解淀粉芽孢杆菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆表达...
解淀粉芽孢杆菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆表达及其酶学表征解淀粉芽孢杆菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆表达及其酶学表征陈宝莉，秦 臻，赵黎明*（华东理工大学生物工程学院，发酵工业分离提取技术研发中心，生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）摘 要：从解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens YX-01）中克隆得到一个新型β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因（BaNagase），并成功在大肠杆菌中异源表达。BaNagase编码616 个氨基酸，与B. subtilis来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（AIY91451.1）氨基酸序列相似性最高，为76.97%。通过对比分析，BaNagase属于糖苷水解酶3家族。纯化获得的BaNagase比活力为16.42 U/mg，最适温度65 ℃，最适pH 6.0，且在低于55 ℃条件下能保持高于70%的酶活力。BaNagase展现出高的热稳定性和严格的底物特异性，为其高效制备N-乙酰氨基葡萄糖提供了理论支持。关键词：β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶；解淀粉芽孢杆菌；克隆；酶学性质；糖苷水解酶3家族几丁质是一种由N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc）通过β-1,4-糖苷键连接形成的天然聚糖，在自然界中来源广泛，其年储量仅次于纤维素。以GlcNAc为代表的几丁质水解产物具有促进骨损愈合、增强免疫系统功能、调节肠道和改善皮肤保水性等生理功能，且易溶于水、生物相容性好，被广泛应用于食品、医药和化妆品等多个领域。通过降解几丁质制备GlcNAc的方法主要有化学、物理和酶法，酶法由于较前两者成本低、环境污染小、操作简单，因而成为研究热点。通过2010年9月1日至2012年8月31日梯度气象观测站获取的气象数据分析：总的天气形势夏季气压低、风速小、辐射强、气温高、湿度较小、雨季时雨量较大：冬季气压高、温度低、雨量偏少。 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.52）作为一类糖苷水解酶（glycoside hydrolase，GH），可作用于几丁寡糖的非还原端，将其降解为GlcNAc。该酶是生物体降解几丁质和肽聚糖的关键酶，可替代化学水解方法，用于GlcNAc的工业制备，实现绿色高效生产。除此之外，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶也是真菌和昆虫形成细胞壁的重要参与者，且与糖尿病、肾病有紧密的联系，所以该酶被作为害虫绿色防控技术中的分子靶标与上述疾病诊疗中的重要检测指标。β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶因其在农业、医学、食品和水产等各方面都有重要的应用价值，受到了越来越多的关注。根据碳水化合物代谢酶CAZy数据库（http://www.cazy.org）的分类，目前β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶分布在GH3、GH20、GH84、GH73和GH116家族中。该酶的来源多样，存在于多种动物组织、植物、细菌和真菌中。例如Serratia marcescens和Aspergillus oryzae等来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶由于其具有酶活力高、性质稳定等优点，可用于酶法水解几丁质制备N-乙酰氨基葡萄糖。但相对于其他类型的糖苷酶，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的研究仍较少，大部分已有报道的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活力较低，对其蛋白结构和反应机理之间的关系也有待深入研究。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一种革兰氏阳性菌，其基因组中含有丰富的几丁质代谢酶系，其中壳聚糖酶、内切几丁质酶都已被研究报道，也具有发掘高效β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的潜力。本研究从B. amyloliquefaciens中克隆得到一个新型β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因BaNagase，在大肠杆菌（Escherichia coli）中异源表达，通过对其蛋白质序列分析、酶学性质和水解历程的研究，旨在为进一步分子改造和实现β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在高效降解几丁质的应用中提供理论基础。1 材料与方法1.1 材料与试剂B. amyloliquefaciens YX-01和pET-28a（＋）载体均由本实验室保存；E. coli DH5α、BL21（DE3） 上海康为世纪生物科技有限公司；DNA Marker DL2000、蛋白Marker、限制性内切酶Nhe I和Xho I 宝生物工程（大连）有限公司；Taq DNA聚合酶 南京Vazyme生物科技有限公司；T4连接酶 美国New England Biolabs公司；对硝基苯基-β-D-乙酰氨基葡萄糖苷（4-nitrophenyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside，pNPGlcNAc）、几丁二糖 美国Sigma公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。1.2 仪器与设备MyCycler聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪、Power Pac Basic电泳仪美国Bio-Rad公司；JY92-IIN超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；UV765紫外-可见分光光度计上海佑科仪器有限公司。1.3 方法1.3.1 BaNagase序列分析与结构模拟根据NCBI提供的B. amyloliquefaciens来源潜在的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因BaNagase的编码序列（GenBank登录号：CBI41296.1），用SighnalP 4.0 sever（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对其核苷酸序列中的信号肽进行分析；使用DNAMAN软件对其核酸序列进行分析；用Primer Premier 5软件设计引物。根据CAZy数据库提供的GH3家族中已有报道的糖苷酶基因序列，使用软件MEGA7按照Neighbor-Joining运算方法构建系统发育树；利用ClustalX2软件进行多重基因序列比对，并利用ESPrit3.0在线软件（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）进行二级结构预测。利用ExPASy（https://web.expasy.org）在线软件对蛋白质的等电点和分子质量进行预测。基于Swiss-Model在线建模服务器（https://www.swissmodel.expasy.org/），进行BaNagase蛋白结构的预测，筛选与其氨基酸序列一致性高于30%的模板蛋白，利用Swiss-Model的自动模式建立模型。利用SwissDock系统进行β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶与几丁二糖对接构象的预测；利用PyMOL作图软件绘制蛋白质三维结构和对接构象。其中：和分别是语言变量Rij和对应的三角模糊数，当Rij≻时，Fij表示Rij相对于获得的收益，Rij越优，获得的收益越大；当Rij时，Fij表示Rij相对于产生的损失，Rij越劣，产生的损失越大；当时，Fij表示Rij相对于既无获得收益也无产生损失。 1.3.2 BaNagase基因扩增与重组质粒的构建1.5 统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料服从正态分布以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，不同时点间比较采用重复测量的方差分析，计数资料比较采用χ2 检验，P<0.05为差异有统计学意义。 以B. amyloliquefaciens YX-01菌株为模板进行PCR扩增，用于PCR扩增的引物分别为BaNagase-For（ATTCTA GCTAGCTCGACAAAACCGGACATTCC）和BaNagase-Rev（ATTCCGCTCGAGTTAAAGCGGTTTTCCGTTTT TTAGAT）（下划线部分别为Nhe I和Xho I限制性内切酶酶切位点）。PCR体系：菌液模板1.0 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL、2×Taq Master Mix 25 μL，用双蒸水补足至50 μL。PCR程序为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30 个循环，72 ℃终延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，按SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明进行胶回收。凝胶回收片段经Nhe I和Xho I双酶切后，在T4连接酶作用下与经Nhe I和Xho I双酶切的表达载体pET-28a（＋）连接。将其热激转化至E. coli DH5α感受态细胞中，通过含卡那霉素的LB固体培养基筛选阳性菌落，并在菌落PCR测序鉴定后，成功构建得到的重组质粒命名为pET-28a-BaNagase。评析： 教学的本质意义是师生和生生之间借助教材文本或探究实验过程中进行的思维对话。“生命的起源”一节教学的能力目标是应用证据和逻辑作出科学的推测。重点在具体事例分析中对生命的起源有一个整体上的认识。因此，通过学生之间对老子“天下万物生于有，有生于无”的思维对话中，可判断A、B、C三位学生能够在事实和逻辑的基础上作出科学合理的推测，并应用抽象与概括形成自己的观点。只有D的认知逻辑错误，因此观点不成立。 1.3.3 BaNagase诱导表达与分离纯化因此解决教改中老师企业项目经验以及学生学习积极性的问题是教改需要最终解决的问题，要解决这个问题必须要行业企业、教师、学生形成长效互动的校企教学合作机制。 将成功构建的重组质粒热激转化至E. coli BL21（DE3）感受态细胞中，挑取转化子接入LB液体培养基中，振荡培养至OD600 nm达到0.6～0.8，加入1‰ 1 mol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG），30 ℃诱导培养10 h。菌液离心后收集细胞弃上清液，用平衡缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑）吹打沉淀至悬浮，超声波破碎细胞。10 000 r/min离心5 min，收集上清液，使用Ni-IDA亲和层析柱进行蛋白纯化。Ni-IDA亲和层析柱在经5 倍柱体积的平衡缓冲液预平衡后上样，用平衡缓冲液冲洗至OD280 nm小于0.05，用含有40 mmol/L咪唑的Tris-HCl缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，40 mmol/L咪唑）进一步除去非特异性结合蛋白，至OD280 nm小于0.05。最后用洗脱缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，200 mmol/L咪唑）洗脱并收集目的蛋白。分别取上清液和目的蛋白洗脱液加入蛋白电泳缓冲液，沸水浴煮沸10 min，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE，分离胶12.5%，浓缩胶4%）对蛋白分子质量进行检测。使用低分子质量蛋白标准品进行校准，其中含有磷酸化酶B（97.2 kDa）、牛血清白蛋白（66.4 kDa）、卵清蛋白（44.3 kDa）、碳酸酐酶（29.0 kDa）和胰蛋白酶抑制剂（20.1 kDa）。1.3.4 酶活力的测定蛋白含量测定：以牛血清白蛋白为标准品绘制标准曲线，采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。取100 μL适当稀释的蛋白溶液，加入1 mL Bradford工作液，迅速混匀。室温反应3 min后，以加入等量蒸馏水为空白对照，使用分光光度计检测595 nm波长下的吸光度。参照Yang Shaoqing等的比色法测定β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活力，取100 μL 2mmol/L pNP-GlcNAG为底物，加入50 μL 200 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0），混匀，65 ℃预热1 min，然后加入50 μL适当稀释的酶液，反应10 min后，加入200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液终止反应。待冷却后，以等量蒸馏水为空白对照，使用分光光度计检测410 nm波长下的吸光度。酶活力单位（U）定义：在上述条件下，每分钟生成1 μmoL对硝基苯酚所需的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶量为1 个酶活力单位。酶比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力（U/mg）。1.3.5 重组酶BaNagase的酶学性质分析1.3.5.1 最适温度及温度稳定性的测定将BaNagase溶液适当稀释于200 mmol/L pH 6.0的磷酸盐缓冲液中，在不同温度（40～75 ℃）条件下按1.3.4节标准酶活力方法测定其酶活力，以酶活力的最高点为100%，确定其最适反应温度。将BaNagase溶液适当稀释于200 mmol/L pH 6.0的磷酸盐缓冲液中，分别在不同温度下（40～80 ℃）孵育30 min，然后于冰水浴中冷却10 min后，按1.3.4节标准酶活力方法测定残余酶活力，以未经处理酶液的酶活力为100%，确定其温度稳定性。1.3.5.2 最适pH值及pH值稳定性的测定将BaNagase溶液适当稀释于不同缓冲体系（柠檬酸盐缓冲液：pH 4.0～6.5；磷酸盐缓冲液：pH 5.5～8.0；Tris-HCl：pH 7.5～9.0；甘氨酸-NaOH：pH 9.0～10.5）中，在65 ℃条件下按1.3.4节标准酶活力方法测定其酶活力，以酶活力的最高点为100%，确定其最适反应pH值。将BaNagase溶液分别稀释于以上不同pH值的缓冲体系中，置于65 ℃水浴中孵育30 min，然后于冰水浴中冷却10 min后，按1.3.4节标准酶活力方法测定残余酶活力，以未经处理酶液的酶活力为100%，确定pH值稳定性。1.3.5.3 BaNagase底物特异性分析7、适时收获。收获时间应在本区对照品种成熟后3天内一次性全部收完。每一个品种要单脱粒、单晾晒，防止机械混杂。 分别以天然聚/寡糖（壳二糖、壳聚糖、几丁二糖和几丁质）和人工合成的对硝基苯基糖苷（对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、pNP-GlcNAc）为底物，聚/寡糖与酶液按一定比例混合后于50 ℃孵育24 h。通过薄层层析法（展开剂为异丙醇-水-氨水15∶1∶7.5）对产物组成进行分析。对硝基苯基糖苷水解酶活力按照1.3.4节标准酶活力方法进行测定，以水解释放出对硝基苯酚速率计算酶活力。将100 g的垃圾飞灰放入反应釜中，分别取0、5、10、15、20、25 g针铁矿与40 mL纯净水混合后倒入反应釜，设置反应温度20 ℃，搅拌速度100 r/min，反应15 min后取出，倒入模具中，在自然条件下固化3 d后脱模破碎，于40 ℃下烘干后待检。毒性浸出后测定浸出液中Cu2+、Pb2+浓度，浸出结果如图4。结果显示，两种离子的浸出浓度均随针铁矿添加量的增加而降低，铜离子浸出浓度下降更快，在针铁矿用量为15 g后达到反应平衡，且最终Cu2+浓度小于Pb2+浓度。 1.3.5.4 BaNagase动力学参数的测定用50 mmol/L pH 6.0磷酸缓冲液配制10 个不同浓度（0.015、0.03、0.045、0.06、0.075、0.09、0.105、0.12、0.135、0.15 mmol/L）的pNP-GlcNAc作为酶水解的底物，然后加入适量的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在65 ℃反应5 min，通过Sigma Plot软件计算出Vmax、Km值和标准偏差。每个智能光纤托盘可连接12路光纤，12路由DS2431组成的eID电子标签分别安装在12路光纤连接器上，eID通过两根针脚与活动连接器连通，最后连接到智能光纤托盘内部的控制电路板。图2是智能光纤托盘光纤eID安装示意图，a和b为光纤一体化托盘原有配件，其他为加装部分。 1.4 数据统计分析酶学性质表征中，运用软件Origin 9.0对实验数据进行统计分析和图形绘制，数据用 ±s表示。FGF-21是成纤维细胞生长因子家族的新成员，主要在肝表达，其作用靶点可能在脂肪组织。有研究表明，FGF-21的主要生物学功能表现在糖脂代谢调控方面，在经FGF-21处理的糖尿病小鼠及恒河猴的葡萄糖清除率得到改善，同时，FBG、HbA1c、TG、胰岛素和胰高血糖素降低，而且，任何剂量的FGF-21均未导致低血糖。本研究为排除降糖药物和胰岛素治疗及糖尿病并发症的干扰，测定早发初诊的T2DM患者的血浆FGF-21水平，并与健康人群进行了比较，观察到FGF-21在早发初诊T2DM患者血浆中的表达显著升高，提示FGF-21参与T2DM的发生。 2 结果与分析2.1 BaNagase的序列分析与结构模拟NCBI数据库中BLAST结果显示，BaNagase氨基酸序列与GH3家族中B. subtilis（AIY91451.1）来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶序列相似度最高，达76.97%。系统发育树分析结果（图1）显示BaNagase与GH3家族Clostridium paraputrificum（BAC56177.1）、Rhizomucor miehei（AGC24356.1）、Cellulomonas fimi（AAQ05801.1）等来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶属于同一分支，其中BaNagase与B. subtilis（AAA64351.1）来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的进化关系最近；而与GH3家族中β-D-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶亲缘关系较远。BaNagase与GH3家族中其他基因来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶多重序列比对结果（图2）显示，有多处高度保守的氨基酸序列重合，如底物结合位点氨基酸Asp118、Arg126和Arg186以及活性位点氨基酸Asp227、His229和Asp313，尤其是与GH3家族β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因序列中高度保守的KHFPGHGDTxxDSH序列（KHFPGHGDTDVDSH）也完全一致。从蛋白质的二级结构看，其含有的α-螺旋和β-折叠在数量和位置上也与GH3家族中其他来源的蛋白序列保持一致。综合以上，判断BaNagase应归属于GH3家族。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/3c0051ea621c924bdfd245d1deb3b24c.jpg&p=764x766&q=30 图 1 BaNagase氨基酸序列系统发育树分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of β-N-acetylglucosaminidase from B. amyloliquefaciens YX-01 based on amino acid sequence
通过Swiss-Model在线建模服务器对BaNagase的一级氨基酸序列进行检索，发现模型蛋白4gyk.1与目的蛋白的序列甄别率最高75.48%，序列相似度为53%，覆盖率达98%，故选取其为模板蛋白。通过SwissDock预测BaNagase与几丁二糖对接构象，结果如图3所示。通过序列比对及同源建模结果预测BaNagase的蛋白结构由双结构域组成，N端是GH3家族催化结构域，为典型的（β/α）8TIM桶结构；C端是α/β/α三明治构造，为非催化结构域。结合目前已有的研究发现，GH3家族中的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶为保留型GH，采用双置换机制催化水解反应。BaNagase中参与催化反应的关键氨基酸位点预测为作为催化亲核体的Asp313，以及保守序列KHFPGHGDTxxDSH中作为广义酸/碱对的Asp227（加粗）和His229（加粗），且底物结合位点Asp118、Arg126、Arg186、Asp227、His229和Asp313都位于N端TIM桶催化结构域中。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/e6317664af1d1dee0d2b3f4b4223dafa.jpg&p=794x956&q=30 图 2 BaNagase与GH3家族其他来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶氨基酸序列比对图
Fig. 2 Partial multiple sequence alignment of β-N-acetylglucosaminidase cloned from B. amyloliquefaciens and other sources in GH3 family
http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/a9fb208567dcbade1da9e43e33999e01.jpg&p=392x302&q=30 图 3 BaNagase结合几丁二糖的结构模拟Fig. 3 Structural simulation of BaNagase binding to chitin disaccharides
2.2 基因克隆与重组质粒的构建以B. amyloliquefaciens YX-01基因组DNA为模板，PCR扩增获得目的片段，1%琼脂糖凝胶电泳显示在2 000 bp左右有一条特异的DNA扩增条带，大小与预期结果一致。经过双酶切和连接反应，构建得到重组质粒pET-28a-BaNagase。测序结果显示B. amyloliquefaciens来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的核氨酸序列长度为1 851 bp，编码616 个氨基酸残基，N端带有组氨酸标签。通过软件预测其等电点为9.33，分子质量为67.50 kDa。2.3 重组质粒的诱导表达及分离纯化将成功构建的重组质粒pET-28a-BaNagase转入E. coli BL21（DE3）感受态细胞中。在30 ℃、200 r/min的条件下，经1‰ 1 mol/L的IPTG溶液诱导培养10 h，成功获得可溶性表达的目的蛋白。超声波细胞破壁后的上清液经Ni-IDA亲和层析柱分离纯化后，得到高纯度的目的蛋白。通过SDS-PAGE检测分析（图4），结果显示纯化后得到了单一的目的蛋白条带，分子质量约为67 kDa，与BaNagase的理论分子质量大小一致。该重组蛋白以pNPGlcNAG为底物，比活力为16.42 U/mg。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/eab528bf0d51107cbdc50e90105c7763.jpg&p=654x528&q=30 图 4 SDS-PAGE分析重组蛋白BaNagase的表达和纯化
Fig. 4 Expression and purification of BaNagase as shown by SDS-PAGE
2.4 BaNagase酶学性质分析2.4.1 最适温度和温度稳定性测定BaNagase在不同温度下（40～75 ℃）的酶活力，在65 ℃时酶活力最高（图5A），β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的最适温度多在37～60 ℃之间，BaNagase的最适反应温度相较其他来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶而言更高。将酶液在40～75 ℃的条件下分别孵育30 min，在温度低于55 ℃的条件下BaNagase较稳定，残余酶活力保持在70%以上；在60 ℃条件孵育30 min后仍保持50%的酶活力（图5B）。研究发现大部分β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在不高于40 ℃的条件下稳定性较高；在45～60 ℃时其热稳定性都较差，Microbacterium sp.和Shinella sp.来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在45 ℃时半衰期分别只有3 min和2 min；目前已有报道的稳定性最高的是Trichoderma reesei来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，在60 ℃时半衰期可长达8 h，而其他来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在60 ℃条件下半衰期都普遍低于15 min。相较于其他来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，BaNagase展现出了更高的热稳定性，在较高温度反应条件的工业生产中具有应用潜力。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/cb914b702731a2b82148d5d03c7ea7c1.jpg&p=720x1236&q=30 图 5 重组蛋白BaNagase的最适温度（A）、温度稳定性（B）、最适pH值（C）及pH值稳定性（D）
Fig. 5 Optimum temperature (A), thermostablity (B), optimum pH (C)and pH stability (D) of the purified recombinant BaNagase
2.4.2 最适pH值和pH值稳定性测定在pH 4.0～10.5不同缓冲液体系中BaNagase活力，在pH 6.0时BaNagase催化活力最高（图5C）。将酶液在不同pH值的缓冲液中孵育30 min，BaNagase在较广的pH值范围内（pH 4.5～11.0）都展现出了很高的稳定性，残余酶活力均保持在70%以上（图5D）。BaNagase具有良好的pH值稳定性，适用于大部分食品、化学和医药工业的生产条件。2.4.3 重组蛋白BaNagase的底物特异性和动力学参数美丽的校园一年四季景色宜人，我们的校园是一座美丽的大花园，也是一个拥有丰富知识的大宝库。美丽的校园，我爱你！（指导老师：胡蓉） 实验分别以天然糖类（壳二糖、壳聚糖、几丁二糖和几丁质）和人工合成的pNP-糖苷（对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、pNP-GlcNAc）为底物。结果显示，BaNagase对几丁二糖（图6）和pNP-GlcNAc表现出最高的水解活性，在4 h内可将1%的几丁二糖基本水解为GlcNAc。薄层层析检测结果发现重组蛋白BaNagase对天然聚糖几丁质的水解率很低，且不能水解壳二糖、壳聚糖及其他人工合成的pNP底物。结果显示BaNagase对几丁二糖和pNP-GlcNAc有较高的催化活性，而对氨基葡萄糖类底物没有催化活性。表明BaNagase具有严格的底物特异性，与已报道的大部分β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶底物特异性类似。以pNP-GlcNAc为底物研究BaNagase的Vmax及Km分别为20.02 μmol/（min·mg）和0.055 mmol/L。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/108ecb3995890070c9bddad80d52bfd0.jpg&p=546x460&q=30 图 6 薄层层析检测BaNagase水解几丁二糖的反应历程
Fig. 6 TLC analysis of the time course of chitin disaccharide hydrolyzed by the purified recombinant β-N-acetylglucosaminidase
3 结 论β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶是生物降解法制备GlcNAc的工业生产中具有重要意义的一类水解酶。本研究发掘得到了一种B. amyloliquefaciens来源的新型β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因（BaNagase）。BaNagase属于GH3家族，基因序列长度为1 851 bp，共编码616 个氨基酸残基，与GH3家族β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶分支的亲缘关系最近，与GH3家族B. subtilis来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶具有最高的序列相似度；同源建模结果显示BaNagase为双结构域蛋白，3 个催化残基（亲核体Asp313和广义酸/碱对Asp227/His229）以及底物结合位点Asp118、Arg126、Arg186、Asp227、His229和Asp313都位于N端TIM桶结构域中。酶学性质研究结果表明，BaNagase以pNP-GlcNAc为底物的比活力为16.42 U/mg，对pNP-GlcNAc和几丁二糖有较高的催化活性。该酶在4 h内可将几丁二糖基本水解得到GlcNAc；在温度低于55 ℃的条件下，BaNagase能保持相对酶活力高于70%，相比其他来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶具有更高的热稳定性，适用于对热稳定性要求较高的生产应用。研究结果拓展了β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶库资源，为GlcNAc酶法制备及β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基础研究提供了理论支持。参考文献： BHATTACHARYA D, GUPTA N R K. Bacterial chitinases: properties and potential. Critical Reviews in Biotechnology, 2007, 27(1): 21.DOI:10.1080/07388550601168223. LIAQAT F, ELTEM R. Chitooligosaccharides and their biological activities: a comprehensive review. Carbohydrate Polymers, 2018,184: 243-259. DOI:10.1016/j.carbpol.2017.12.067. PHIL L, NAVEED M, MOHAMMAD I S, et al. 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Gene Cloning, Expression and Characterization of β-N-Acetylglucosaminidase from Bacillus amyloliquefaciensCHEN Baoli, QIN Zhen, ZHAO Liming*
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, R&D Center of Separation and Extraction Technology in Fermentation Industry,School of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)Abstract: In this study, a novel β-N-acetylglucosaminidase gene was cloned from Bacillus amyloliquefaciens YX-01 and successfully expressed in Escherichia coli BL21. The recombinant protein (defined as BaNagase) was purified by Ni-IDA affinity chromatography and analyzed. The results showed that it encoded 616 amino acids, with the highest similarity(76.97%) to the sequence of β-N-acetylglucosidase (AIY91451.1) from B. subtilis. According to the phylogenetic analysis and multiple sequence alignments, BaNagase belonged to glycoside hydrolase (GH) family 3. The recombinant BaNagase showed specific activity of 16.42 U/mg toward the substrate pNP-GlcNAc. Its optimal pH value was 6.0 and the optimal reaction temperature was 65 ℃. BaNagase showed good stability below 55 ℃ at which more than 70% of initial activity was still retained. BaNagase exhibited strong thermostability and strict substrate specificity. This study provides a theoretical basis for efficient preparation of N-acetylglucosamine.Keywords: β-N-acetylglucosaminidase; Bacillus amyloliquefaciens; cloning; characterization; glycoside hydrolase family 3
收稿日期：2019-02-21基金项目：上海市教育委员会和上海市教育发展基金会“曙光计划”项目（15SG28）；高等学校学科创新引智计划项目（B18022）第一作者简介：陈宝莉（1993—）（ORCID: 0000-0001-9311-3976），女，硕士研究生，研究方向为食品药品与材料工程。E-mail: 15757172007@163.com*通信作者简介：赵黎明（1977—）（ORCID: 0000-0002-6731-0279），男，教授，博士，研究方向为食品加工技术。E-mail: zhaoliming@ecust.comDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190221-132中图分类号：Q814文献标志码：A文章编号：1002-6630（2020）08-0123-07引文格式：陈宝莉, 秦臻, 赵黎明. 解淀粉芽孢杆菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆表达及其酶学表征. 食品科学, 2020,41(8): 123-129. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190221-132. http://www.spkx.net.cnCHEN Baoli, QIN Zhen, ZHAO Liming. Gene cloning, expression and characterization of β-N-acetylglucosaminidase from Bacillus amyloliquefaciens. Food Science, 2020, 41(8): 123-129. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190221-132. http://www.spkx.net.cn本研究的对象是初中数学教师.个案教师的选择是在前期调研与问卷调查的基础上形成的.在前期调研中，教研室与相关学校的领导在了解了本课题研究的目的与思路后，推荐了多位教师.在观摩了这些教师的数学课堂教学并进行了访谈之后，选择了J中学的一名教师——在此我们称其为张老师.而后对初中数学教师PCK现状的问卷调查发现，这位教师一定程度上具有代表性.因此，最终确定了J中学的这位张老师作为研究个案.
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