产气荚膜梭菌实时荧光PCR和实时荧光RPA检测方法的建立和...
产气荚膜梭菌实时荧光PCR和实时荧光RPA检测方法的建立和比较产气荚膜梭菌实时荧光PCR和实时荧光RPA检测方法的建立和比较刘立兵1,2，李睿文3，陈志敏1，王金凤1，孙晓霞1,2，袁万哲3,*，王建昌1,2,*（1.石家庄海关，河北 石家庄 050051；2.河北省检验检疫科学技术研究院，河北 石家庄 050051；3.河北农业大学动物医学院，河北 保定 071001）摘 要：根据产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）高度保守的plc基因，设计特异性引物和探针，建立产气荚膜梭菌的实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）和实时荧光聚合酶重组酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）检测方法。特异性分析结果表明，建立的两种检测方法特异性强，仅对产气荚膜梭菌有特异性扩增，对其他细菌均无扩增；两种方法的检出限均为1.3 pg/μL。在人工污染模拟样品的检测中，两种方法的检出限均为1.0h102 CFU/mL；实时荧光RPA需要3～13 min即可实现对所有阳性样品的检测，而实时荧光PCR则需要24～46 min（Ct值为17.45～33.65）。实时荧光RPA方法在检测时间、操作方便性和仪器便携性方面，明显优于实时荧光PCR方法。本研究建立的实时荧光PCR和实时荧光RPA检测方法特异性强、灵敏性高、操作方便，为实验设备装备较差的基层检测实验室和疫情突发现场产气荚膜梭菌的快速检测提供有效技术手段。关键词：产气荚膜梭菌；plc基因；实时荧光聚合酶重组酶扩增；实时荧光聚合酶链式反应产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens），又称为魏氏梭菌（Clostridium welchii），是一种革兰氏阳性厌氧菌，也是一种人兽共患病病原体。根据产气荚膜梭菌分泌的α、β、ε、ι四种主要毒素，可以将之分为A、B、C、D和E型。不同型的产气荚膜梭菌可以导致不同的疾病，均具有发病急、死亡率高等特点。产气荚膜梭菌广泛分布在土壤、污水等自然环境中，引起的食物中毒事件在我国非常严重，摄入被产气荚膜梭菌污染的食物后，能够引起恶心、腹泻等临床症状，从而引发肌坏死性疾病；羔羊、仔猪、牛犊、雏鸡等动物感染产气荚膜梭菌，会导致坏死性肠炎、肠毒血症等疾病。产气荚膜梭菌污染给人类健康和畜牧业健康发展造成了巨大的危害，因此对产气荚膜梭菌的快速检测对于疫病防控和食品安全保障具有重要意义。目前，针对产气荚膜梭菌的传统检测方法主要有分离培养、细胞素方法、卵磷脂水解实验和反向间接乳凝胶结实验等，存在检测周期长、技术要求高、过程繁琐等不足。随着分子生物学技术的发展，一系列针对产气荚膜梭菌的新方法被建立并得到了广泛应用。孙佳芝等建立了灵敏度为4.57 μg/L的双抗夹心酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测方法；鲍长磊建立了产气荚膜梭菌不同毒素型多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）和α毒素抗体ELISA检测方法；石玉玲等根据16S rRNA基因建立了实时荧光PCR方法，灵敏度则为9h102 CFU/mL；刘哲等建立了特异性检测产气荚膜梭菌的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法，灵敏度为2.92h102 CFU/mL。ELISA方法检测灵敏度不高，试剂盒价格昂贵，且需要特异性设备；LAMP方法需要4～6 条引物，设计复杂，且极易造成假阳性结果。因此，建立一种反应快速、操作简便、灵敏性高的检测方法对于产气荚膜梭菌的有效控制依然具有重要意义。聚合酶重组酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）是一种等温扩增技术，主要依赖于重组酶、具有聚合链置换功能的DNA聚合酶、单链结合蛋白3 种核心蛋白实现对靶基因的等温扩增。在反应过程中，重组酶结合引物形成蛋白-DNA混合物并启动寻找模板DNA上的同源序列。同源序列定位后，则会引发链置换反应，引物结合到对应模板上，具有链置换功能的DNA聚合酶进而从引物3’末端开始启动DNA合成，实现对靶基因的指数级扩增。RPA能够在37～42 ℃恒温条件下20 min内完成对靶基因的有效扩增，特别适用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域，目前已经被广泛应用于多种食源性致病菌的快速检测。本研究根据编码A～E型产气荚膜梭菌α毒素的plc基因的高度保守区域，设计特异性引物和探针，建立实时荧光PCR和实时荧光RPA方法，并使用人工污染样品对两种方法进行验证和比较，以期为食品中产气荚膜梭菌的快速检测提供有效技术手段。1 材料与方法1.1 材料与试剂本实验所用菌种见表1。表1 实验菌株Table 1 Bacterial strains used in this studyhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=ba5bc3a84dc004baa2c1abd2ff3e7c4f/09b2693e136a2a0b70b0d188bf4e14ee.jpg&q=30 注：ATCC.美国模式菌种收集中心；CICC.中国工业微生物菌种保藏管理中心；CMCC.中国医学微生物菌种保藏管理中心；CVCC.中国工业微生物菌种保藏管理中心。菌种名称 菌株来源产气荚膜梭菌（C. perfringens） ATCC13124产气荚膜梭菌C型（C. perfringens） CVCC58产气荚膜梭菌D型（C. perfringens） CVCC81产气荚膜梭菌（C. perfringens） 本实验室分离产气荚膜梭菌（C. perfringens） 本实验室分离产气荚膜梭菌（C. perfringens） 本实验室分离产气荚膜梭菌（C. perfringens） 本实验室分离索氏梭菌（C. sordellii） CICC22950艰难梭菌（C. difficile） CICC22951双酶梭菌（C. bifermentans） CICC22952生孢梭菌（C. sporogenes） CICC22953拜氏梭菌（C. beijerinckii） CICC22954阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii） ATCC29544金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aurous） ATCC6538空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni） ATCC33291副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus） ATCC17802沙门氏菌（Salmonella） CICC22956蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus） CMCC63301单核细胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes） ATCC19114大肠埃希氏菌O157:H7 （Escherichia coli O157:H7） CICC21530宋氏志贺氏菌（Shifella sonnei） ATCC51592绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa） ATCC9027地衣芽孢杆菌（B. licheniformis） ATCC14580铜绿假单胞菌（P. aeruginosa） ATCC9027链球菌（Streptococcus） 本实验室分离铜绿假单胞杆菌（P. aeruginosa） 本实验室分离巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri） 本实验室分离
胰胨亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂、液体硫乙醇酸盐培养基、0.1%蛋白胨水 北京陆桥技术股份有限责任公司；细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；Premix Ex Taq 宝生物工程（大连）有限公司；TwistAmpTM exo kit 英国TwistDx公司。1.2 仪器与设备7 5 0 0实时荧光P C R仪 美国A B I公司；Genie III等温扩增荧光检测系统 英国OptiGene公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度计 美国Thermo Scientific公司。Transwell结果显示，在SW480细胞中过表达miR-454-3p后，细胞的侵袭生长能力得到了明显的促进，表现为在miR-454-3p mimics转染组中，有更多的SW480细胞穿过Transwell膜，在在阴性对照转染组，穿透的细胞数较少（图4），组间差异显著（P＜0.05）。 通过上述算法可得f(u3u4)=1, f(v3v4)≥6, f(ut-1ut)≥6且f(vt-1vt)>1(若f(vt-1vt)=1,则有得与n≥6时,k≥7矛盾于是满足H(1,n)的所有2度点的正常边染色,而且此染色算法是关于H(1,n)的所有2度点可区别边染色。 “先是要跟我打官司，没用，法院不管；现在又赖在我的房子里不走，还找我闹。我知道，这都没用。特别是那个小侄女罗丽，太厉害了，她吓唬我，唉，我真的有点怕。我知道大哥是警察，能帮帮我吗？” 1.3 方法1.3.1 引物设计参考GenBank中登录的产气荚膜梭菌plc基因（登录号：NC_008261.1），比对确定特异性保守序列，设计特异性引物和探针。所有引物探针均由生工生物工程（上海）有限公司合成，序列信息见表2。表2 实验所用引物及探针
Table 2 Primers and probes used in real-time RPA and real-time PCRhttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=ba5bc3a84dc004baa2c1abd2ff3e7c4f/c12411e732050e525bee7b617709ca70.jpg&q=30 方法 引物名称 序列（5’-3’） 长度/bp RPA-F TAGTTGGGATGATTGGGATTATGCAGCAAAGGT实时荧光RPA RPA-R CATGTAGTCATCTGTTCCAGCATCTTTCTCACC exo探针 AGCTAACTCTCAAAAAGGAACAGCGGGATATA (FAM-dT)(THF) (BHQ1-dT) ATAGATTCTTACACGA 3’ spacer 193 PCR-F TTGGAGAGGCTATGCACTATTTT实时荧光PCR PCR-R CTTAACATGTCCTGCGCTATCA TaqMan Probe FAM-CTCCATATCATCCTGCTAATGTTACTGCCG-BHQ1 89
1.3.2 基因组DNA的提取将产气荚膜梭菌（ATCC 13124）接种到液体硫乙醇酸盐培养基培养基中，37 ℃厌氧培养20 h。取纯培养菌液1 mL，加入到1.5 mL离心管中，11 500 r/min离心1 min，收集沉淀。采用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取，使用NanoDrop 2000 C超微量分光光度计测定浓度，-20 ℃保存备用。1.3.3 实时荧光RPA方法的建立以1.3.2节制备的产气荚膜梭菌DNA为模板，采用引物RPA-F/R和exo探针，使用TwistAmpTM exo kit配制实时RPA反应体系（50 μL）：RPA-F/R（10 μmol/L）各2.1 μL，exo探针（10 μmol/L）0.6 μL，Rehydration Buffer 29.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 12.2 μL，将其混匀，加入到装有冻干酶制剂的反应管中，吹吸至完全溶解，再加入2.5 μL 280 mmol/L MgAc，盖紧管盖，瞬时离心并涡旋后，放入Genie III中，39 ℃反应20 min。在扩增过程实时收集检测荧光信号，目的基因扩增后荧光信号会明显增加。1.3.4 实时荧光 PCR方法的建立以1.3.2节制备的产气荚膜梭菌DNA为模板，采用引物PCR-F/R和探针TaqMan Probe建立实时荧光PCR体系为（25 μL）：Premix Ex Taq 12.5 μL，PCR-F/R（10 μmol/L）各1.0 μL，PCR-Probe（10 μmol/L）1 μL，DNA模板1 μL，补水至25 μL。将上述体系充分振荡混匀后，瞬时离心，放入7500实时荧光PCR仪中，反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃延伸35 s，40 个循环，60 ℃收集荧光信号。1.3.5 特异性和灵敏度实验以表1所示菌株DNA为模板，根据1.3.3节和1.3.4节建立的方法进行检测，分析实时荧光RPA和实时荧光PCR方法的特异性。通报上个森林防火期全市森林防火工作情况，分析今冬明春森林防灭火形势，进一步明确市森防指各成员单位承担的森林防灭火工作职责，对下一步全市森林防灭火工作作出安排部署。 1)由图3和图4～图6对比可以看出静电喷雾比较于无静电喷雾时能够使采样点上的雾滴平均粒径明显减小，并且显著缩小了各个采样点上雾滴平均粒径之间的差距，特别是第2～4行和第0，7行之间雾滴平均粒径的差距，改善了雾滴平均粒径的分布状态。 提取1 mL纯培养产气荚膜梭菌的基因组DNA，并测定其浓度，进行10 倍倍比稀释，以不同稀释度的基因组DNA作为模板，根据1.3.3节和1.3.4节建立的方法进行检测，分析比较实时荧光RPA和实时荧光PCR方法的灵敏度。从对访谈的分析中笔者得出这样的结论：在目前中国的英语教学环境下，教师、学习内容和学习者个人的素质（包括性格、情商等）是三个阶段都存在的影响学习者英语学习效果的重要因素，如果这三个要素都积极发挥作用，则学习效果会好。教师在学生入门阶段的作用尤其重要，一名好的英语教师是学生顺利入门的关键。学习者个人的素质（包括性格、情商等）则在每个阶段都起着重要的作用，一个好的英语学习者不仅要有勤奋、刻苦的精神，还要有高的情商，即清楚地知道自己各个阶段应该怎么做才能取得进步。 1.3.6 对人工污染样品的检测比较使用经GB 4789.13ü2012《食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》检测确定不含产气荚膜梭菌的奶粉、鸡肉、牛肉和羊肉样品，分别取25 g加入到225 mL灭菌的0.1%蛋白胨水中，拍打均匀。取出9 mL样品均液，加入一定浓度的产气荚膜梭菌纯培养液，使之浓度为1.0h106 CFU/mL。拍打混匀，取1 mL人工污染产气荚膜梭菌的样品均液，用未污染产气荚膜梭菌的样品均液进行10 倍倍比稀释，每个稀释度分别取1 mL进行核酸提取，并以之作为模板分别通过实时荧光RPA和实时荧光PCR方法进行检测。同时取各个稀释的样品菌液按照GB 4789.13ü2012方法进行平板计数，将3 种方法的检测结果进行比较。2 结果与分析2.1 实时荧光RPA和实时荧光PCR方法的特异性通过建立的实时荧光RPA和实时荧光PCR方法，分别以产气荚膜梭菌基因组DNA和表1中的其他细菌基因组DNA为模板，进行特异性实验分析。表3表明，两种方法仅产气荚膜梭菌有特异性扩增曲线，而其他菌株均无扩增曲线。上述结果表明建立的实时荧光RPA和实时荧光PCR方法均具有良好的特异性。表3 实时荧光RPA和实时荧光PCR方法特异性分析
Table 3 Speci fi cities of real-time RPA and real-time PCR assayshttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=ba5bc3a84dc004baa2c1abd2ff3e7c4f/0586c1e1b6b32ba1741e89b4b915a04e.jpg&q=30 注：+.阳性；-.阴性。实时荧光PCR检测结果产气荚膜梭菌（C. perfringens） + +产气荚膜梭菌C型（C. perfringens） + +产气荚膜梭菌D型（C. perfringens） + +产气荚膜梭菌（C. perfringens） + +产气荚膜梭菌（C. perfringens） + +产气荚膜梭菌（C. perfringens） + +产气荚膜梭菌（C. perfringens） + +索氏梭菌（C. sordellii） - -艰难梭菌（C. difficile） - -双酶梭菌（C. bifermentans） - -生孢梭菌（C. sporogenes） - -拜氏梭菌（C. beijerinckii） - -阪崎肠杆菌（E. sakazakii） - -金黄色葡萄球菌（S. aurous） - -空肠弯曲杆菌（C. jejuni） - -副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus） - -沙门氏菌（Salmonella） - -蜡样芽孢杆菌（B. cereus） - -单核细胞性李斯特菌（L. monocytogenes） - -大肠埃希氏菌O157:H7（E. coli O157:H7） - -宋氏志贺氏菌（S. sonnei） - -绿脓杆菌（P. aeruginosa） - -地衣芽孢杆菌（B. licheniformis） - -铜绿假单胞菌（P. aeruginosa） - -链球菌（Streptococcus） - -铜绿假单胞杆菌（P. aeruginosa） - -巴氏葡萄球菌（S. pasteuri） - -菌种名称 实时荧光RPA检测结果
2.2 实时荧光RPA和实时荧光PCR的灵敏度http://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=ba5bc3a84dc004baa2c1abd2ff3e7c4f/d7b444e16b1a963c34e915945ba95213.jpg&p=750x714&q=30 图1 产气荚膜梭菌实时荧光RPA（A）和实时荧光PCR（B）方法的敏感性
Fig. 1 Sensitivities of real-time RPA (A) and real-time PCR (B) for C. perfringens detection
测定所提取的产气荚膜梭菌基因组D N A为1.3h105 pg/μL，将其10 倍倍比稀释至1.3h10-1 pg/μL，分别进行实时荧光RPA和实时荧光PCR检测。结果表明，实时荧光RPA和实时荧光PCR方法的检出限一致，均为1.3 pg/μL（图1）。2.3 人工污染样品检测结果对于人工污染产气荚膜梭菌的奶粉、鸡肉、牛肉和羊肉样品，每个稀释度取1 mL模拟污染液，提取核酸，分别进行实时荧光RPA和实时荧光PCR方法检测，与按照国家标准（GB 4789.13ü2012）的检测进行对比分析。结果表明，实时荧光RPA和实时荧光PCR方法的最低检出限均为1.0h102 CFU/mL，与标准GB 4789.13ü2012检测方法的灵敏度一致（表4）。实时荧光RPA能够在20 min内完成检测，仅需要3～13 min即可实现对所有阳性样品的检测，而实时荧光PCR完成整个反应则需要55 min左右，需要24～46 min（Ct值为17.45～33.65）实现对阳性样品的检测。实时荧光RPA方法在阳性样品的确认时间上明显优于实时荧光PCR方法，而在标准检测中，需要在36 ℃进行20～24 h的增菌，在检测时间方面较前两种方法更长。与此同时，一些地方也积极行动，通过知识产权保护来强化地区核心产业的竞争力。2016年，山东省制定出台《山东省重点领域百项关键核心技术知识产权认定方案》，愿景是到2020年末全省重点领域的关键核心技术知识产权达到100项左右，同时，加强了财政资金的支持力度，对列为重点领域关键核心技术知识产权项目给予每项100万元的扶持，用于成果的保护与转化。山东省内的大型和龙头企业众多，首批受益的关键核心技术知识产权保护的企业包括浪潮电子信息产业股份有限公司、山东鲁能智能技术有限公司、海尔集团公司、东阿阿胶集团有限责任公司等。 表4 人工污染样品检测结果
Table 4 Results of detection of artificially contaminated sampleshttp://rtt.5read.com/pdgpath/format?f=ba5bc3a84dc004baa2c1abd2ff3e7c4f/14dc015970d3ed49bea157bc2ee0de43.jpg&q=30 注：ü.阴性。样品 检测方法 污染量/（CFU/mL）1.0h 1061.0h 105 1.0h 1041.0h 1031.0h 102 1.0h 1011.0h 100奶粉实时荧光RPA法测定值/min 3.08 3.93 5.11 7.42 11.06 ü ü实时荧光PCR法Ct值 17.45 18.20 21.19 29.15 32.28 ü ü GB 4789.13ü 2012法测定值/CFU 9.6h 1058.9h 104 7.2h 1037.5h 1022.5h 101 ü ü鸡肉实时荧光RPA法测定值/min 3.04 4.08 5.78 7.33 12.78 ü ü实时荧光PCR法Ct值 18.21 20.34 24.47 28.32 33.65 ü ü GB 4789.13ü 2012法测定值/CFU 9.5h 1058.6h 104 7.3h 1036.8h 1029.7h 101 ü ü牛肉实时荧光RPA法测定值/min 3.25 3.80 5.53 7.83 10.92 ü ü实时荧光PCR法Ct值 17.44 19.55 23.27 28.45 33.78 ü ü GB 4789.13ü 2012法测定值/CFU 9.1h 1057.9h 104 6.8h 1037.5h 1027.9h 101 ü ü羊肉实时荧光RPA法测定值/min 3.50 3.93 5.40 7.80 11.70 ü ü实时荧光PCR法Ct值 18.03 19.89 23.46 29.22 34.10 ü ü GB 4789.13ü 2012法测定值/CFU 8.9h 1057.8h 104 6.5h 1036.9h 1028.7h 101 ü ü
3 讨 论食源性致病菌是影响食品安全的重要因素之一。由产气荚膜梭菌引起的食物中毒报道事件逐年上升，对人类的健康造成了严重影响。建立一种快速、特异、精准的产气荚膜梭菌检测方法，对人类的健康和畜牧业的发展有重要意义。本研究采用实时荧光RPA技术检测产气荚膜梭菌。实时荧光RPA反应是基于RPA反应体系中加入exo探针，扩增过程中产生的荧光信号通过荧光检测仪实现实时检测，作为一种等温扩增技术，它具有特异性强、灵敏性高、反应快速等优点，在细菌检测方面、病毒检测等方面应用广泛。实时荧光PCR是PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，通过标准曲线对未知模板进行分析的技术，该技术以其特异性强、灵敏度高等优点，在食源性致病菌检测、转基因产品检测，以及致病性钩端螺旋体和兔热病杆菌检测中都得到广泛的应用。plc基因编码的α毒素是产气荚膜梭菌的主要外毒素，存在于A～E型产气荚膜梭菌中，是导致畜禽坏死性肠炎、肠毒血症、气性坏疽等疾病的主要致死因素，其毒性最强，是国内外研究产气荚膜梭菌最多的毒素。本研究根据plc基因设计特异性的引物和探针，建立的实时荧光RPA和实时荧光PCR方法对产气荚膜梭菌具有很好的特异性，不同类型的标准株和分离株均得到了特异性扩增。对于人工污染样品，两种方法的最低检出限均为1.0h102 CFU/g，但实时荧光RPA方法的检测时间（20 min）明显少于实时荧光PCR方法（55 min），极大地缩短了实际样品的检测周期，更适合于实际样品的快速检测。本研究使用Genie III实时荧光RPA运行设备，大小为25 cmh16.5 cmh8.5 cm，质量仅为1.75 kg左右，具有体积小、便携式的特点，而且适用锂电池充电工作，可以维持设备24 h的运行，非常适合实验设备相对落后的基层检测部门，以及食源性疫情的现场检测，为产气荚膜梭菌的快速现场诊断提供了有效的技术手段。参考文献： GARCIA J P, BEINGESSER J, FISHER D J, et al. The effect of Clostridium perfringens type C strain CN3685 and its isogenic beta toxin null mutant in goats. Veterinary Microbiology, 2012, 157(3/4):412-419. DOI:10.1016/j.vetmic.2012.01.005. 李伟杰, 于建慧, 魏财文, 等. 产气荚膜梭菌毒素型菌落多重PCR方法的建立及应用. 西北农业学报, 2016, 25(6): 823-827. RADHIKA B, KUMAR N V, SREENIVASULU D. Detection of Clostridium perfringens alpha toxin gene in lambs by loop mediated isothermal amplification. Veter Inary World, 2016, 9(1): 60-64.DOI:10.14202/vetworld.2016.60-64. 赵凤菊, 关淼, 李井春, 等. 产气荚膜梭菌毒素基因分型PCR检测方法的建立及初步应用. 动物医学进展, 2017, 38(3): 59-63. SHREYA D, UPPALAPATI S R, KINGSTON J J, et al. Immunization with recombinant bivalent chimera r-Cpae confers protection against alpha toxin and enterotoxin of Clostridium perfringens type A in murine model. Molecular Immunology, 2015, 65(1): 51-57.DOI:10.1016/j.molimm.2015.01.005. LOW L Y, HARRISON P F, LIN Y H, et al. RNA-seq analysis of virR and revR mutants of Clostridium perfringens. BMC Genomics,2016, 17(1): 391-421. DOI:10.1186/s12864-016-2706-2. WATSON G N. The assessment and application of a bacteriocin typing scheme for Clostridium perfringens. Journal of Hygiene, 1985,94(1): 69-79. DOI:10.1017/s0022172400061143. 陈兴祥, 薛家宾, 黄克和, 等. A型产气荚膜梭菌α毒素的提纯试验. 畜牧与兽医, 2002, 34(3): 26-27. DOI:10.3969/j.issn.0529-5130.2002.03.012. STRINGER M F, TURNBULL P C B, GILBERT R J. Application of serological typing to the investigation of outbreaks of Clostridium perfringens food poisoning, 1970-1978. Journal of Hygiene, 1980,84(3): 443-456. DOI:10.1017/s002217240002698x. 孙佳芝, 王新桐, 刘雪慧, 等. 产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用. 中国兽医学报, 2014, 34(6): 930-935. 鲍长磊. 产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR和α毒素抗体ELISA检测方法的建立及初步应用. 杨凌: 西北农林科技大学, 2016. 石玉玲, 曾兰兰, 陈丽丹, 等. 产气荚膜梭菌实时荧光PCR方法的建立. 生物技术通讯, 2010, 21(3): 389-392. DOI:10.3969/j.issn.1009-0002.2010.03.021. 刘哲, 马晓燕, 张会彦, 等. 环介导等温扩增技术快速检测产气荚膜梭菌的研究. 中国食品学报, 2012, 12(4): 168-174. DOI:10.3969/j.issn.1009-7848.2012.04.025. TORRES C, VITALIS E A, BAKER B R, et al. LAVA: an opensource approach to designing LAMP (loop-mediated isothermal amplification) DNA signatures. BMC Bioinformatics, 2011, 12(1):1-7. DOI:10.1186/1471-2105-12-240. PIEPENBURG O, WILLIAMS C H, STEMPLE D L, et al. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology, 2006, 4(7):1115-1121. DOI:10.1371/journal.pbio.0040204. 刘立兵, 南汇珠, 孙晓霞, 等. 食品中蜡样芽胞杆菌实时荧光RPA检测方法的建立与应用. 食品科学技术学报, 2018, 36(1): 89-94.DOI:10.3969/j.issn.2095-6002.2018.01.012. LIU H B, ZANG Y X, DU X J, et al. Development of an isothermal amplification-based assay for the rapid visual detection of Salmonella bacteria. Journal of Dairy Science, 2017, 100(9): 7016-7025.DOI:10.3168/jds.2017-12566. YANG H, WEI S, GOONERATNE R, et al. Development of a recombinase polymerase amplification assay for Vibrio parahaemolyticus detection with an internal amplification control. Canadian Journal of Microbiology, 2018, 64(4): 223-230.DOI:10.1139/cjm-2017-0504. SAKAI K, TRABASSO P, MORETTI M L, et al. Identification of fungal pathogens by visible microarray system in combination with isothermal gene amplification. Mycopathologia, 2014, 178(1/2): 11-26. DOI:10.1007/s11046-014-9756-2. WANG J C, YUAN W Z, HAN Q A, et al. Reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for the rapid detection of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus.Journal of Virological Methods, 2017, 243: 55-60. DOI:10.1016/j.jviromet.2017.01.017. WANG J C, WANG J C, LIU L B, et al. Development of a real-time recombinase polymerase amplification assay for rapid and sensitive detection of porcine circovirus 2. Archives of Virology, 2017,162(8): 2293-2296. DOI:10.1007/s00705-017-3368-3. BOYLE D S, MCNERNEY R, TENG L H, et al. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis by recombinase polymerase amplification. PLoS ONE, 2014, 9(8): e103091. DOI:10.1371/journal.pone.0103091. BOYLE D S, LEHMAN D A, LORRAINE L, et al. Rapid detection of HIV-1 proviral DNA for early infant diagnosis using recombinase polymerase amplification. Mbio, 2013, 4(2): 49-52. DOI:10.1128/mbio.00135-13. 王建昌, 王金凤, 段永生, 等. 基于内参的大肠埃希氏菌O157:H7实时荧光定量PCR快速检测方法的建立. 食品科学, 2015, 36(20):226-231. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201520044. 张惟材. 实时荧光定量PCR. 北京: 化学工业出版社, 2013. 邓婷婷, 黄文胜, 程奇, 等. 重组酶聚合酶扩增技术检测转基因水稻中的Cry1Ab/c基因. 中国食品学报, 2015, 15(3): 187-193. AHMED A, LINDEN H V D, HARTSKEERL R A. Development of a recombinase polymerase amplification assay for the detection of pathogenic leptospir. International Journal of Environmental Research & Public Health, 2014, 11(5): 4953-4964. DOI:10.3390/ijerph110504953. EULER M, WANG Y, OTTO P, et al. Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of Francisella tularensis.Journal of Clinical Microbiology, 2012, 50(7): 2234-2238.DOI:10.1128/JCM.06504-11. NAGPAL R, OGATA K, TSUJI H, et al. Sensitive quantification of Clostridium perfringens in human feces by quantitative real-time PCR targeting alpha-toxin and enterotoxin genes. BMC Microbiology,2015, 15(1): 219-230. DOI:10.1186/s12866-015-0561-y. 郑晓星, 解真真, 任晓峰, 等. 产气荚膜梭菌plc基因的原核表达及其多克隆抗体的制备. 中国兽医科学, 2012(10): 1048-1052.
Development and Comparison of Real-Time Polymerase Chain Reaction and Real-Time Recombinase Polymerase Amplification Assays for Detection of Clostridium perfringens in FoodLIU Libing1,2, LI Ruiwen3, CHEN Zhimin1, WANG Jinfeng1, SUN Xiaoxia1,2, YUAN Wanzhe3,*, WANG Jianchang1,2,*
(1. Shijiazhuang Customs Distract, Shijiazhuang 050051, China;2. Hebei Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine, Shijiazhuang 050051, China;3. College of Veterinary Medicine, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)Abstract: To develop a rapid detection method for Clostridium perfringens using real-time polymerase chain reaction(PCR) or real-time recombinase polymerase amplification (RPA), we designed specific primers and probe based on the conserved sequence of the plc gene of C. perfringens. The results of specificity analysis showed that the two established methods specifically detected C. perfringens but not other bacteria. The sensitivity of both methods was 1.3 pg/μL and the limit of detection for C. perfringens in artificially contaminated chicken and milk samples was 1.0 × 102 CFU/mL. The positive samples could be detected in 3–13 min by real-time RPA, and at least 24–46 min by realtime PCR (Ct = 17.45–33.65). Real-time RPA was better than real-time PCR with respect to analysis time, easiness of operation and portability. In conclusion, thanks to their high specificity and sensitivity and easy operation, real-time RPA and real-time PCR provided an effective technical approach for the rapid detection of C. perfringens.Keywords: Clostridium perfringens; plc gene; real-time recombinase polymerase amplification; real-time polymerase chain reaction
收稿日期：2018-10-26基金项目：国家质检总局科技计划项目（2016IK107）；河北省高校百名优秀创新人才支持计划项目（SLRC2017039）；河北省现代农业产业技术体系羊产业创新团队项目（HBCT2018140204）第一作者简介：刘立兵（1986ü）（ORCID: 0000-0001-6690-0472），男，兽医师，硕士，研究方向为食源性致病菌、动物源性食品掺假的分子生物学检测。E-mail: bing521564@163.com*通信作者简介：袁万哲（1978ü）（ORCID: 0000-0002-2663-5368），男，教授，博士，研究方向为动物疫病的检测和致病机理。E-mail: yuanwanzhe@126.com王建昌（1981ü）（ORCID: 0000-0003-0921-0218），男，高级兽医师，博士，研究方向为食源性致病菌、动物源性食品掺假的分子生物学检测。E-mail: jianchangwang1225@126.comDOI:10.7506/spkx1002-6630-20181026-307中图分类号：R155.5；Q93.3文献标志码：A文章编号：1002-6630（2020）04-0268-05引文格式：刘立兵, 李睿文, 陈志敏, 等. 产气荚膜梭菌实时荧光PCR和实时荧光RPA检测方法的建立和比较. 食品科学, 2020,41(4): 268-272. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181026-307. http://www.spkx.net.cnLIU Libing, LI Ruiwen, CHEN Zhimin, et al. Development and comparison of real-time polymerase chain reaction and real-time recombinase polymerase amplification assays for detection of Clostridium perfringens in food. Food Science, 2020, 41(4):268-272. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181026-307. http://www.spkx.net.cn顶岗实习由学生、学校、企业三方共同参与，具有管理主体多元化、实习地点分散化、实习内容多样化的特点，因此学校和企业应建立起有效的实习管理机构实行共同管理。学校应健全和完善学院党委统一领导、相关部门统筹安排、全校紧密配合，各系党总支贯彻落实的实习工作机制，细化各部门在学生顶岗实习阶段思想政治教育工作中的职责和任务。企业要健全基层党组织。针对学生半年以上时间在企业和生产一线实习实训的实际情况，应在学生实习较多的地方设立临时党小组和团支部，切实加强学生党小组建设，使学生党员不论流动到哪里，都能接受党组织的教育管理。
页:
[1]