铁蛋白-海藻酸钠纳米包埋ACE抑制肽
铁蛋白-海藻酸钠纳米包埋ACE抑制肽铁蛋白-海藻酸钠纳米包埋ACE抑制肽夏伟荣1，李 莹2,*，柴 智2，陈小娥1，周剑忠2，冯 进2，方旭波1,*（1.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江 舟山 316022；2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014）摘 要：利用铁蛋白在极酸条件下可逆组装特性和海藻酸钠（sodium alginate，SA）的控释作用，以马脾脱铁铁蛋白（horse spleen apoferritin，HSF）和SA作为纳米载体，包埋血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽丙氨酸-组氨酸-亮氨酸-亮氨酸（Ala-His-Leu-Leu，AHLL），以期提高ACE抑制肽AHLL在消化系统中的吸收效果。以包封率为评价指标，优化实验条件。结果显示，纳米粒的最佳制备条件为HSF浓度1～2 µmol/L之间、SA质量浓度10 mg/L、AHLL终质量浓度100～200 µg/mL范围内，此时制备的纳米粒体系包封率较高。运用透射电子显微镜对HSF-AHLL和HSF-SA-AHLL进行结构表征，从表观上呈现出均一的纳米体系。纳米粒的粒径和电位测定结果体现出包埋体系的稳定性。Caco-2细胞单层模型的体外转运实验，证明了纳米体系中的AHLL在消化系统中吸收效果更好。据此铁蛋白和SA可以作为载体被应用在活性肽稳态化保持，也为活性营养成分的吸收提供一条有效途径。关键词：马脾脱铁铁蛋白；血管紧张素转化酶抑制肽；海藻酸钠；包埋；纳米粒；吸收血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽丙氨酸-组氨酸-亮氨酸-亮氨酸（Ala-His-Leu-Leu，AHLL）是从泥鳅蛋白酶解物中分离纯化的一种具备抑制ACE活性的四肽。泥鳅经蛋白酶可控降解，释放出优异的ACE活性肽。有研究表明它可以抑制ACE活性，在原发性高血压大鼠上具有一定降血压效果，通过Caco-2细胞模型研究发现AHLL具有较好的吸收性，细胞吸收的表观渗透系数达到1×10-6 cm/s数量级。然而，AHLL稳定性较差，容易被消化道中蛋白酶降解，导致ACE抑制活性显著下降，从而减少了活性肽AHLL有效进入吸收系统的量。铁蛋白是一类铁贮藏蛋白质，广泛存在于动植物以及微生物体内，具有调节各类生物体内铁代谢平衡、抗氧化及解毒等作用。生物体内铁蛋白主要由蛋白质外壳和化合态铁核两部分组成。铁蛋白的铁核可以通过在无氧条件下加入还原剂透析的方式除去。含有铁核的铁蛋白称为含铁铁蛋白，不含矿化铁核的铁蛋白称为脱铁铁蛋白。近年来铁蛋白的可逆组装特性受到广泛关注。脱铁或重组铁蛋白在变性条件下（极酸或极碱性环境）解离为单亚基，当pH值恢复至中性时，铁蛋白会恢复球形结构。利用这一性质，将铁蛋白外壳作为纳米载体，在铁蛋白的变性复性过程中添加小分子营养物质，包埋于铁蛋白的空腔内，可使小分子物质免受外界干扰，从而提高其稳定性。作为首个被分离并获得结晶的铁蛋白，马脾铁蛋白备受关注，其在医药新材料、免疫电子显微镜分析技术、疾病诊断等多领域都有广泛应用。马脾铁蛋白单独作纳米颗粒载体时，往往存在稳定性差、体系易受环境因素影响的缺陷。多糖作为另一类常见的生物高聚物，易与蛋白质发生复凝聚，从而用其复配应用在纳米颗粒载体的材料领域。海藻酸钠（sodium alginate，SA）作为天然高分子聚合物，具有生物相容性良好、可在体内降解、毒性低、来源广泛、价格便宜的优势，因此受到越来越多地关注。研究表明，SA具有增稠性、凝胶性、成膜性等一系列优良的理化性质及生理活性，形成的纳米颗粒往往具有良好的球形外观和控释功能。已有研究表明将此两种物质结合运用，既可发挥铁蛋白可逆组装特性又兼具多糖的控释效果。本实验以马脾脱铁铁蛋白（horse spleen apoferritin，HSF）及SA为载体材料包埋ACE抑制肽AHLL，利用铁蛋白和多糖的相互作用，制备均匀分散的HSF-ACE抑制肽（HSFAHLL）及HSF-SA-ACE抑制肽（HSF-SA-AHLL）纳米复合体系，以期提高AHLL在消化系统中的吸收效果。1 材料与方法1.1 材料与试剂ACE抑制肽AHLL（纯度＞99%，摩尔质量452 g/mol）上海强耀生物科技有限公司；马脾铁蛋白（摩尔质量443 kg/mol）、SA、醋酸钠、连二亚硫酸钠美国Sigma Aldrich公司；MOPS缓冲液 美国Amresco公司；27 MM透析袋（截留分子质量12 000～14 000 Da） 美国Biosharp公司；乙腈（色谱纯）江苏汉邦公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）上海源叶生物科技有限公司；DMEM培养基（4.5 g/L D-葡萄糖）、胎牛血清、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）、Hank’s平衡盐溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS） 美国Gibco公司。其他试剂均为分析纯，实验用水均为超纯水。1.2 仪器与设备TG16-WS台式高速离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；JB-10雷磁搅拌器、ZD-2雷磁自动电位滴定仪上海仪电科学仪器股份有限公司；KQ-400KDB型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；ZNCL-GS数显加热磁力搅拌器 上海越众仪器有限公司；HT7700透射电子显微镜 日本Hitachi公司；Malvern Nano ZS90粒度电位仪 英国Malvern仪器公司；1260 Infinity高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪美国Agilent公司；500型精密电子天平 意大利BEL公司；DK-8D电子恒温水浴槽 上海精宏实验设备有限公司；Synergy UV超纯水仪 广州东锐科技有限公司；Millicell ERS-2电阻仪 美国Millipore公司。1.3 方法1.3.1 样品溶液的制备基于框架语义学的英语军语词汇教学从认知语言学和认知心理学的角度分析了学员在学习军语单词时的困难。针对这种两种语言之间框架不对等导致的学习障碍，在教学过程中要在学员已有的认识基础上，揭示不同语言之间的框架差异，帮助学员建立新的二语框架，提高学员军语词汇认知水平。 1.3.1.1 HSF溶液的制备8.牛呼吸道合胞体病毒感染。潜伏期2～3 d，急性发病牛精神沉郁和厌食，高热40℃～42℃，流涎和流浆液性鼻液，呼吸困难，张口呼吸，发出呻吟音。部分牛靠近肩峰处皮下可触摸到气肿，无继发细菌感染的情况下，一般病程为10～14 d，死亡率很低。 按照柴智的方法制备。调节醋酸钠缓冲溶液的pH值为5.2，用3 g/100 mL的连二亚硫酸钠将铁蛋白中三价铁离子还原为二价铁离子，透析除去。再加入1 mmol/L的2,2-联吡啶螯合以除去痕量的铁，最后，在pH 7.0的50 mmol/L MOPS缓冲液中透析除去2,2-联吡啶，样品溶解在5 mmol/L MOPS缓冲溶液中备用。用BCA试剂盒（微量酶标法）测定蛋白质浓度。蛋白质纯化过程中除特殊指出，其他步骤均在4 ℃低温操作。1.3.1.2 多糖溶液的制备称取一定量的SA溶于去离子水中，25 ℃搅拌24 h使其充分水合备用。连锁便利超市在对生鲜农产品进行大批量订货后，库存中的生鲜农产品可能会因为销售和客户需求原因存储一段时间，容易导致生鲜农产品变质和腐败，从而产生企业的废弃成本。 1.3.2 HSF-AHLL的制备准确称取20 mg的AHLL标准品，溶解在HBSS平衡盐溶液中制备成质量浓度为20 mg/mL的母液，4 ℃避光保存待用。将2 mL 2 µmol/L的蛋白溶液（5 mmol/L MOPS，pH 7.0）置于瓶中，用1 mol/L HCl溶液调节溶液pH值至2.0，室温搅拌20 min，使蛋白解离为单个亚基状态。随后边搅拌边逐滴缓慢加入20 µL AHLL母液（20 mg/mL），使其终质量浓度为200 µg/mL，此时蛋白和AHLL的物质的量比为1∶200。室温搅拌20 min后，用1 mol/L NaOH将溶液pH值调至7.4，于4 ℃层析冷柜中搅拌2 h以上。再将上述混合液装入截留分子质量为12 000～14 000 Da的透析袋，在pH 7.4、5 mmol/L MOPS溶液里进行透析处理，除去未包埋的游离AHLL，每隔8 h换一次透析液，待透析完成后取出包埋物备用。1.3.3 HSF-SA-AHLL的制备调节SA溶液的终质量浓度为5～25 mg/L。分别调节HSF-AHLL纳米颗粒悬浮液和SA溶液的pH值至3.0，然后将SA溶液逐滴滴入纳米颗粒悬浮液中，同时不断搅拌获得HSF-SA-AHLL复合纳米运载体系。然后，将包埋物置于截留分子质量为12 000～14 000 Da的透析袋中，使用MOPS缓冲液（pH 7.0，5 mmol/L）在4 ℃层析柜中避光透析4 次，每隔8 h换一次透析缓冲液，以除去未结合的AHLL，获得HSF-SA-AHLL包埋物，置于4 ℃避光保存。1.3.4 纳米粒粒径和Zeta电位的测定将按1.3.2节和1.3.3节制备的纳米粒放入Malvern Nano ZS90粒度电位仪的槽中，散射光角度固定在90°，测定温度固定在（25±1）℃。仪器所用光源是固定激光，操作波长为353 nm，功率为30 W，测定纳米粒的粒径和Zeta电位。张允和和周有光的妹妹是同学，两人由此相识。两家都是望族，但周家此时已经没落，一度连周有光念大学时的学费都交不起，所以张允和常笑称自己是戏曲看多了，有“落难公子后花园”的情结，不仅没有嫌弃周家家道中落，反而认定了周有光是个“落难公子”，想去搭救他一把。 分析 设D(x0,y0)，当x0=0时，已证明.下面证明x0≠0的情况，设切点Q(x3,y3),P(x4,y4)，此时y0y3y4≠0.如图2，直线DQ的斜率一定存在，则直线DQ:y3y=p(x+x3)， 接着，徐通理给他细细解释“色即空，空即色”的处世哲学：他们把人生所需要的能看得见摸得着的东西都归纳为色，把无求无欲的崇高的为人道德归纳为空。人只有达到无求无欲这种“空”的境界，才能求得正果而获得一切。如果只求“色”的东西，求来求去，越求反而离自己所需的东西越远了。接着，老人又说，普通人大多一味地只求“色”的东西，这么一味地求下去，就叫作尘缘未了。 1.3.5 纳米粒中AHLL含量的测定采用HPLC方法测定载入纳米粒中AHLL的含量。将制备好的HSF-AHLL或HSF-SA-AHLL纳米粒溶液在10 000 r/min离心2 min，取上清液，用0.22 µm的水系膜过滤，进行HPLC定量。为落实安全生产“百日攻坚”行动，健全安全生产风险防控和隐患排查治理双重预防机制。11月27日，四师六十一团党委领导带领团经发办、城镇管理中心、农业发展中心、社会事务办公室等相关工作人员，对该团社区、水管所、幼儿园、养老院、酒店、农药店、民营企业、水库等重点防范部位和10个连队进行了为期四天的安全生产大检查。 色谱条件：C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，2 µm）；样品采用梯度洗脱，流动相A为超纯水（含体积分数0.1%的三氟乙酸），流动相B为乙腈（含体积分数0.1%的三氟乙酸）；程序为11 min内流动相B为15%～40%；检测波长220 nm，流速1 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 µL，程序时间15 min。用纯度为99%的AHLL标准品建立标准曲线。根据标准曲线计算样品中AHLL的含量，每个样品至少做3 组平行，取平均值。1.3.6 纳米粒对AHLL包封率的测定纳米粒中样品包封率是指被载入纳米粒中的样品量占投入体系样品总量之比。用HPLC方法检测体系中游离的AHLL含量，包封率计算见式（1）：http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/204f3617564eb7a69bdbc2051b45e82b.jpg式中：A1为投入的AHLL总含量；A2为游离的AHLL含量。1.3.7 透射电子显微镜分析像我这样的女人，觉得生活没意思，似乎也是合理的。快三十岁的我，已经有四十余岁的心态。曾经有人拿二十五岁做分界线，往前是少女，往后就是少妇。我这样的年纪，往前是摩登女郎，往后，我就是弃妇了。 用移液枪吸取制备好的纳米粒，悬滴到带有支持膜的铜网上，室温静置2 min后用滤纸从液珠边缘吸去多余液体，稍晾干后用2%的磷钨酸溶液负染30 s，而后用滤纸吸去染液，静置待液体挥发干净后放入样品槽观察。又如何良俊《曲论》云：“元人乐府称马东篱、郑德辉、关汉卿、白仁甫为四大家。马之词老健而乏姿媚，关之词激厉而少蕴藉，白颇简淡，所欠者俊语，当以郑为第一。”(P6)对惯已有之的元曲四大家之说加以肯定，承认马致远、郑光祖、关汉卿、白朴四人在元曲中的领军地位，同时又以批判眼光分别指出诸人创作中的不足，从而修正了元代以来的四人排序，认为以郑光祖为第一。姑且不论对马、关、白的批评是否得当，仅以何良俊所持的批判态度而言，与明初《太和正音谱》《录鬼簿》中对元曲作家一味赞扬、只言其佳的推尊理念相比，已呈现出一种明显的更趋客观的进步倾向。 1.3.8 包埋肽在Caco-2细胞单层模型中的体外转运分别将ACE抑制肽AHLL、HSF和AHLL混合物及HSFAHLL包埋肽经0.22 µm膜过滤除菌并在37 ℃预热备用。当Transwell板上的Caco-2细胞的跨膜电阻大于250 Ω/cm2，可进行细胞转运实验。用pH 7.4的HBSS溶液洗3 次，第3次洗涤时与细胞置于37 ℃培养箱中共浴15 min，将各孔内HBSS液吸净。对于AP侧到BL侧转运：将0.5 mL样品加入AP侧作为供给池，同时BL侧加入1.5 mL空白HBSS作为接收池；对于BL侧到AP侧的转运：将1.5 mL样品加入BL侧作为供给池，AP侧加0.5 mL空白HBSS作为接收池。每次取样150 µL，同时相应补加37 ℃ 150 µL空白HBSS溶液，所有实验都3 次平行。样品中AHLL含量用HPLC法测定。以表观渗透系数Papp表示AHLL的转运量，计算见式（2）：http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/bde226c9f95bbcbb2b2b17f95b5305d0.jpg
式中：dQ×dt-1为渗透速率/（μmol/s），根据样品在不同时间转运量对时间回归得到的直线斜率；A为Transwell膜表面积/cm2；C0为加入Caco-2细胞模型的样品初始质量浓度/（μg/mL）。1.4 数据处理数据分析与统计采用SPSS 13.0分析软件，结果以 ±s表示，采用t检验分析比较各组之间的差异性，P＜0.05，差异显著。2 结果与分析2.1 AHLL质量浓度对纳米粒包埋效果的影响在HSF浓度为2 µmol/L条件下，装载不同终质量浓度的AHLL溶液，制备过程中其他条件不变，研究AHLL质量浓度对其包封率的影响。由图1可以看出，随着AHLL质量浓度的增大，纳米粒的包封率先显著增大，之后出现平缓趋势，又显著减小。这可能是由于随着AHLL质量浓度不断增大，载体蛋白包埋到一定程度后，包裹单位分子AHLL的铁蛋白数量相对变少，载体包埋AHLL的概率降低，导致AHLL包埋不完全，载体蛋白对AHLL的包封率逐渐下降。考虑到包埋浓度过低会造成AHLL在胃肠道中吸收作用不明显，以及Caco-2细胞实验中AHLL的存活率，综合比较，选择AHLL终质量浓度范围在100～200 µg/mL之间。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/de990c4982d6c2cdfd9192eea77effd3.jpg&p=618x342&q=30 图 1 AHLL质量浓度对纳米粒包封率的影响
Fig. 1 Effect of AHLL concentration on the encapsulation efficiency of nanoparticles
2.2 HSF浓度对纳米粒包埋效果的影响改变包埋体系中载体HSF浓度，相同实验条件下，体系中AHLL终质量浓度为150 µg/mL，研究载体蛋白浓度对AHLL纳米粒包封率的影响。从图2可以看出，随着HSF浓度的增大，纳米粒的包封率先显著增大至一定数值后趋于平缓，之后又出现显著下降的趋势，可见纳米粒的包封率并不与载体蛋白浓度呈正相关关系。这可能是因为，当载体蛋白浓度较小时，可以用来包埋AHLL的数量也较少，随着HSF浓度的增加，可以形成HSF-AHLL纳米粒的数量也增大，包封率随之升高。然而，当包埋的AHLL溶液达到饱和，纳米粒的包封率也随之趋于平缓。但是，再增大载体蛋白浓度后，体系中蛋白浓度过大而发生聚集形成较大颗粒，会影响包埋效果，导致纳米粒包封率出现下降趋势。因此，选择载体蛋白浓度在1～2 µmol/L范围内制备纳米粒。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/a75b462f5d026e22f9403585d67a52b6.jpg&p=624x318&q=30 图 2 HSF浓度对纳米粒包封率的影响
Fig. 2 Effect of HSF concentration on the encapsulation efficiency of nanoparticles
2.3 SA质量浓度对纳米粒包埋效果的影响在HSF浓度2 µmol/L、载入AHLL终质量浓度150 µg/mL、其他条件相同的条件下制备HSF-AHLL纳米粒。调体系pH值为3.0，加入一系列不同质量浓度的SA溶液，研究多糖质量浓度对纳米粒包封率的影响。从图3可以看出，包封率开始显著升高，直到多糖质量浓度为10 mg/L后趋于平衡。这是由于随着SA质量浓度的增加，与HSF-AHLL纳米粒表面结合过程中包裹的AHLL也越多；但当蛋白表面完全被过量的SA分子占据时，大量多糖的亲水链朝向水相，静电斥力和空间位阻效应阻止了体系中颗粒进一步的相互靠近、接触和聚集，溶液中粒径较小的颗粒占主导，获得的HSF-SA-AHLL复合纳米粒变得稳定，从而纳米粒的包封率也基本不变。因此，SA质量浓度为10 mg/L就可以使复合纳米粒包封率达到最高。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/5102a734b7305d2646c1b985c037b1f7.jpg&p=642x310&q=30 图 3 SA质量浓度对纳米粒包封率的影响
Fig. 3 Effect of SA concentration on the encapsulation efficiency of nanoparticles
2.4 粒径和电位分析表 1 HSF和HSF-AHLL的粒径和电位
Table 1 Particle size and potential of HSF and HSF-AHLLhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/5776f98047b99ca120d4590169b866bb.jpg&q=30 注：**. HSF-AHLL与HSF比，差异极显著（P＜0.01）。样品 粒径/nm 电位/mV HSF 19.62±0.84 -39.90±0.62 HSF-AHLL 28.19±0.76** -33.73±0.22**
如表1所示，空壳的HSF粒径为19.62 nm，粒径分布均匀。载入ACE抑制肽后，HSF-AHLL纳米粒粒径增大至28.19 nm，比空壳的HSF粒径约大9 nm。由此，从粒径大小证明了纳米包埋体系是存在的，AHLL有可能被包埋在纳米粒中。纳米粒作为一种活性物质的传输载体，其Zeta电位是考察体系的重要因素之一。纳米粒电位的大小体现了纳米粒胶体溶液的稳定性，Zeta电位值越大，其表面同种电荷的相互排斥作用也越大，纳米粒越不容易出现团聚现象，均匀地分散在溶液中，整个纳米粒体系更加稳定。表1中Zeta电位测定结果显示HSF-AHLL和HSF表面都带负电荷，HSF的电位为-39.9 mV，HSF-AHLL的电位约-34 mV，这些电荷保证了整个包埋体系的稳定性。随着我国惠农政策的落实，农机具结构也在此基础上得到了有效完善，有的机械设备甚至运用了电子技术，对农机使用者也是一个极大的挑战，农机使用者要不断学习新的知识来满足农机设备的使用需求。这时，就需要有一个专门的培训机构来提升农机使用者的综合水平。培训是实现农机安全监理的基础，要想实现安全生产，农机监理就一定要与培训相结合。帮助农机使用者学习新型的农业机械设备，了解新出的机械型号，并强化保养、维护等内容，还要提高农业使用者的业务素质，不断规范办证流程，不符合技术要求的农机使用是不准许入户的，如果农机使用者自身的技术状态没有达到操作要求，农机年审也不可通过。 柴智研究表明，作为一种阴离子多糖，SA在pH 2.0～10.0范围内均带有负电荷。为利用蛋白和多糖分子在酸性条件下的静电吸引作用形成结构紧密的络合物，本实验选择在pH 3.0的条件下制备HSF-SA-AHLL复合纳米粒。图4为SA质量浓度对复合纳米颗粒Zeta电位和粒径的影响。结果显示，随着SA质量浓度的增加，体系的Zeta电位值不断降低，而粒径值逐渐增加，至铁蛋白表面电荷被完全中和，体系电荷呈中性状态，再进一步增大SA添加量，体系电位变成负值，聚合物解聚过程占主导地位，粒径也逐渐变小。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/bfe38eced03d4561ce91222db8c20f0d.jpg&p=670x324&q=30 图 4 不同SA质量浓度下复合纳米粒的粒径和Zeta电位
Fig. 4 Particle size and zeta potential of composite nanoparticles with different SA concentrations
由于随着SA质量浓度的增加，体系中负电荷量逐渐增大，蛋白表面也完全被过量的SA分子占据，大量多糖的亲水链朝向水相，同时静电斥力和空间位阻效应阻止了体系中颗粒进一步的相互靠近、接触和聚集，导致溶液中粒径较小的颗粒占主导，均匀分布在其中，使得体系更加稳定。本实验研究表明，SA质量浓度高于10 mg/L后，体系的Zeta电位和粒径均处于平台期，不再随其质量浓度的变化而变化，制备的HSF-SA-AHLL复合纳米粒体系更稳定。2.5 透射电子显微镜分析http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/f128960edc7f6efa12e00b3c43acc98e.jpg&p=718x208&q=30 图 5 透射电子显微镜图
Fig. 5 Transmission electron micrographs
如图5所示，空壳HSF为均一的球形，蛋白中心有少许黑点，这可能是马脾蛋白脱铁时残留的Fe元素。由图5B可以看出，纳米粒HSF-AHLL也是球形，铁蛋白空壳中有一颗颗小分子物质被包裹其中，ACE抑制肽AHLL在铁蛋白亚基重组过程中被包埋进去，说明此包埋纳米粒体系是存在的。图5C显示：SA没有出现明显的多糖聚集状态。而且，HSF-SA-AHLL复合纳米粒也有与HSF-AHLL纳米粒相似的球形形态，只是直径较前者大。透射电子显微镜结果表明HSF的粒径约20 nm，HSFAHLL纳米粒的粒径为30 nm，HSF-SA-AHLL复合纳米粒的粒径约为150 nm，与Malvern Nano ZS90纳米粒径仪测定的粒径值基本一致，表观证明了HSF-AHLL和HSF-SAAHLL形成了稳定的纳米体系。2.6 不同处理的AHLL在Caco-2细胞单层模型上吸收效果图6显示了AHLL、AHLL和HSF混合物以及HSFAHLL包埋纳米粒在Caco-2细胞单层模型上的吸收量在AP→BL和BL→AP两个方向随时间的变化情况。随着时间的延长，不同处理的AHLL在两个方向的转运量都呈现不断升高的趋势，反映了AHLL的双向转运对时间的依懒性。而其在Caco-2细胞单层的渗透在90 min以内呈线性增长，在150 min时呈饱和状态，这个平台可能是由于浓度梯度的缺少和一些活性载体的饱和造成的，表明主动运输和被动转运同时存在。在AP→BL和BL→AP两个方向，其表观渗透系数均大于10-6 cm/s（表2），表明AHLL在人体肠道中的吸收较好。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/d24414fd273ce348caef4fa7768e860c.jpg&p=684x678&q=30 图 6 不同处理的AHLL在Caco-2细胞模型上双向转运的时效关系
Fig. 6 Time-effect relationship of two-way transport of AHLL with different treatments in Caco-2 cell model
表 2 不同处理的AHLL表观渗透系数（n=3）
Table 2 Apparent permeability coefficients of AHLL with different treatments (n= 3)http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=c446e09566e9e7abe03a5e29ad32008e/b23ca62c85d3aa4188e868de6fb07a98.jpg&q=30 注：*.与AHLL相比，差异显著（P＜0.05）；**.与AHLL相比，差异极显著（P＜0.01）。样品 表观渗透系数/（10-6 cm/s）AP→BL BL→AP AHLL 5.68±0.11 2.64±0.13 AHLL和HSF混合物 7.52±0.19* 3.60±0.23 HSF-AHLL 9.29±0.18** 3.22±0.21
对于AP→BL方向的转运，同一时间内，HSF-AHLL包埋纳米粒明显比单独的AHLL及HSF和AHLL混合物在Caco-2细胞单层模型上转运量大，且表观渗透系数（第90分钟）也明显高于后两者，这是由于HSF作为纳米包埋材料，对AHLL形成保护壁垒，减少了消化道中蛋白酶对其降解量，从而有效提高了AHLL在人体消化系统中的吸收效果。对于BL→AP方向的转运，如表2所示，HSF和AHLL混合物以及HSF-AHLL纳米粒相比单独的AHLL，其表观渗透系数没有显著差异（P＞0.05），如何减小外排作用还需进一步研究。3 结 论本实验利用铁蛋白在强酸条件下可逆组装性质和多糖的控释作用，通过HSF和SA静电吸引形成良好的复合包埋载体。将ACE抑制肽AHLL装载到铁蛋白的空腔内，以期研究得到的高活性HSF-AHLL及HSF-SA-AHLL纳米粒，其形态呈球形。研究表明制备纳米粒的最优条件为载体HSF浓度1～2 µmol/L、多糖质量浓度10 mg/L、AHLL终质量浓度100～200 µg/mL，可制备出包封率较高的纳米粒体系。通过粒径和电位测定分析，相比游离的ACE抑制肽AHLL，装载在HSF空腔中形成的纳米粒体系更加稳定。同时，通过HSF-AHLL在Caco-2细胞单层模型中的体外转运实验，其比游离AHLL在小肠中吸收效果更好。因此，铁蛋白和SA作为一种双壁材纳米载体，可成功用于包埋ACE抑制肽AHLL，且HSF-AHLL纳米粒有效提高了ACE抑制肽AHLL在消化系统中的吸收效果。本实验可对食品加工中小分子活性营养物质的稳定性保持和高效吸收提供一定的参考依据。参考文献： LI Y, ZHOU J Z, HUANG K H, et al. 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Encapsulation of ACE Inhibitory Peptide with Ferritin-Sodium Alginate NanoparticlesXIA Weirong1, LI Ying2,*, CHAI Zhi2, CHEN Xiao’e1, ZHOU Jianzhong2, FENG Jin2, FANG Xubo1,*
(1. School of Food and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China;2. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)Abstract: By taking advantage of the controlled release capacity of sodium alginate (SA) and the reversible assembly characteristics of under extremely acidic conditions, horse spleen apoferritin (HSF) and SA were used as nano-carriers for encapsulation of an angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptide, alanine-histidine-leucine-leucine (Ala-His-Leu-Leu, AHLL), aiming to improve the absorption of AHLL in the digestive system. The results showed that the optimal conditions for the preparation of nanoparticles that provided maximum encapsulation efficiency were determined as follows:HSF concentration 1–2 μmol/L, sodium alginate concentration 10 mg/L, and final concentration of AHLL 100–200 μg/mL.The as-prepared nanoparticle system was stable. Preliminary structural representation of HSF-AHLL and HSF-SA-AHLL was performed with transmission electron microscopy, which indicated that a uniform nano-system has been formed. The particle size and potential of the nanoparticles demonstrated the stability of the encapsulation system. Furthermore, AHLL in the nano-system could be well absorbed by the digestive system as revealed by the in vitro transport test uisng Caco-2 cell monolayer model. These results support that HSF-SA could be applied as a nanocarrier for maintaining the homeostasis of bioactive peptides and provide an effective way to improve the absorption of bioactive nutrients.Keywords: horse spleen apoferritin; angiotensin converting enzyme inhibitory peptide; sodium alginate; encapsulation;nanoparticle; absorption
收稿日期：2018-12-09基金项目：食品科学与技术国家重点实验室开放课题（SKLF-KF-201712）第一作者简介：夏伟荣（1995—）（ORCID: 0000-0001-8014-102X），女，硕士研究生，研究方向为水产品加工与贮藏。E-mail: 1152793869@qq.com*通信作者简介：李莹（1981—）（ORCID: 0000-0002-8964-2661），女，副研究员，博士，研究方向为食品营养与健康。E-mail: hijoly@163.com方旭波（1972—）（ORCID: 0000-0002-5469-4314），男，教授，博士，研究方向为水产加工与贮藏。E-mail: fxb70@163.comDOI:10.7506/spkx1002-6630-20181209-106中图分类号：TS254.9文献标志码：A文章编号：1002-6630（2020）08-0077-06引文格式：夏伟荣, 李莹, 柴智, 等. 铁蛋白-海藻酸钠纳米包埋ACE抑制肽. 食品科学, 2020, 41(8): 77-82. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181209-106. http://www.spkx.net.cnXIA Weirong, LI Ying, CHAI Zhi, et al. Encapsulation of ACE inhibitory peptide with ferritin-sodium alginate nanoparticles. Food Science, 2020, 41(8): 77-82. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181209-106. http://www.spkx.net.cn在这种供电方式下，信号源支持直流输入，通过直流电源为信号源供电。 在市电停电情况下，直流电源所带蓄电池为信号源供电。如图4所示。
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