3-甲基丁醛对奶酪坚果风味的贡献及其生物合成的研究进展
3-甲基丁醛对奶酪坚果风味的贡献及其生物合成的研究进展3-甲基丁醛对奶酪坚果风味的贡献及其生物合成的研究进展陈 臣1,2，周文雅1，袁佳杰1，于海燕1，田怀香1,*（1.上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418；2.扬州市扬大康源乳业有限公司，江苏 扬州 225004）摘 要：坚果风味是许多奶酪的特有风味，其中3-甲基丁醛对奶酪坚果风味有着重要的贡献。本文综述了3-甲基丁醛对奶酪坚果风味的影响，总结了3-甲基丁醛的生物合成途径、Strecker化学降解途径及奶酪中3-甲基丁醛含量的调控策略，并对将来的研究方向进行了展望，为开发适合中国消费者偏好、强化坚果味的奶酪产品提供理论依据。关键词：3-甲基丁醛；奶酪；坚果风味；代谢途径；调控策略奶酪又名干酪，是指以牛奶、奶油、部分脱脂乳、酪乳或这些产品的混合物为原料加入凝乳酶，乳蛋白质（主要是酪蛋白）凝固后，排除乳清，而制成的新鲜或发酵成熟的乳制品。近年来，随着人们健康意识及消费水平的提高，我国奶酪行业也呈现快速增长趋势，销售额年均增速近30%。但是从横向对比来看，我国目前奶酪人均年消费量仅有0.04 kg，仅为日韩的1/50，未来奶酪市场发展空间潜力巨大。尽管不同来源及品种的奶酪风味存在差异，但总地来说，奶酪的风味特征主要包括奶香味、坚果味、肉汤味、硫味、酸味、鲜味、苦味、乳清味、水果味、脂肪酸味等。在这些特征风味中，成熟奶酪产生的“坚果味”受到了国内外，特别是受到中国消费者的偏爱。研究表明，支链醛，如2-甲基丁醛、3-甲基丁醛和2-甲基丙醛，具有坚果/麦芽风味，是许多硬质和半硬质奶酪中的关键风味化合物。在这3 种化合物中，因3-甲基丁醛的平均风味阈值（在水溶液中为0.06 μg/mL）较另外两者低，对坚果风味贡献较大而备受关注。要打破僵化的审计模式，首先要提升审计结果的可利用性。过去我国商业银行在对业务专项的审计时通常只着眼于低级违规操作问题，不厌其烦地制作出程序化的报告，对避免问题重复发生起不到明显作用。优化内部审计模式，就要从宏观层面来考虑现有的规章制度和运营策略是否存在弊病，站在全行的高度来看问题，要将银行运作的整个流程都纳入视野之中，这样才能得出具有建树性的审计报告，从而得到管理者的重视，为以后的审计工作提供便利，形成良性循环。 支链醛，尤其是3-甲基丁醛能赋予奶酪坚果风味，所以总结3-甲基丁醛对奶酪的风味贡献及其生物合成研究进展，有助于阐明支链醛对于奶酪风味的贡献及奶酪坚果味的形成机制，对于开发并生产符合中国人口味的奶酪具有很大的意义。本文在查阅相关文献的基础上综述了3-甲基丁醛对奶酪坚果风味的贡献、生物合成途径及其合成的调控措施，并展望了在研究3-甲基丁醛过程中所出现的问题以及未来的研究热点。木地板的主要劣化问题包括表层污染、漆层脱落、木板条表层磨损、劈裂、受潮变形弯曲、缺失、基层支撑不足导致塌陷等(图10). 经过中考的分流，一部分学生将进入重点高中、普通高中，另一部分学生则进入职业学校，由于受到传统升学观念的影响，只有成绩较差的学生才会被迫选择中职学校，无法吸引优质生源一直是中职学校普遍存在的问题。近年来，中职院校面临前所未有的招生压力和生存问题，江苏省南通市中考报名人数从2011年开始逐年下降，如图1所示，2018年中考报名人数为4.9118万人，经历连续6年下降后首次出现增长。 1 3-甲基丁醛对奶酪风味的贡献表1 富含3-甲基丁醛的奶酪总结Table 1 A summary of cheeses rich in 3-methylbutanalhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=7d63ac2b15319daf0368804683c0c6e8/52022e3d9bf32bad63a1f4907167a85a.jpg&q=30 注：—.文献中未提及。奶酪类型 奶酪品种 风味 菌株/酵母 产地 参考文献硬质奶酪曼彻格奶酪 坚果、焙烤味 乳酸乳球菌 自制 切达奶酪 巧克力、麦芽、坚果味乳酸乳球菌乳酸种，乳酸乳球菌乳脂亚种 ─ 格鲁耶尔奶酪 麦芽味 ─ 瑞士 帕玛森奶酪 果香味 ─ ─ 半硬质奶酪 高达奶酪 烘焙味 ─ 美国、荷兰、芬兰、丹麦、新西兰 Proosdij型奶酪 类似于巧克力 乳酸乳球菌亚种 自制 软质奶酪 卡蒙贝尔奶酪 麦芽味 ─ 法国 国产奶酪奶豆腐 ─ ─ 内蒙古 奶疙瘩 ─ ─ 新疆阿勒泰 新疆酸凝奶酪 ─ 乳酸乳球菌和瑞士乳杆菌 自制
支链醛是许多奶酪产品的特征香气化合物（表1），其中3-甲基丁醛作为切达奶酪关键风味物质的研究已有诸多报道。早在2004年，Avsar等通过描述性感官分析与定量测定挥发性香气成分相结合的方法，确定了3 种支链醛（2-甲基丙醛、2-甲基丁醛和3-甲基丁醛）都是奶酪中产生坚果风味的主要化合物，其中3-甲基丁醛对坚果风味的贡献最大。Christensen等则利用分子蒸馏技术测定成熟3 年切达奶酪中的挥发性风味物质，通过香气抽提物稀释分析法发现3-甲基丁醛是成熟切达奶酪中的关键香气化合物。研究表明3-甲基丁醛在切达奶酪中的最适含量是73～210 μg/kg，在这个含量范围内其对奶酪的风味贡献是坚果味，而且是均衡、理想的风味。除切达奶酪以外，在许多硬质和半硬质奶酪中，如格鲁耶尔奶酪、蓝纹奶酪、帕玛森奶酪等，3-甲基丁醛都是重要的风味化合物。Jo等通过顶空固相微萃取和气相色谱-质谱的方法来分析高达奶酪的挥发性香气化合物，发现3-甲基丁醛是高达奶酪的关键挥发性香味化合物之一，适量的3-甲基丁醛能赋予高达奶酪类似巧克力的风味。Ayad等研究表明3-甲基丁醛在Proosdij型奶酪中也是一个主要风味化合物，呈现出类似巧克力的风味/坚果风味。3-甲基丁醛不仅在西式奶酪中普遍存在，在中国传统的一些奶酪中，3-甲基丁醛也对风味产生贡献。王蓓、马艳丽等发现3-甲基丁醛在中式酸凝奶酪，例如在奶疙瘩、奶豆腐中，对其风味也会产生一定的影响。此外，马杨在测定新疆酸凝奶酪在成熟过程中挥发性风味物质的变化时，检测到3-甲基丁醛的相对含量会随着奶酪成熟而增加。支链醛一般在奶酪成熟6～9 个月开始由氨基酸分解代谢产生，其含量随着奶酪成熟时间的延长而增加。Avsar等发现切达奶酪只有在成熟时间大于9 个月时，才会产生大量的3-甲基丁醛，Lazzi等发现Grana Padano奶酪在成熟过程中，3-甲基丁醛含量显著增加。Carunchia Whetstine等发现与未成熟奶酪相比，成熟奶酪中其他风味的存在（如硫味）会显著增强支链醛对坚果风味的贡献。尽管3-甲基丁醛被认为对奶酪风味有重要贡献，但这并不意味着其含量越高越好，Yvon和Smit等均发现当奶酪中支链醛的含量超过一定值时，可能会导致奶酪风味的不均衡，甚至产生令人不愉快的不良风味。因此，支链醛对奶酪风味的贡献仍需进一步研究来确定。2 3-甲基丁醛的合成途径奶酪中的3-甲基丁醛主要是由亮氨酸分解代谢产生的，包括两个途径：其一是亮氨酸在转氨酶等的作用下分解代谢生成3-甲基丁醛，此途径称之为生物合成途径；另一条途径是亮氨酸通过化学降解生成3-甲基丁醛，此途径称之为Strecker降解途径。由于Strecker降解途径需要在一定温度下进行，所以这一降解过程在奶酪中比较缓慢，奶酪中3-甲基丁醛的产生以生物合成途径为主，以Strecker途径为辅。与商业上旧企业的经营模式类似的“以用户体验为中心”是“互联网+”时代的公司必要的战略。网络时代的新企业能够运用网络特质，做出更人性化、界面友好而功能齐全的产品，吸引更多的用户进行体验，从而达到获得足够多用户流量的目的。这样的战略是旧企业无法做到的。 2.1 生物合成途径奶酪中3-甲基丁醛的生物合成途径见图1。首先，亮氨酸在氨基转移酶（aminotransferase，AT）的作用下将氨基转移给α-酮戊二酸产生α-酮异己酸和谷氨酸，其中α-酮异己酸是亮氨酸分解代谢的中心产物，谷氨酸在谷氨酸脱氢酶的作用下重新合成α-酮戊二酸作为氨基受体。生成的α-酮异己酸通过两种代谢途径产生3-甲基丁醛：1）直接途径，α-酮异己酸通过α-酮酸脱羧酶（α-ketoacid decarboxylase，KADC）的非氧化性脱羧作用产生3-甲基丁醛，例如已经被发现的乳酸乳球菌IFPL730（Lactococcus lactis IFPL730）和乳酸乳球菌乳脂亚种NIZO B1157，就是利用直接途径产生3-甲基丁醛；2）间接途径，α-酮异己酸在α-酮酸脱氢酶（α-ketoacid dehydrogenase，KADH）的作用下生成异戊酰辅酶A，进一步通过磷酸转移酶和酰基激酶生成异戊酸，最后在乙醛脱氢酶的作用下生成3-甲基丁醛。已经被证实的利用间接途径产3-甲基丁醛的菌有瑞士乳杆菌CNRZ 32（Lactobacillus helveticus CNRZ 32）和丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）。生成3-甲基丁醛的微生物包括乳酸菌，例如乳球菌属、乳杆菌属、链球菌属和肉食杆菌属，此外，一些酵母菌，例如汉斯德巴氏酵母、耶氏解脂酵母等作为附属发酵剂也会促进奶酪中3-甲基丁醛的产生。大部分微生物都是利用直接或者间接途径生成3-甲基丁醛，然而值得注意的是，法国洛林Afzal等发现麦芽肉杆菌LMA 28、Luo Jie等发现乳酸乳球菌乳酸亚种F9均可以同时通过直接途径和间接途径两种方式产生3-甲基丁醛。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=7d63ac2b15319daf0368804683c0c6e8/7c678a83fd2289c9df8657399c0a7df8.jpg&p=788x564&q=30 图1 3-甲基丁醛的生物合成机制[]
Fig. 1 Biosynthesis mechanism of 3-methylbutanal
2.2 化学降解途径（Strecker途径）从氨基酸到风味化合物的另一个重要化学反应是Strecker降解。通常，Strecker降解被描述为氨基酸的氨基与α-二羰基如还原糖的非酶、热诱导的反应，并且它是美拉德反应中的重要步骤。美拉德反应始于氨基与还原糖的缩合，形成所谓的Amadori产物。这种Amadori产物的重排可形成二羰基化合物。这种二羰基与氨基酸反应产生风味活性醛的过程称为Strecker降解。然而，在高温下，氨基酸的直接氧化脱羧也可产生相同的醛。这些反应在高温下尤其强烈，因此在很大程度上决定了烘焙产品的风味。在较低温度下，反应也会继续进行，例如在奶酪和啤酒生产的情况下。在亮氨酸存在的情况下，脱氨然后脱羧产生3-甲基丁醛，具体见图2，温度为主要控制参数，但底物浓度和底物特性也影响它们的转化率；早在1957年，Keeney等就已经假定这个反应可能会增加奶酪的风味，因为氨基酸和还原糖可以在合适的环境中获得，而且长时间的成熟条件，使反应得以进行。http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=7d63ac2b15319daf0368804683c0c6e8/d5617c56dc868c5d11ff8b2480f1699d.jpg&p=774x458&q=30 图2 亮氨酸的Strecker降解途径[]
Fig. 2 Strecker degradation pathway of leucine
3 调控3-甲基丁醛合成的研究进展鉴于3-甲基丁醛对奶酪风味的重要性，众多研究者提出了一些调控3-甲基丁醛生物合成的策略，主要包括以下几种。3.1 添加附属发酵剂通过将筛选到的乳酸乳球菌和工业菌种混合作为附属发酵剂进行切达的生产，3-甲基丁醛的含量可以显著提高300～400 倍；任发政教授团队将乳酸乳球菌乳酸亚种F9用于切达奶酪的生产，发现通过高浓度的菌种添加可以显著提高3-甲基丁醛的含量；将汉逊德巴利酵母D18335（Debaryomyces hansenii D18335）添加到奶酪生产过程中，检测到奶酪中3-甲基丁醛、2-甲基丁醛和2-甲基丙醛的含量都显著提高。此外，添加能够产生细菌素的菌株来诱导对细菌素敏感的发酵剂菌株发生裂解，使细胞内的酶释放出来，使其与底物反应，也可以增加3-甲基丁醛的含量。3.2 添加前体物或辅因子研究表明，通过添加3-甲基丁醛的前体物——亮氨酸，可以增加干酪凝乳中3-甲基丁醛的含量；添加5-磷酸吡哆醛时，转氨作用是氨基酸分解代谢的第一步，5-磷酸吡哆醛作为辅助因子用于催化转氨酶的反应，能够催化亮氨酸产生α-酮异己酸；添加α-酮戊二酸时，在没有外源添加α-酮戊二酸的情况下，奶酪中的氨基酸转氨作用相当有限，因为α-酮戊二酸对于氨基酸转氨过程来说是必须的。通过向奶酪凝乳中添加α-酮戊二酸可以原位刺激转氨作用，主要导致α-酮异己酸和α-羟基异己酸的含量增加，α-酮异己酸又进一步地反应生成3-甲基丁醛。van de Bunt等在只有亮氨酸和乳酸乳球菌B1157（L. lactis strain 1157）的溶液中加入α-酮戊二酸后，3-甲基丁醛含量显著增加。3.3 基因工程手段α-酮异己酸是亮氨酸分解代谢的中心物质，其除了可以通过直接和间接途径生成3-甲基丁醛之外，还可以在α-羟基酸脱氢酶的氢化作用下产生α-羟基异己酸。但是根据文献报道，α-羟基异己酸是一种几乎没有任何风味的化合物，所以使编码α-羟基酸脱氢酶的基因panE失活，会减少可用于脱羧和其他转化的α-酮异己酸的分解，以达到增加3-甲基丁醛含量的目的。在某种程度上讲，莫言的创作生涯可以分为前后两段：前期是童年体验的表达，后期是成人后的文学书写。《透明的红萝卜》中黑孩的生命经历代表着前期的童年莫言，看似木讷、孱弱的外表下，内心有着极其敏锐的感觉和超常的忍受痛苦的能力。他眼中的世界，是通过感官触角探索且内化于心的感觉混合。后期的文学书写，只是前期狂欢感觉和心灵记忆的文字记录，无论小说的故事背景如何切换，不管人物身份、角色如何设置，其生命的欲望表达和感觉的狂欢书都没有改变。 3.4 改变物理化学条件细胞外氧化还原电位或氧气对风味的形成也能够产生影响。通过增加溶解氧浓度或氧化剂，可以促进奶酪中所需醛/醇的形成，该调控方式已被许多研究证实。3.5 其他乳酸乳球菌处于支链氨基酸（如异亮氨酸）饥饿状态时，会导致3-甲基丁醛含量显著升高。支链氨基酸是全局调控因子CodY的效应分子，CodY通过与其结合，调控不同基因的转录，改变碳、氮代谢流的走向，帮助细胞适应营养匮乏的环境。研究发现，在乳酸乳球菌中，CodY蛋白的结合位点是一个15 bp的回文序（AATTTTCNGAAAATT），称为CodY-box，在乳酸乳球菌的KADC基因的启动子区域发现一个潜在的结合位点。以上研究表明，全局调控因子CodY在3-甲基丁醛的生物合成调控中可能发挥着重要作用，然而其具体机制尚不明晰。4 结 语目前，虽然国内外对支链醛尤其是3-甲基丁醛对奶酪的风味贡献及其生物合成有了一定的研究和了解，但仍然有许多问题有待解决。首先，香气化合物在食品中的贡献取决于多个因素：化合物的浓度、阈值、食品的基质以及不同化合物的相互作用。尽管不同研究已经表明：合适浓度的3-甲基丁醛在奶酪中会产生令愉快的坚果风味，但是3-甲基丁醛对奶酪风味影响因素的指标尚未确定，包括3-甲基丁醛在奶酪中的阈值、合适的浓度范围等。此外，Zhu Jiancai等通过研究茶中风味物质的协同作用，发现3 种支链醛由于相似的结构和香韵特征表现出显著的协同增效作用，然而这3 种支链醛之间，及其与其他化合物间对于奶酪坚果风味的协同作用鲜有研究。其次，尽管微生物生物合成3-甲基丁醛的两种途径已经明确，奶酪体系中哪种合成途径更加有效、奶酪不同成熟时期关键酶的表达如何变化、存在两种途径的微生物在两种途径的选择机制和分工配合关系如何等尚未完全揭示。近年来，基于多组学技术从多维度全面解析奶酪发生在微生物菌群、基因、蛋白、生化反应、风味产物等层次上的时序变化，并在此基础上进行特定微生物的筛选和应用为这些问题提供了全面的解决方案。这些问题的解决，对于如何选择合适的附属发酵剂、调控支链醛的合成非常重要。最后，如前所述，3-甲基丁醛一般在奶酪成熟6～9 个月开始产生，为了获得更佳的坚果味的口感，往往需要很长的成熟时间。这不仅增加了产品的生产周期和成本，也不利于标准化的生产。尽管不同的研究者通过各种方式调控3-甲基丁醛的生成，但目前效果仍不明显，一个可能的原因就是忽略了转录调控在其中发挥的重要作用。因而需要在前人的研究基础上，解析3-甲基丁醛的合成和调控机制，为通过生物手段调控3-甲基丁醛的合成奠定基础。随着人们营养健康意识的增强及西式快餐、烘焙食品的发展，喜欢奶酪的人会越来越多，奶酪将成为我国乳制品行业中最具成长潜力的品类之一。鉴于口味是消费者选择食品的重要因素，开发适合中国口味的奶酪便成为提高国内奶酪消费、促进国内奶酪产业发展的关键。因此，开发并生产强化坚果风味的奶酪具有很大的发展空间和潜力。3-甲基丁醛是奶酪成熟过程中产生的特征风味物质，对奶酪坚果风味的形成具有重要影响。因此，通过全面研究3-甲基丁醛对奶酪坚果风味的贡献，阐明支链醛对于奶酪风味的贡献及奶酪坚果味的形成机制，对于开发生产更适合我国消费者口味的奶酪，促进我国原制奶酪产业的转型和升级具有重要的意义。参考文献： 滕国新, 周伟明. 中国干酪及乳清制品的现状与产业化进程. 食品工业科技, 2000(1): 76-78. 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Recent Progress in Biosynthesis of 3-Methylbutanal and Its Contribution to Nutty Flavor in CheeseCHEN Chen1,2, ZHOU Wenya1, YUAN Jiajie1, YU Haiyan1, TIAN Huaixiang1,*(1. School of Perfume and Aroma Technology, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 201418, China;2. Yangda Kangyuan Dairy Co. Ltd., Yangzhou 225004, China)Abstract: Nutty fl avor is the unique fl avor of many cheeses, and 3-methylbutanal makes a key contribution to the nutty fl avor of cheese. In this article, the effects of 3-methylbutanal on the nutty fl avor of cheese are reviewed, the biosynthesis and Strecker degradation pathways of 3-methylbutanal are summarized and some strategies are highlighted to regulate the content of this particular fl avor compound in specific cheese types. Future research directions are presented as well. We expect that this review will provide a theoretical basis for the development of nutty-flavored cheese products that can cater to Chinese consumers’ preference.Keywords: 3-methylbutanal; cheese; nutty fl avor; metabolic pathways; control strategies
收稿日期：2019-04-01基金项目：国家自然科学基金面上项目（31771943；31972197）第一作者简介：陈臣（1982—）（ORCID: 0000-0002-4885-393X），男，副教授，博士，研究方向为食品发酵产香、食品风味技术。E-mail: chenchen@sit.edu.cn*通信作者简介：田怀香（1976—）（ORCID: 0000-0002-6097-809X），女，教授，博士，研究方向为食品风味化学。E-mail: tianhx@sit.edu.cnDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190401-001中图分类号：TS252.53文献标志码：A文章编号：1002-6630（2020）07-0228-06引文格式：陈臣, 周文雅, 袁佳杰, 等. 3-甲基丁醛对奶酪坚果风味的贡献及其生物合成的研究进展. 食品科学, 2020, 41(7):228-233. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190401-001. http://www.spkx.net.cnCHEN Chen, ZHOU Wenya, YUAN Jiajie, et al. Recent progress in biosynthesis of 3-methylbutanal and its contribution to nutty fl avor in cheese. Food Science, 2020, 41(7): 228-233. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190401-001. http://www.spkx.net.cn
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