树体遮光对采收期‘赤霞珠’葡萄果实花色苷类物质积累...
树体遮光对采收期‘赤霞珠’葡萄果实花色苷类物质积累的影响张珍珍，李 倩，董 荣，乔 丹，闫 雪，张 轲
（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）
摘 要：以酿酒葡萄‘赤霞珠’为试材，在开始转色-完全成熟及100%转色-完全成熟2 个生长期分别采用50%、20%遮光的遮阳网对果树树体顶端进行遮光处理，以正常生长果实为空白对照。利用高效液相色谱-质谱法检测达到成熟时葡萄果皮花色苷含量，分析不同生长时期、不同遮光程度的遮阳网遮光处理后浆果到达成熟时花色苷组分及含量的差异。实验结果表明：开始转色-完全成熟采用20%遮光的遮阳网处理的样品中检测到15 种花色苷，而其余4 种处理检测到14 种花色苷，未检测到3’-甲基花青素香豆酰化葡萄糖苷（顺式+反式）。不同遮光处理后其花色苷总量均高于对照，而甲基化花色苷仍为主要花色苷，其中100%转色-完全成熟期间采用50%遮光的遮阳网处理，显著提高了样品中甲基化花色苷含量。经过不同遮光处理后花色苷组分构成均有改变：在开始转色-完全成熟期间采用20%遮光的遮阳网进行遮光，明显提高了香豆酰化修饰花色苷及乙酰化修饰花色苷含量；100%转色-完全成熟期间的遮光显著提高了乙酰化修饰花色苷含量。4 种遮光处理均使花翠素香豆酰化葡萄糖苷（顺式+反式）含量显著降低。开始转色-完全成熟期间主要增加了3’-甲基花青素乙酰化葡萄糖苷所占总花色苷的比例，100%转色-完全成熟期间花青素葡萄糖苷、3’-甲基花青素葡萄糖苷所占总花色苷的比例显著低于对照组。
关键词：‘赤霞珠’；遮光处理；花色苷；偏最小二乘-判别分析
花色苷类是葡萄与葡萄酒中一类重要的酚类化合物，它是赋予葡萄与葡萄酒颜色的主要物质。花色苷是一种存在于所有植物中的水溶性色素，单体花色苷极不稳定，很容易被外界环境影响而分解，且花色苷的组成及含量会受到环境的影响，比如光照、温度以及水分等。花色素作为糖苷配基或乙酰化的糖苷配基与糖相结合生成花色苷，主要有甲基化、酰化以及糖基化等，这些修饰组分对花色苷的稳定性有极为重要的影响。经过酰基化修饰的花色苷不仅可以促进花色苷颜色的稳定，还可加深葡萄酒的颜色。红色酿酒葡萄果实中主要有五大类花色苷，分别为花青素、花翠素、甲基花青素、甲基花翠素以及二甲花翠素。
新疆葡萄酒存在的普遍问题是颜色不稳定，而花色苷是葡萄酒及果实的主要呈色物质。浆果的花色苷不仅受到其基因型的影响，光照、气候、栽培条件也是主要因素。研究发现，光照条件会直接影响花色苷的合成，并且光照强度是影响葡萄果实着色的重要原因之一。目前主要通过遮光盒、摘叶、铺反光膜等措施研究颜色的变化。有研究表明，遮阳网应用于鲜食葡萄栽培中可调节葡萄成熟期，而且影响果实大小、糖酸等。其中遮光处理对葡萄果实中的单宁影响最大，其次为总花色苷；也有通过遮光网对葡萄果实进行处理，得出此类处理方法可以有效延长采收期，并且提高总酚、总单宁含量；同时遮光会影响果实成熟期的光合作用，进而影响果实糖类代谢中相关酶基因的表达。新疆昼夜温差大，光照时间长且光照强，光照会影响果实中花色苷的合成，目前探究‘赤霞珠’果实中花色苷在累积过程中不同生长时期以及不同遮光率的遮光对其花色苷含量的累积以及组分构成改变的研究较少。因此本实验探究不同光照强度及不同生长时期遮光对葡萄果实花色苷生成及积累的影响，以期为有效提高果皮中稳定的花色苷含量及稳定的修饰组分并改善西部产区葡萄酒色泽稳定性提供理论依据。本研究以‘赤霞珠’为试材，分别选取浆果达到开始转色-完全成熟以及100%转色-完全成熟阶段，采取不同遮光率的遮阳网对树体顶端进行遮光处理。利用高效液相色谱-质谱联用方法检测4 个不同遮光处理后对成熟‘赤霞珠’的花色苷组分及含量的影响，通过偏最小二乘-判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）法对4 种处理后成熟的葡萄果实中花色苷含量进行差异分析。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
供试葡萄果实采于2017年玛纳斯县中信国安葡萄酒业有限公司葡萄种植基地种植的酿酒葡萄‘赤霞珠’。
黑色单层遮阳网，网1：三针加密型；网2：两针普通型。遮阳网的规格为1.5 mh45 m。设置5 种处理：CK为正常生长，不遮光；Q1为开始转色-完全成熟期间采用网1对树体顶端进行遮光（7月27日—9月16日）；Q2为开始转色-完全成熟期间采用网2对树体顶端进行遮光（7月27日—9月16日）；H1为100%转色-完全成熟期间采用网1对树体顶端进行遮光（8月7日—9月12日）；H2为100%转色-完全成熟期间采用网2对树体顶端进行遮光（8月7日—9月12日）；4 种处理均为单一实验。每个处理均有3 个生物学平行。
甲醇、乙腈、甲酸和乙酸（均为色谱纯） 美国Fisher公司；乙酸乙酯（分析纯） 北京化学试剂公司；纯净水 杭州娃哈哈公司；二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷标准品 法国Extrasynthese公司；去离子水由Milli-Q（Molopore, Bedford, MA）系统制备。
1.2 仪器与设备
HZS-H型水浴振荡器 武汉爱斯佩科学仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；FD-1D-50冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；LC/MSD离子阱液相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；HOBO H21-002小型气象站（探头为S-LIA-M003和S-THB-M002） 美国Onset Corporation公司；PAL-2手持式糖度计 日本ATAGO公司；便携式pH计 瑞士Metler Toledo公司。
1.3 方法
1.3.1 样品采集
本实验检测的样品为所有葡萄果实糖度达到26.00 °Brix左右，所摘果实均果粒饱满，大小均匀，采摘时兼顾阴面与阳面，每穗果实的顶、中、尾部均兼顾。随机选择果实300 颗，采回实验室用液氮迅速冷冻，将样品置于-80 ℃保存，用于其他检测。空白对照的样品采摘于9月12日；开始转色-完全成熟的遮光处理中，样品采摘日期为9月16日；100%转色-完全成熟的处理中，所摘样品日期为9月12日。由此可看出，在开始转色-完全成熟期间进行遮光处理，在生长时期上明显延缓了果实成熟4～5 d。
1.3.2 气象数据收集
监测网1、网2的遮光处理与对照之间的果际微气候差异。收集数据包括大气温度、相对湿度、太阳总辐射和光合有效辐射，每5 min进行一次数据采集。
1.3.3 理化指标检测
可溶性固形物、可滴定酸含量以及pH值在运回实验室后立即测定。从每组新鲜果实样品中随机取出50 粒，采用组织捣碎机匀浆，采取手持式糖度计测定可溶性固形物定，可滴定酸含量以酸碱滴定法（以酒石酸计）测量，每个样品做2 组技术平行。采用便携式pH计检测果实中的pH值。
1.3.4 葡萄皮花色苷定性定量分析检测
花色苷的提取：参考张珍珍等的方法。
花色苷的定量与定性：建立5～500 mg/L之间、9 个水平、3 个重复的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷标准曲线，相关系数应在0.999以上，作二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的外标定量，其他花色苷以相当于二甲花翠素-3-葡萄糖苷含量计。
花色苷定性工作基于中国农业大学葡萄酒研究中心建立的“葡萄与葡萄酒花色苷HPLC-UV-MS/MS指纹谱库”的基础上，结合文献报道，通过对样品图谱中质谱信息、光谱信息和保留时间与谱库及文献报道比对分析从而确定各样品中各花色苷的种类与结构。
花色苷通过标准曲线计算后，再转化单位为mg/g。
参考杨晓慧等的方法，采用高效液相色谱-质谱检测酚类物质。
1.4 数据处理
采用Microsoft Excel 2003软件进行数据计算。利用SPSS 17.0统计软件对数据进行显著性差异分析，通过Origin Pro 8.5进行绘图。PLS-DA通过代谢组学数据分析网站http://www.metaboanalyst.ca/完成。
2 结果与分析
2.1 遮光处理对果际微气候的影响
图1 树体遮光对果际微气候的影响
Fig. 1 Effects of shading treatment on inter-regional microclimate
如图1所示，葡萄果穗周边光合有效辐射和太阳总辐射与CK相比明显降低，网1使果穗附近接受光合有效辐射的量降低了50%左右，网2使果穗附近接受光合有效辐射的量降低了20%左右。遮光处理在有效减弱光照的同时并没有明显改变果际周围的温度和相对湿度。由此说明，本实验中的遮光处理主要减弱了果际的光照条件，且其他生理环境状态对果实无影响。
2.2 遮光处理对成熟时‘赤霞珠’果实中可滴定酸含量、pH值的影响
表1 遮光处理对果实中可滴定酸、pH值的影响
Table 1 Effect of different shading treatments on titratable acid and pH in grapes
由表1可看出，采用不同时期、不同遮光率的遮阳网对树体遮光，当果实均达到同一糖度时，可滴定酸含量与对照无明显差异，而不同遮光强度、不同时期遮光对果实中的pH值均无明显影响。
2.3 遮光处理对成熟时‘赤霞珠’果实中花色苷含量的影响
图2 正常生长果皮色谱鉴定
Fig. 2 Chromatographic identification of anthocyanins in grape peels under normal growth conditions
图3 遮光处理后葡萄果皮中花色苷总量
Fig. 3 Total amounts of anthocyanins in grape skins with different shading treatments
如图2所示，开始转色-完全成熟采用20%遮光（Q2）的遮阳网处理的样品中检测到15 种花色苷，而其余4 种处理检测到14 种花色苷，未检测到3’-甲基花青素香豆酰化葡萄糖苷（顺式+反式）。由图3可知，CK果实中其果皮花色苷含量为12.544 mg/g。而经过遮光处理后，果皮中的花色苷含量均高于CK，开始转色-完全成熟时期以及100%转色-完全成熟时期采用网2遮光使果皮中花色苷含量呈显著增加（P＜0.05），而100%转色-完全成熟期间采用网1遮光后，其花色苷总量为15.858 mg/g，高于CK26.43%，呈极显著增加（P＜0.01）。说明适当的遮光均可以提高花色苷含量，且100%转色-完全成熟期间采用50%遮光的遮阳网进行树体遮光对果皮中花色苷的累积有更为显著的效果。
2.4 遮光处理对成熟时‘赤霞珠’果实中甲基化和未甲基化花色苷的比较
图4 遮光处理后对葡萄果皮中甲基化、未甲基化花色苷含量的影响
Fig. 4 Effect of different shading treatments on methylation and unmethylated anthocyanin contents in grape skins
如图4所示，甲基化花色苷仍为主要花色苷。遮光处理后果皮中甲基化花色苷含量均高于CK。未经光处理的样品中，其甲基化花色苷含量为11.640 mg/g。Q2、H2处理后，检测到果皮中甲基化花色苷含量分别为12.590 mg/g和12.536 mg/g，均呈显著性增加（P＜0.05）。H1处理后检测到采收期时果实的甲基化花色苷含量为13.850 mg/g，相比CK增加了25.29%，呈极显著差异（P＜0.01）。综上所述，适当的遮光均会增加果皮中甲基化花色苷含量，开始转色-完全成熟、100%转色-完全成熟期间采用20%遮光的遮阳网以及100%转色-完全成熟期间采用50%遮光的遮阳网均能使果皮中积累更多的甲基化花色苷。
2.5 遮光处理对‘赤霞珠’果实中不同修饰组分的影响
图5 遮光处理对不同结构修饰组分的影响
Fig. 5 Effect of different shading treatments on the content of anthocyanins with different structural modifiers
采取不同遮光处理对不同修饰组分花色苷的累积的影响均有明显效果。如图5所示，这3 种修饰方式的花色苷含量大小为未酰化修饰花色苷＞乙酰化修饰花色苷＞香豆酰化修饰花色苷。
乙酰化修饰花色苷含量也因遮阳网的遮光率及遮光时间的不同而有差异性。CK样品中乙酰化修饰花色苷含量为4.378 mg/g，遮光处理后样品中乙酰化修饰花色苷含量均高于CK。Q2处理后其乙酰化花色苷含量为4.971 mg/g，呈显著性增加（P＜0.05）。而H1、H2处理后其乙酰化修饰花色苷含量分别为5.768 mg/g和5.235 mg/g，相比CK分别增加了31.74%、19.57%，均呈极显著差异（P＜0.01）。说明本实验中100%转色-完全成熟期间的遮光处理能使果实中积累更多的乙酰化修饰花色苷。CK中的香豆酰化修饰花色苷含量为0.883 mg/g，遮光样品中其香豆酰化修饰花色苷含量高于CK，Q2与CK相比该修饰组分增加了33.64%，呈显著增加（P＜0.05）。这也说明开始转色-完全成熟期间的遮光使香豆酰化修饰花色苷累积更明显，综合来看，在开始转色-完全成熟期间采用20%遮光的遮阳网以及100%转色-完全成熟期间遮光能使果实中积累更多的酰基化修饰的花色苷，这对提高光照时间长、气候炎热地区的葡萄酒颜色的稳定性具有重要意义。
2.6 遮光处理对成熟时果实中花色苷组分构成的影响
图6 PLS-DA不同遮光处理对花色苷组分的影响
Fig. 6 PLS-DA analysis of the effect of different shading treatments on anthocyanin components
为更直观表明不同遮光处理对果实到达成熟时之间花色苷含量及组分之间的差异，进行PLS-DA。由图6A可知，CK处理与其他遮光处理明显分开，说明遮光方式以及遮光时间的不同对各类花色苷的含量和组分构成均有影响。且100%转色后-完全成熟对果实进行遮光处理均在X轴负半轴，开始转色时对果实进行遮光处理均分布在X轴正半轴。说明不同时期的遮光处理有效改变了花色苷的组成成分。图6B表明，经过不同遮光处理后，以下7 种物质对改变花色苷组分的贡献率较大（贡献值＞1）。分别为3’-甲基花青素乙酰化葡萄糖苷、花青素香豆酰化葡萄糖苷（顺式+反式）、二甲花翠素香豆酰化葡萄糖苷（顺式+反式）、花青素葡萄糖苷、花翠素香豆酰化葡萄糖苷（顺式+反式）、3’-甲基花青素葡萄糖苷、花青素乙酰化葡萄糖苷。
表2 遮光处理后有较大贡献率物质占花色苷比例
Table 2 Proportions of anthocyanins with higher contribution rate in grape skins with different shading treatments%
由表2可知，开始转色-完全成熟期间进行遮光处理（Q1、Q2），均增加了花青素乙酰化葡萄糖苷、花青素葡萄糖苷、花青素香豆酰化葡萄糖苷（顺式+反式）、二甲花翠素香豆酰化葡萄糖苷（顺式+反式）、3’-甲基花青素乙酰化葡萄糖苷、3’-甲基花青素葡萄糖苷含量，且在此期间，采用50%遮光的遮阳网为实验材料，使样品中的花青素乙酰化葡萄糖苷、花青素葡萄糖苷、3’-甲基花青素乙酰化葡萄糖苷明显增加；采用20%遮光的遮阳网进行遮光，使花青素香豆酰化葡萄糖苷（顺式+反式）、3’-甲基花青素乙酰化葡萄糖苷所占总花色苷的比例与CK相比呈极显著增加（P＜0.01）。当果实处于100%转色-完全成熟期间，均降低了花青素葡萄糖苷、花翠素香豆酰化葡萄糖苷（顺式+反式）、3’-甲基花青素葡萄糖苷所占总花色苷的比例。总的来说，本实验中4 种遮光处理均使花翠素香豆酰化葡萄糖苷（顺式+反式）含量显著降低。开始转色-完全成熟期间主要增加了3’-甲基花青素乙酰化葡萄糖苷所占总花色苷的比例，100%转色-完全成熟期间花青素葡萄糖苷、3’-甲基花青素葡萄糖苷所占总花色苷的比例显著低于CK。
3 讨论与结论
采用黑色遮阳网能有效改善田间气候，降低光照强度。由本实验微气候数据可以得出，遮光主要改变果际光照强度，而对果际周围温度和湿度几乎无影响，原因是在实验中采用单层黑色遮阳网，能有效减少正午时刻的光照直射。本实验中，通过不同时期遮光、不同遮光率的遮阳网对果实的pH值、总酸无明显影响，通过对实验样品进行理化数据检测，可以看出在开始转色-完全成熟期间的遮光处理明显延缓了‘赤霞珠’果实的生长期4～5 d。
研究发现遮光处理对花色苷的累积并无明显影响，而另有研究报道高强度的光照导致花色苷含量降低。有研究表明，花色苷浓度会随光照的增加而增加，本实验中，开始转色-完全成熟期间采用遮光率为50%的遮阳网处理后使样品中的花色苷含量低于遮光率为20%遮阳网处理的样品，这与黄敬寒等的研究结果相同。但光照对于花色苷的影响并不相同，100%转色-完全成熟期间的遮光中，遮光程度越强，花色苷的累积量越高，这是由于遮光时期也是影响花色苷累积的影响因素之一。
有学者研究发现，经过遮光处理后，果皮中的花色苷含量并无明显变化但果实中花色苷组分却会发生改变，其中花翠素、甲基花翠素和二甲花翠素衍生物的比例会下降，而花青素和甲基花青素衍生物的比例会增加，由于实验品种、地点甚至采样方式的不同，都会导致这些现象出现。
本实验中，遮光处理显著提高了果皮中花色苷的总量，均显著高于对照，开始转色-完全成熟期间的遮光网1有效增加了花青素葡萄糖苷及花青素乙酰化葡萄糖苷含量，但是100%转色-完全成熟期间的遮光则显著减少了这2 种单体花色苷含量。成熟期遮光可促进果皮中花色苷的甲基化和酰化修饰的累积，且不同时期的遮光对花色苷的累积及构成组分的影响有不同效果。遮光均促进了甲基化花色苷及酰化修饰花色苷的累积，但是遮光率的不同也会导致花色苷的累积效果也不一致。
本实验中，在不同时期采用2 种遮光率的遮阳网进行树体顶端遮光，在开始转色-完全成熟期间，样品中的花青素以及花青素衍生物的比例增加，但是在100%转色-完全成熟期间遮光，样品中花青素以及花青素衍生物的比例均低于CK，且50%遮光的遮阳网处理后其花青素以及花青素衍生物均受到明显抑制。4 种遮光处理均使花翠素香豆酰化葡萄糖苷（顺式+反式）占总花色苷的比例显著降低。开始转色-完全成熟期间主要增加了3’-甲基花青素乙酰化葡萄糖苷所占总花色苷的比例，100%转色-完全成熟期间花青素葡萄糖苷、3’-甲基花青素葡萄糖苷所占总花色苷的比例显著低于CK。
综上所述，在恰当的生长时期选取合适的遮光方式使葡萄果皮积累更多的花色苷，改变花色苷中修饰组分的比例并有效提高果皮中稳定花色苷含量，提高葡萄酒的色泽稳定性，进而为提高西部产区葡萄酒的色泽品质提供理论依据。
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Effects of Shading Treatment on Occumulation of Anthocyanin in Grape Fruit of ‘Cabernet Sauvignon’ at Harvest
ZHANG Zhenzhen, LI Qian, DONG Rong, QIAO Dan, YAN Xue, ZHANG Ke
(College of Food Science and Pharmacy, Xinjiang Agricultural University, Ürümqi 830052, China)
Abstract: In this paper, Cabernet Sauvignon grapevines during two growth stages: from the beginning of veraison to full maturation (I), and from full veraison to full maturation (II) were shaded with 50% and 20% shading nets. Normal growth conditions were considered as the control. Changes in the composition and contents of anthocyanins in grape skins at maturity were determined by high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS). The experimental results showed that a total of 15 anthocyanins were detected in the 20% shading net group during stage I, while 14 anthocyanins were detected in each of the other four treatments. Pe-coumaroylglucoside (cis or trans) was not detected. The total amount of anthocyanins in the shading treatments was higher than that in the control, but methylated anthocyanins were still the main anthocyanins, and the 50% shading net significantly increased the content of methylated anthocyanins during stage II. With the shading treatments, the composition of anthocyanins was changed: the 20% shading net significantly improved the content of coumarin-modified anthocyanins during stage I and increased the content of acetylated anthocyanins during both stages. The four shading treatments significantly reduced the content of Dp-coumaroylglucoside in both cis and trans. During stage I, the ratio of 3’-methyl anthocyanin acetylated glucoside to total anthocyanins was increased; during stage II, the proportions of cyanidin-O-glucoside and peonidin-O-glucoside were significantly lower than in the control group.
Keywords: ‘Cabernet Sauvignon’; shading treatment; anthocyanins; partial least squares-discriminant analysis
收稿日期：2019-03-10
基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（31660547）
第一作者简介：张珍珍（1984ü）（ORCID: 0000-0002-3552-3739），女，副教授，博士，研究方向为食品质量与安全。E-mail: 870055809@qq.com
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190310-115
中图分类号：TS261.7
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2020）04-0157-07
引文格式：张珍珍, 李倩, 董荣, 等. 树体遮光对采收期‘赤霞珠’葡萄果实花色苷类物质积累的影响. 食品科学, 2020, 41(4):157-163. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190310-115. http://www.spkx.net.cn
ZHANG Zhenzhen, LI Qian, DONG Rong, et al. Effects of shading treatment on occumulation of anthocyanin in grape fruit of ‘Cabernet Sauvignon’ at harvest. Food Science, 2020, 41(4): 157-163. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190310-115. http://www.spkx.net.cn
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