束后，根据E.Z.N.A.® soil DNA Kit的操作说明提取各样品中的微生物总DNA。1.3.2 16S rRNA基因扩增及Illumina MiSeq测序应用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）扩增V3和V4高变区。PCR体系及反应条件见黄蕴利等的方法；每个样本做3 个重复。将同一样品的PCR产物混合后用1.1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱；1.1%琼脂糖电泳检测。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统进行检测并定量，再按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。连接“Y”字形接头，使用磁珠筛选去除接头自连片段，利用PCR扩增进行文库模板富集，氢氧化钠变性，产生单链DNA片段，制备MiSeq PE文库。再在Illumina MiSeq（PE300）平台上机测序。1.4 数据及图像处理采用Microsoft Office Excel 2016进行数据计算，IBM SPSS Statistics进行显著性分析，R语言绘制气泡图和群落差异分析图，Cytoscape绘制共线性网络分析图和相关性网络图。曾鸣：关于放权和集权，如果大家从这个角度看问题，又陷在了传统工业化时代的管理逻辑。其实我反复强调，互联网时代需要全新的组织逻辑。它的核心是赋能，不再是简单的管理。 2 结果与分析2.1 陶坛发酵过程细菌群落结构分析对两组样品细菌的高通量测序结果进行统计分析，图2为清酱香型白酒陶坛发酵过程的细菌群落结构气泡图。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/8c0da4d22daa9b4d42733d7d095afc27.jpg&p=752x616&q=30 图 2 发酵过程细菌群落结构多样性在属水平上的分布图（相对丰度＞1%）
Fig. 2 Distribution of microbial community at the genus level(relative abundance ＞ 1%)
从YB1中检出11 个门，从YB2中检出9 个门，YB1和YB2酒醅样品中共检出Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Cyanobacteria、Deinococcus-Thermus、p_unclassified_k__norank、Fusobacteria、Saccharibacteria、Planctomycetes、Acidobacteria 11 个门，其中优势细菌门（平均相对丰度＞10%）为Firmicutes（67.09%）和Proteobacteria（31.42%），这与清香型和酱香型白酒发酵过程的优势细菌门一致。Firmicutes在清酱香型白酒发酵酒醅中占绝对主导地位，在清香型和酱香型白酒发酵酒醅中同样如此，但丰度占比有所差异。从YB1中检出166 个属，从YB2中检出146 个属，YB1和YB2酒醅样品中共检出178 个属。如图2所示，有21 个属相对丰度至少在一个样品中超过1%，分别是：Weissella、Staphylococcus、Lactobacillus、Oceanobacillus、Bacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Leuconostoc、g_unclassified_o_Bacillales、Gluconobacter、Pseudomonas、Acetobacter、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Kozakia、Pantoea、Psychrobacter和g_unclassified_c_Alphaproteobacteria、Chryseobacterium。上述21 个细菌属中，Weissella、Leuconostoc、Lactobacillus和Pediococcus属于乳酸菌。乳酸菌在发酵过程可通过产乳酸、乙酸等有机酸，直接影响酒体风味。同时，乳酸和乙酸是白酒中重要风味成分乳酸乙酯和乙酸乙酯的前体。乳酸菌还可通过代谢有机酸、竞争营养成分、产生抗菌素等抑制其他微生物的生长，从而调节发酵过程的微生物群落结构，间接影响酒体的品质。此外，乳酸菌还能为酵母发酵过程的酯化作用提供前体物质，具有促进酿酒发酵和美拉德反应及维持酿酒微生态环境等作用。Gluconobacter、Acetobacter、Komagataeibacter和Kozakia属于醋酸菌。醋酸菌是一类严格好氧的革兰氏阴性细菌，能氧化葡萄糖或乙醇生成乙酸，是乙酸代谢的主要来源。乙酸是白酒中主要风味成分之一。少量的乙酸对改善白酒风味、促进酒体清香有重要作用。Weissella和Leuconostoc可启动发酵，Leuconostoc还可利用葡萄糖进行异型乳酸发酵产生D-型乳酸和乙酸。Gluconobacter能产生乙酸。Acetobacter能产细菌纤维素，具有氧化乙醇生成乙酸并进一步氧化乙酸的能力。Fan Guangsen等在清香型大曲中检测到一种Acetobacter orientalis，该细菌将葡萄糖发酵成乙醇，将乙醇转化成乙酸，通过生产乙酸异戊酯和2-苯基乙酸乙酯等酯类对酒体风味有积极作用。Komagataeibacter的部分菌株可产生细胞纤维素，可以由甘油产生二羟基丙酮，可以氧化葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、乙醇产生有机酸等，Komagataeibacter在葡萄酒和有机苹果酒浸泡醋生产中，被确定为葡萄酒醋和苹果醋发酵中的主要微生物，但尚未在白酒发酵中见到报道。Kozakia能利用蔗糖或D-果糖生产类似果聚糖的黏性物质，也能氧化乙酸盐和乳酸盐，利用乙醇生产食醋。Oceanobacillus是大曲中的主要微生物，具有产乳酸的功能。Bacillus是酱香型白酒生产中的主要功能菌，能在55 ℃及以上高温下生长，促进以葡萄糖、甘氨酸和氯化钠为原料的美拉德反应迅速发生，生成乙酸、乙酸乙酯、乙醛、乙缩醛、丁二醇等风味物质，是重要的产酸和产香菌，促进浓郁的酱香风味形成；并且Bacillus还能代谢酶水解淀粉、蛋白质等，产生丁酸和己酸等，还有助于双乙酰等芳香物质和吡嗪、醛类、酮类、醇类等挥发性化合物形成。Enterobacter存在于大曲和小曲中。Wang Peng等发现在大曲发酵8 d后，Enterobacter便成为优势微生物。黄莹娜等认为Enterobacter是白云边窖泥中特有的优势菌属，对其浓酱兼香风格的形成有重要贡献。且Enterobacter中的某些菌可产纤维素酶和乳酸。Acinetobacter是具有呼吸和发酵代谢作用的细菌，以葡萄糖和其他碳水化合物代谢产酸，是酱香型和清香型白酒酒醅中的主要微生物。酸类物质具有平衡酒味、协调香气的作用。同时酸类物质也是形成酯类化合物的前体物质，而酯类化合物是构成清酱香型人民小酒挥发性香气的重要物质。综上表明，上述微生物具有促进清酱香白酒风味物质富集的作用。Pseudomonas是清香型白酒酒醅中的主要微生物。Liu Xiu等在大曲发酵的风干阶段检测到Pseudomonas。Staphylococcus为酱香型酒曲和部分堆积前、中期酒醅中的优势菌群，文献报道部分Staphylococcus在香肠、火腿等发酵食品生产过程可产生独特的风味物质。Pantoea、Kroppenstedtia和Lentibacillus都是大曲中的主要微生物。清酱香型白酒采用大小曲共同发酵，发酵工艺和酒体风格融合了清、酱香型白酒二者之优势。因此，清香型或酱香型白酒发酵过程中的主要微生物，如果在清酱香型白酒中的相对丰度较高（相对丰度＞1%），对清酱香型白酒发酵也有一定影响作用。为克服DE算法易陷入局部最优的不足，将变异思想引入差分进化算法中。首先设定一个阈值，当种群适应度方差δ2小于该阈值时，选取最优个体及部分其他个体采用式(21)所示的高斯扰动法进行二次变异以改善种群多样性。 高通量测序结果表明，Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter和Komagataeibacter在酒醅中的平均相对丰度大于1%，Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea在发酵结束阶段平均相对丰度大于1%。以上微生物在清酱香型白酒陶坛发酵过程中的相对丰度及其功能作用表明，Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobcter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea共17 种属是清酱香型白酒发酵过程的主要细菌属。其中优势细菌属（平均相对丰度＞10%）为Weissella（20.61%）、Staphylococcus（14.19%）、Lactobacillus（12.08%）和Gluconobacter（14.17%）。而前人研究表明，清香型白酒中的主要细菌属是Lactobacillus、Streptpcoccus、Pediococcus、Aerococcus、Bacillus、Acetobacter、Pseudomonas、Kroppenstedtia、Weissella、Acinetobacter和Leuconostoc。如图3所示，Weissella、Lactobacillu、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Acinetobacter和Leuconostoc是清香型和清酱香型白酒酒醅共有的主要细菌属，Streptpcoccus和Aerococcus在清香型白酒酿造中是主要细菌属，但Streptpcoccus在清酱香型白酒发酵过程中未检出，Aerococcus在清酱香型白酒发酵过程中含量很低（在各样品中相对丰度均低于0.01%）。酱香型白酒酒醅中的主要细菌属为Acidithiobacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Acetobacter、Pediococcus、Bacillus、Pantoea、Weissella、Thermoactinomyces、Enterobacter、Pseudomonas、Stenotrophomonas、Phyllobacterium、Shewanella、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Clostridium、Sensu stricto 1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter、Acinetobacter、Lactococcus、Staphylococcus、Enhydrobacter、Burkholderia、Desmospor。其中Weissella、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Enterobacter、Acinetobacter、Pantoe是酱香型和清酱香型白酒酒醅共有的主要细菌属，Acidithiobacillus、Thermoactinomyces、Stenotrophomonas、Phyllobacterium、Shewanella、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Clostridium、Sensu stricto1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter、Lactococcus、Enhydrobacter、Burkholderia、Desmospora、Serpens是酱香型白酒酒醅中的主要细菌属，但Acidithiobacillus、Phyllobacterium、Shewanella、Clostridium、Sensu stricto1、Actinobacillus、Peptoclostridium、Citrobacter、Burkholderia、Desmospora和Serpens在清酱香型白酒发酵过程中未检出，Thermoactinomyces、Stenotrophomonas、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Lactococcus和Enhydrobacter在清酱香型白酒发酵过程中含量很低（在各样品中平均相对丰度介于0%～0.35%）。与清香型和酱香型白酒相比，Gluconobacter、Oceanobacillus、Lentibacillus、Komagataeibacter、Kozakia是清酱香型白酒酒醅中特有的主要细菌属。正是由于发酵菌群结构的差异，其发酵动力和风味动力上也会存在差异，从而导致了酱香、清香、清酱香白酒发酵产率及其酒体风格特征上的差异。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/dabf5df76432b4333d7d1241d833fe22.jpg&p=688x390&q=30 图 3 不同香型白酒主要细菌属水平分布Venn图
Fig. 3 Venn map of main bacterial genera in Chinese liquors of different flavors
上述结果表明，在门水平，清酱香、清香、酱香型白酒酿造微生物差异不大，都是Firmicutes和Proteobacteria为优势细菌门，且Firmicutes占主导地位。在属水平，清酱香型白酒酿造过程主要细菌属与清香型、酱香型白酒堆积发酵过程的主要细菌属有很大重合，但又有各自特有的主要细菌属。说明清酱香型白酒酿造过程的细菌群落结构与清香型白酒、酱香型白酒酿造均有一定的相似性，但又不同于清香型白酒和酱香型白酒酿造细菌群落结构，具有其自身独特性。清酱香型白酒酿造过程的主要细菌群落结构兼具了清香和酱香白酒酿造主要细菌的群落结构特点。2.2 发酵起始和结束阶段细菌群落结构2.2.1 发酵起始和结束阶段酒醅样品与物种共线性分析为获得细菌在发酵起始和结束阶段的表型差异和共存在关系，必须对清酱香型白酒陶坛发酵过程细菌群落结构进行解析，进一步认识其调控作用，对两车间发酵1 d和发酵20 d酒醅样品的细菌进行相关性分析，结果见图4。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/dce71b2d0959b4579b22e524d8ae126a.jpg&p=786x1098&q=30 图 4 发酵1 d和20 d酒醅样品与物种共线性网络分析图
Fig. 4 Collinearity analysis of bacterial genera in 1 d and 20 d fermented grains
对比YB1发酵起始（1F 1 d）和发酵结束（1F 20 d）时的酒醅，从图4a可看出，有Candidatus_Saccharimonas等6 个属只出现在发酵1 d酒醅中，发酵结束时未检出，说明这6 个属受发酵条件调控明显。这6 个属在发酵1 d时相对丰度和占0.03%，在发酵过程所占菌群结构比例很小。此外，有56 个属在发酵1 d未检出，但在发酵结束阶段检出（相对丰度和占0.48%），这些属与发酵工艺变化存在协同性，并富集于发酵过程。值得注意的是，有79 个属同时出现在发酵开始和结束阶段，其中有73 个属同时出现在YB1的4 个采样阶段，在各阶段的丰度和分别占99.96%、98.91%、99.38%和98.05%，表明这些属在发酵过程起主导性作用。对比YB2酒醅在发酵开始（2F 1 d）和发酵结束（2F 20 d）阶段的菌群结构（图4b）可知，有26 个属只出现在发酵1 d，发酵结束时未检出，这部分属在发酵1 d的相对丰度和占0.20%。此外，有33 个属在于发酵1 d未检出，但在发酵结束时有检出，其相对丰度和占0.20%。同时出现在发酵开始和结束阶段的有79 个属，其中有66 个属同时出现在YB2样品的4 个采样阶段，这66 个属在各阶段的丰度和分别占99.68%、99.54%、99.60%和97.83%，同样表明这些属在发酵过程具有重要作用。在YB1酒醅样品中，共检出166 个属，有43.96%的属存在于发酵起始阶段并稳定迁移、维持至发酵结束阶段，这些属在各阶段的相对丰度和高达98%以上。另外，有33.73%的属在发酵起始阶段未检出，在发酵进程中富集，但在发酵结束时相对丰度和仅占0.48%。在YB2酒醅中共检出146 个属，有45.21%的属从发酵起始阶段一直稳定至发酵结束，其在各阶段的相对丰度和高达97.83%以上。另外，有22.60%的属在发酵起始阶段未检出，但在发酵过程得到富集，到发酵结束时相对丰度和为0.20%。上述结果表明，在清酱香型白酒（人民小酒）发酵过程中，YB1、YB2平均有10.71%的细菌发生消亡，同时平均有28.17%的新物种得到富集，但其相对丰度和均不超过1.9%，所起的调控和发酵作用不明显，起主导作用的微生物菌群从发酵起始阶段就存在并稳定维持至发酵结束。虽然两个车间的微生物存在一定差异，但调控发酵的主要微生物结构相似度高，且稳定性较好，部分微生物存在差异主要来源于随发酵时间延长，发酵工艺参数变化和微生物结构变化之间的相互影响和调控。四是金融监管法律体系的完善能减少“一刀切”的金融管理中的弊端。新兴科技的发展为金融业的创新带来了契机，互联网金融的推行让金融行业的“压抑”得到解放，它是传统金融运行的重要补充与创新，为普惠金融方面的发展提供了重要价值。国家在发展上对传统金融和互联网金融的政策必须把握原则，同时反对“一刀切”，要在创新中做到实事求是。 2.2.2 发酵起始和结束阶段主要细菌群落差异分析根据上述主要细菌菌群丰度数据，运用统计学方法，对发酵1 d和发酵20 d酒醅的主要细菌属进行假设检验，评估物种丰度差异的显著性水平，获得发酵起始和结束阶段样品的显著性差异物种及主要细菌属变化结果，以进一步解析发酵过程主要细菌属的调控作用，结果如图5所示。上述17 个主要细菌属，在YB1（图5a）中相对丰度高度显著（P＜0.001）下降的有Weissella、Gluconobacter和Pseudomonas 3 个属，其余14 个属全部呈高度显著（P＜0.001）上升。在YB2（图5b）中相对丰度下降的有Weissella、Gluconobacter、Staphylococcus、Bacillus和Lentibacillus 5 个属，其余12 个属相对丰度呈现上升。其中，Weissella、Gluconobacter、Staphylococcus和Lentibacillus 4 个属相对丰度呈现高度显著（P＜0.001）下降，Lactobacillus、Pseudomonas、Acetobacter、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc和Pantoea 11 个属相对丰度呈现高度显著（P＜0.001）上升，Bacillus和Kozakia无显著性变化（P＞0.01）。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/2022fdab45aa72ac438e536d40f82e24.jpg&p=734x1088&q=30 图 5 发酵起始和结束阶段主要细菌群落差异分析
Fig. 5 Analysis of differences in major bacterial community at the initial and final stages of fermentation
同时也可看出，在发酵阶段，主要细菌属的相对丰度存在变化。两个车间平均73.53%的主要细菌属呈现高度显著（P＜0.001）上升，平均20.59%的主要细菌属呈现高度显著（P＜0.001）下降，仅有2 个属无显著性变化。发酵结束阶段，细菌群落组成结构相对比较稳定，没有占绝对优势的微生物。在YB1中仅有Gluconobacter和Staphylococcus两个属是优势细菌属，相对丰度分别是18.20%和20.46%；在YB2也只有Weissella和Lactobacillus两个属是优势细菌属，相对丰度分别为12.03%和25.97%。首先，校本教研要制度化、规范化。教研活动制度化，就是教研活动必须按规定进行，有规矩。教研或次数时间地点要固定。每次活动要做好前移准备，定主题发言人等程序。做好记录，反思存在问题和改进措施。 综上，发酵阶段会发生主要细菌群落结构的内部调控机制，平均73.53%的主要细菌属相对丰度呈高度显著（P＜0.001）上升，20.59%的主要细菌属相对丰度呈高度显著（P＜0.001）下降。细菌在发酵过程的含量变化主要受发酵过程发酵酒醅理化指标变化和微生物群落结构的双向调控。到发酵结束阶段，因酒醅理化指标所导致的发酵环境相对稳定，所以该阶段的主要细菌组成结构呈现相对稳定，其相对丰度均小于25.97%。2.3 主要细菌群落之间相关性上述结果表明发酵过程的主要细菌群落结构之间通过共生、竞争及拮抗等关系形成复杂的相互调控机制，进而形成一个相对稳定的发酵微生物群落。为深入挖掘主要细菌群落之间的相关性及其变化规律，采用网络分析方法对17 个主要细菌属进行了相关性分析，结果如图6所示。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/a03558020e779003aa2dac8dcbaac248.jpg&p=664x1462&q=30
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/bdf72a1511df29c17e7539d7cb657193.jpg&p=708x598&q=30 图 6 酒醅样品中的主要细菌群落相关性网络图（属水平）
Fig. 6 Correlation network of major bacterial genera in fermented grain samples
从图6可看出，发酵过程平均81.12%的细菌菌属之间呈显著正相关（P＜0.05）。在YB1中，正相关性占总相关性的85.19%，负相关性占总相关性的14.81%。在YB2中，正相关性占总相关性的77.05%，负相关性占总相关性的22.95%。表明这些微生物菌群在发酵过程存在一定程度上相似生态位。Hubs种类及多少在一定程度上可反映特定环境中微生物菌群结构的稳定性。从YB1的同现性网络图谱（图6a）中共发现Komagataeibacter、Pantoea、Lentibacillus、Enterobacter、Oceanobacillus、Pediococcus、Staphylococcus和Bacillus 8 个Hubs（这里指至少与其他4 个属的微生物存在正相关的节点）。Komagataeibacter是Proteobacteria门下的醋酸菌，与Bacillus、Kozakia、Acetobacter、Pantoea、Pediococcus和Enterobacter显著正相关（P＜0.05）。Pantoea与Leuconostoc显著正相关（P＜0.05）。Lentibacillus与Oceanobacillus、Staphylococcus和Kroppenstedtia显著正相关（P＜0.05）。Bacillus与Pantoea显著正相关（P＜0.05）。Staphylococcus与Oceanobacillu和Kroppenstedtia显著正相关（P＜0.05）。Pediococcus与Bacillus、Leuconostoc和Pantoea显著正相关（P＜0.05）。Lentibacillus与Oceanobacillu、Staphylococcus和Kroppenstedtia显著正相关（P＜0.05）。Enterobacter与Bacillus、Staphylococcus、Oceanobacillu和Lentibacillus显著正相关（P＜0.05）。从YB1的负相关网络（图6b）可发现Pseudomonas 1 个负相关Hub（这里指至少与其他3 个属的微生物存在负相关的节点）。Pseudomonas与Gluconobacter、Acetobacter和Kozakia显著负相关（P＜0.05），此外乳酸菌Weissella和醋酸菌Acinetobacter显著负相关（P＜0.05）。从YB2的共现性网络图谱（图6c）中共发现10 个Hubs，分别是Firmicutes下的Pediococcus、Lactobacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus和Leuconostoc；Proteobacteria下的Komagataeibacter、Acetobacter、Enterobacter、Acinetobacter和Pantoea。这些微生物中，除Leuconostoc与Acinetobacter，Kroppenstedtia与Oceanobacillus、Pediococcus之间相关性不显著外（P＞0.05），其余全部两两显著正相关（P＜0.05）。从YB2的负相关网络（图6d）发现Staphylococcus和Pseudomonas两个Hubs。Staphylococcus与Acetobacter、Leuconostoc、Pantoea、Enterobacter、Komagataeibacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus和Acinetobacter显著负相关（P＜0.05），这几个微生物属全都是正相关Hubs。而在YB1中，Staphylococcus与Lentibacillus、Enterobacter、Oceanobacillus和Kroppenstedtia显著正相关（P＜0.05）。该结果与Staphylococcus在两个车间的含量不同有关。在YB1中，Staphylococcus总体呈上升趋势，相对丰度从起发阶段的9.07%上升至发酵结束时的20.46%。而在YB2，Staphylococcus的相对丰度从起酵时的28.03%下降至发酵结束时为0.95%。在YB2中，Pseudomonas和Lentibacillus、Bacillus、Kozakia显著负相关（P＜0.05），Pseudomonas在YB1中也与3 个属的微生物存在显著负相关（P＜0.05）。从主要细菌群落在两个车间酒醅的相关性分析结果发现，其发酵过程平均81.12%的主要细菌菌属之间呈显著正相关（P＜0.05），18.88%的主要细菌菌属之间呈显著负相关（P＜0.05）。Komagataeibacter、Pantoea、Enterobacter、Oceanobacillus和Pediococcus是清酱香型白酒（人民小酒）两个车间发酵体系中共有的正相关Hubs，对维持发酵体系的正常、稳态发展和酒体风味的形成起到非常重要的作用。Pseudomonas是两个车间发酵体系中共有的负相关Hub。Patterns and characteristics of climate changes around the Taihu Lake area 3 结 论清酱香型白酒发酵过程的优势细菌门与清香型、酱香型白酒相同，均为Firmicutes和Proteobacteria，主要细菌属为Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea，优势细菌属为Weissella、Staphylococcus、Lactobacillus和Gluconobacter。Streptpcoccus在清香型白酒酿造过程中是主要细菌属，Acidithiobacillus、Phyllobacterium、Shewanella、Clostridium、Sensu stricto 1、Actinobacillus、Peptoclostridium、Citrobacter、Burkholderia、Desmospora和Serpens在酱香型白酒酒醅中是主要细菌属，但在清酱香型白酒发酵过程中均未检出。与清香型、酱香型白酒酿造过程微生物对比，清酱香型白酒酿造过程的细菌群落结构与清香型白酒、酱香型白酒酿造均有一定的相似性，但又不同于典型的清香型和酱香型白酒酿造过程的细菌群落结构，具有其自身独特性，本研究对清酱香型白酒酿造微生物群落结构差异分析，为探究清酱香型白酒风味形成的微生物成因（菌系基础）和风味特征凝练和品质创新奠定了必要基础。发酵过程平均有10.71%的细菌发生消亡，平均28.17%的物种得到富集，但其相对丰度都很低，相对丰度和均小于1.9%；主要细菌属的群落组成结构发生了变化，平均73.53%的主要细菌属呈高度显著上升，20.59%的菌属呈高度显著下降。在发酵结束阶段，主要细菌群落组成结构相对稳定，相对丰度均不超过25.97%；发酵过程，平均81.12%的主要细菌菌属之间呈显著正相关，18.88%的主要细菌菌属之间呈显著负相关。Komagataeibacter、Pantoea、Enterobacter、Oceanobacillus和Pediococcus是清酱香型白酒（人民小酒）发酵体系中共有的正相关Hubs，对维持清酱香白酒发酵体系的正常、稳态发展和酒体风味的形成起了非常重要的作用。参考文献： JIN G, ZHU Y, XU Y. Mystery behind Chinese liquor fermentation.Trends in Food Science & Technology, 2017, 63: 18-28. DOI:10.1016/j.tifs.2017.02.016. ZHENG X W, HAN B Z. Baijiu (白酒), Chinese liquor: history,classification and manufacture. Journal of Ethnic Foods, 2016, 3(1):19-25. DOI:10.1016/j.jef.2016.03.001. 马宇, 黄永光. 清酱香型白酒挥发性风味组分及香气特征.食品科学, 2019, 40(20): 241-248. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180730-363. 管健, 廖蓓, 李兆飞, 等. 白酒功能菌的功能特性及应用研究. 中国酿造, 2017, 36(8): 1-5. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.0. 张荣. 地衣芽孢杆菌固态发酵产地衣素及风味活性物质对白酒品质的影响. 无锡: 江南大学, 2014: 10. 王海燕. PCR-DGGE技术对清香型汾酒微生物群落结构演变规律的研究. 无锡: 江南大学, 2014: 2-31. WANG L, WANG Y Y, WANG D Q, et al. Dynamic changes in the bacterial community in Moutai liquor fermentation process characterized by deep sequencing. Journal of the Institute of Brewing, 2015, 121(4): 603-608. DOI:10.1002/jib.259. ZHANG X, ZHAO J, DU X. Barcoded pyrosequencing analysis of the bacterial community of Daqu for light-flavour Chinese liquor.Letters in Applied Microbiology, 2014, 58(6): 549-555. DOI:10.1111/lam.12225. LIANG H, LI W, LUO Q, et al. Analysis of the bacterial community in aged and aging pit mud of Chinese Luzhou-flavour liquor by combined PCR-DGGE and quantitative PCR assay. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2015, 95(13): 2729-2735. DOI:10.1002/jsfa.7013. 袁帅. 用16S rDNAV4区高通量测序分析两种酒糟细菌多样性.贵阳: 贵州师范大学, 2014: 3-16. 王雪山, 杜海, 徐岩. 清香型白酒发酵过程中微生物种群空间分布.食品与发酵工业, 2018, 44(9): 1-8. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.017334. 黄蕴利, 黄永光, 胡建峰, 等. 酱香型白酒第二轮次酒发酵过程微生物多样性研究. 中国酿造, 2017, 36(9): 30-35. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.007. LI X R, MA E B, YAN L Z, et al. Bacterial and fungal diversity in the traditional Chinese liquor fermentation process. International Journal of Food Microbiology, 2011, 146(1): 31-37. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2011.01.030. 戴亦杰, 李宗军, 田志强. 酱香型白酒大曲和糟醅的细菌多样性分析. 食品科学, 2019, 40(4): 152-159. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180228-251. 邢敏钰, 杜海, 徐岩. 芝麻香型白酒发酵过程中乳酸菌多样性及其演替规律. 微生物学通报, 2018, 45(1): 19-28. DOI:10.13344/j.microbiol.china.170136. WANG H Y, GAO Y B, FAN Q W, et al. Characterization and comparison of microbial community of different typical Chinese liquor Daqus by PCR-DGGE. Letters in Applied Microbiology, 2011,53(2): 134-140. DOI:10.1111/j.1472-765X.2011.03076.x. 程才璎, 刘晓风, 袁月祥, 等. 酱香型白酒酒曲和连续七轮次堆积酒醅的细菌群落结构. 应用与环境生物学报, 2014, 20(5): 825-831.DOI:10.3724/SP.J.1145.2014.03035. 王斌, 陈福生. 醋酸菌的分类进展. 中国酿造, 2014, 33(12): 1-10.DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2014.12.001. 梁晨, 杜海, 徐岩. 大曲贮存过程中原核微生物群落结构及风味成分演替规律. 微生物学通报, 2017, 44(2): 384-393. DOI:10.13344/j.microbiol.china.160163. FAN G S, FU Z L, SUN B G, et al. Roles of aging in the production of light-flavored Daqu. Journal of Bioscience and Bioengineering,2019, 127(3): 309-317. DOI:10.1016/j.jbiosc.2018.08.005. 胡建颖, 吴佳婧, 王昕怡, 等. 产纤维素菌株的分离鉴定及产量相关性. 微生物学通报, 2019, 46(1): 93-102. DOI:10.13344/j.microbiol.china.180416. 夏凯, 朱军莉, 梁新乐. 醋酸菌耐酸机理及其群体感应研究新进展. 微生物学报, 2017, 57(3): 321-332. DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.20160233. CHEN G, CHEN C, LEI Z. Meta-omics insights in the microbial community profiling and functional characterization of fermented foods. Trends in Food Science & Technology, 2017, 65: 23-31.DOI:10.1016/j.tifs.2017.05.002. FAN G, SUN B, FU Z, et al. Analysis of physicochemical indices,volatile flavor components, and microbial community of a light-flavor Daqu. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 2018,76(3): 209-218. DOI:10.1080/03610470.2018.1424402. YANG F, CHEN L, LIU Y, et al. Identification of microorganisms producing lactic acid during solid-state fermentation of Maotai flavour liquor. Journal of the Institute of Brewing, 2018, 125(1): 171-177.DOI:10.1002/jib.537. GOU M, WANG H Z, YUAN H W, et al. Characterization of the microbial community in three types of fermentation starters used for Chinese liquor production. Journal of the Institute of Brewing, 2015,121(4): 620-627. DOI:10.1002/jib.272. WANG P, WU Q, JIANG X, et al. Bacillus licheniformis affects the microbial community and metabolic profile in the spontaneous fermentation of Daqu starter for Chinese liquor making.International Journal of Food Microbiology, 2017, 250: 59-67.DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2017.03.010. 黄莹娜, 熊小毛, 胡远亮, 等. 基于PCR-DGGE和高通量测序分析白云边酒窖泥细菌群落结构与多样性. 微生物学通报, 2017, 44(2):375-383. DOI:10.13344/j.microbiol.china.160080. 黄春凯, 左小明, 王红蕾, 等. 一株产纤维素酶菌株的分离、鉴定及产酶特性. 微生物学通报, 2015, 42(4): 646-653. DOI:10.13344/j.microbiol.china.140589. URDANETA D, RAFFE D, FERRER A, et al. Short-chain organic acids produced on glucose, lactose, and citrate media by Enterococcus faecalis, Lactobacillus casei, and Enterobacter aerogenes strains.Bioresource Technology, 1995, 54(2): 99-103. DOI:10.1016/0960-8524(95)00103-4. 韩兴林, 潘学森, 尚柯, 等. 酱香高温堆积酒醅中原核微生物构成的分析. 酿酒, 2017, 44(1): 22-27. DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2018.04.013. 王雪山. 不同环境清香类型白酒发酵微生物种群结构比较及溯源解析. 无锡: 江南大学, 2018: 3. LIU X, GUO K L, ZHANG H X. Determination of microbial diversity in Daqu, a fermentation starter culture of Maotai liquor,using nested PCR-denaturing gradient gel electrophoresis. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 28(6): 2375-2381.DOI:10.1007/s11274-012-1045-y. 郭敏. 基于高通量测序对酱香大曲制曲微生态多样性的研究.贵阳: 贵州大学, 2018: 63. 王元太. 清香型白酒酿造技术. 北京: 中国轻工业出版社, 2009:27-44. SONG Z, DU H, ZHANG Y, et al. Unraveling core functional microbiota in traditional solid-state fermentation by high-throughput amplicons and metatranscriptomics sequencing. Frontiers in Microbiology, 2017, 8: 1294. DOI:10.3389/fmicb.2017.01294. 尚柯. 酱香型白酒高温堆积工艺机理的初步研究. 乌鲁木齐:新疆农业大学, 2016: 52-53.
Bacterial Community Structure and Diversity during Fermentation of Chinese Fen-Maotai-Flavored Liquor in Pottery JarsHU Xiaoxia1, HUANG Yongguang1,2,*, JIANG Xiang2, ZHU Jiahe2, JIN Lei3
(1. Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy, College of Brewery and Food Engineering,Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. Guizhou Yanbo Wine Industry Co. Ltd., Panzhou 553523, China;3. Wuxi Zhentai Wine Industry Co. Ltd., Wuxi 214092, China)Abstract: In this paper, high-throughput sequencing technology combined with mathematical statistics software was used to analyze the bacterial community structure during the fermentation of Chinese Fen-Maotai-flavored liquor in pottery jars. The results showed that Firmicutes and Proteobacteria were the dominant bacterial phyla; Weissella, Gluconobacter,Lactobacillus, Staphylococcus, Pseudomonas, Acetobacter, Bacillus, Kroppenstedtia, Oceanobacillus, Lentibacillus,Pediococcus, Enterobacter, Komagataeibacter, Acinetobacter, Leuconostoc, Kozakia and Pantoea were the main bacterial genera, among which, Weissella, Staphylococcus, Lactobacillus and Gluconobacter were dominant. The main bacterial community structure had the characteristics of the main bacterial community structures of both Fen-flavored liquor and Maotai-flavored liquor. On average 73.53% of the main bacterial genera increased significantly while the remaining 20.59%decreased substantially during the fermentation process. During the late stage of fermentation, the composition of the main bacterial genera was relatively stable, and the relative abundance of each genus was less than 25.97%. On average,81.12% of the major bacterial genera showed a significantly positive correlation whereas the remaining 18.88% showed an antagonistic correlation.Keywords: Chinese Fen-Maotai-flavored liquors; high-throughput sequencing; bacterial community; fermentation in pottery jars
收稿日期：2019-03-14基金项目：贵州省科技支撑计划项目（黔科合支撑2542）；贵州省重点基金项目（黔科合基础1405）；贵州省科技平台及人才团队计划项目（黔科合平台人才5637）；贵州省科学技术厅重大专项（黔科合重大专项字6012）；贵州省科技计划项目（黔科合2169）；贵州大学引进人才项目（贵大人基合字（2016）38号）第一作者简介：胡小霞（1992—）（ORCID: 0000-0002-2884-5617），女，硕士研究生，研究方向为酿酒微生物生态学。E-mail: 2744276901@qq.com*通信作者简介：黄永光（1976—）（ORCID: 0000-0002-6170-7718），男，研究员，博士，研究方向为酿酒微生物、酿酒工艺及酒体品质。E-mail: 772566120@qq.comDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190314-175中图分类号：TS261.1；TS201.3文献标志码：A文章编号：1002-6630（2020）08-0130-09引文格式：胡小霞, 黄永光, 蒋想, 等. 清酱香型白酒陶坛发酵细菌群落结构多样性分析. 食品科学, 2020, 41(8): 130-138.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190314-175. http://www.spkx.net.cn要研究一个制度应当以该制度的目的着手，因而，在研究刑事立法政策时，应当以其目的的基本构成为逻辑起点。笔者认为，刑事立法政策目的与刑事政策目的既有相同之处，又有独特性。关于刑事政策的目的，理论界的通说为四个层次，分别为犯罪防控、社会发展、人权保障与相对公正。［2］由于刑事立法政策与刑法学这门学科联系紧密，因而笔者认为其目的应当有三个层次:首先，指导刑事立法，弥补法律空白，这也应当是刑事立法政策的基本价值取向;其次，强调国家责任，维护社会稳定;最后，其终极目的则是注重人文关怀，追求社会和谐。 HU Xiaoxia, HUANG Yongguang, JIANG Xiang, et al. Bacterial community structure and diversity during fermentation of Chinese Fen-Maotai-flavored liquor in pottery jars. Food Science, 2020, 41(8): 130-138. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190314-175. http://www.spkx.net.cn
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