蛋氨酸限制对高脂饮食诱导的肥胖小鼠胰岛功能损伤的改...
蛋氨酸限制对高脂饮食诱导的肥胖小鼠胰岛功能损伤的改善作用罗婷玉1,2，杨玉辉1,2，许云聪1,2，高秋丽2，施用晖1,2，吴国卿1,2，乐国伟1,2,*
（1.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122）
摘 要：目的：研究饮食蛋氨酸限制（methionine restriction，MR）对高脂饮食诱导的肥胖小鼠胰腺损伤的缓解作用。方法：将210 只雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组（CON，0.86%（质量分数，下同）蛋氨酸+4%脂肪）30 只和高脂饮食组（HF，0.86%蛋氨酸+20%脂肪）180 只。10 周后，120 只成功诱导肥胖模型的小鼠随机分为HF组、高脂饮食+蛋氨酸限制组（HF+MR，0.17%蛋氨酸+20%脂肪）、恢复正常饮食组（C*，0.86%蛋氨酸+4%脂肪）、恢复正常饮食+蛋氨酸限制组（C*+MR，0.17%蛋氨酸+4%脂肪）。干预第24周时测定糖耐量，分别在8、16、24 周后处死小鼠，测定空腹血糖水平、胰岛素水平、血浆及胰腺H2S水平、血浆及胰腺氧化还原状态相关指标；实时荧光定量聚合酶链式反应测定胰腺胰岛素分泌相关基因以及内质网应激相关基因表达量。结果：饮食蛋氨酸限制显著降低了小鼠体质量，增加了食物摄入和能量摄入（P＜0.05）；显著降低了空腹血糖水平、空腹胰岛素水平、糖耐量和胰岛素抵抗指数（P＜0.05）；显著增加了血浆和胰腺H2S水平，改善了血浆和胰腺的氧化还原状态（P＜0.05）；显著上调了胱硫醚-γ-裂解酶、胱硫醚-β-合成酶、肌腱膜纤维肉瘤肿瘤基因同系物A、十二指肠同源框因子-1和B细胞淋巴瘤基因2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）的表达（P＜0.05），显著下调了Bcl-2同源促凋亡基因、转录因子X盒结合蛋白-1、C/EBP同源蛋白、肌醇需求激酶1α的表达（P＜0.05）；且以上指标在HF+MR组和C*+MR组小鼠中表现出相似的变化趋势。结论：饮食蛋氨酸限制可能是通过改善高脂饮食诱导肥胖小鼠胰腺组织内质网应激和氧化还原状态，进而起到保护胰腺和促进胰岛素分泌的作用。
关键词：蛋氨酸限制；胰腺；肥胖；胰岛素抵抗；内质网应激
近年来，肥胖的发病率逐年增加，引起了社会的广泛关注。长期肥胖会导致胰岛素抵抗（insulin resistance，IR），具有进一步引发2型糖尿病的风险。IR增加了机体对胰岛素合成和分泌的需求，在胰腺内质网所合成的蛋白中超过50%为前胰岛素，因此当机体发生IR时，胰腺通过增加胰岛素的合成以维持正常的血糖水平，从而导致β细胞内质网负荷过大，产生过量的错误折叠蛋白，因而产生内质网应激，导致β细胞功能障碍并促进细胞凋亡。大量动物及人体研究表明，IR个体内参与内质网应激的相关信号分子，如C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、肌醇需求激酶1（inositol requiring enzyme 1，IRE1）和重链结合蛋白（heavychain binding protein，Bip）在β细胞中均高度表达。此外，研究发现胰岛β细胞的抗氧化酶水平较低，在肥胖状态下极易产生过量脂质过氧化产物，其可进一步加剧β细胞内质网应激，影响胰岛素的合成与分泌，损伤胰岛细胞，甚至造成胰腺功能性障碍。
自Orentreich等发现将饮食中的蛋氨酸含量从0.86%限制到0.17%可以增加30%～40%的寿命以来，对饮食蛋氨酸限制（methionine restriction，MR）的研究日益增多且逐步深入，研究发现MR在降低体质量、抗炎、减轻氧化应激以及在增加胰岛素敏感性等方面均有显著的效果。与能量限制和其他方法相比，MR的优势在于它只通过限制饮食中的蛋氨酸摄入量而非减少正常的饮食摄入来改善胰岛素敏感性。Lees等发现MR可以逆转与年龄相关的IR，并证明胰岛素敏感性的改善并不是减轻体质量后的间接结果，MR可通过某些因素直接影响胰岛素敏感性。胰腺作为胰岛素分泌的重要组织，在调控机体糖代谢、改善IR方面发挥着巨大作用。然而目前还鲜有研究报道MR对于高脂饮食诱导的肥胖小鼠胰腺组织损伤的影响。因此，本实验以C57BL/6J小鼠为研究对象，利用高脂饮食诱导肥胖模型，探究MR对高脂饮食诱导的小鼠胰腺保护作用，为肥胖、IR以及糖尿病人群的饮食策略提供新的思路和参考依据。
1 材料与方法
1.1 动物、材料与试剂
C57BL/6J雄性小鼠（4 周龄，约18 g），购于南京生物医药研究院，生产许可证号：SCXK（苏）2015-0001，合格证号201605176。
血糖试纸 强生（上海）医疗器械有限公司；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）、苏木精-伊红（hematoxylin eosin，HE）染色液 南京建成生物工程研究所；TRIzol试剂 美国Biomiga公司；RNA提取试剂盒、SYBR Green Master Mix诺维赞生物科技公司；基因引物 上海捷瑞生物工程公司；小鼠胰岛素酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 慧嘉生物科技公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
倍优血糖仪 强生（上海）医疗器材有限公司；5804R台式高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Epoch酶标仪 美国Bio-Tek公司；ETC811聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪 东胜兴业科学仪器有限公司；7900HT Fast实时荧光PCR仪美国ABI公司；石蜡组织切片机 德国Leica公司；BX43F显微镜 日本Olympus公司。
1.3 方法
1.3.1 动物饲喂及分组
表 1 饲料组成
Table 1 Compositions of experimental diets g/100 g
注：饲料依据AIN-76A方法配制。*.矿物质混合（g/kg日粮）：磷酸钙（500.00）、氧化镁（24.00）、一水合柠檬酸钾（220.00）、硫酸钾（52.00）、氯化钠（74.00）、十二水合硫酸铬钾（0.55）、碳酸铜（0.30）、碘酸钾（0.01）、柠檬酸铁（6.00）、碳酸锰（3.50）、亚硒酸钠（0.01）、碳酸锌（1.60）、蔗糖（118.03）；#.维生素混合（g/kg日粮）：VB1（0.60）、VB2（0.60）、VB6（0.70）、烟酸（3.00）、泛酸钙（1.60）、叶酸（0.20）、0.1%生物素（2.00）、0.1% VB12（1.00）、VK3（0.08）、VA（0.80）、VE（10.00）、VD3（1.00）、蔗糖（978.42）。
本研究动物实验经江南大学动物伦理审查委员会批准，许可证号JN.No.20161207-20170728，按照国家实验动物福利指导方针进行。将210 只C57BL/6J雄性小鼠以正常饲料适应性喂养一周后，按照体质量随机分成两组：正常饮食组（CON组，n＝30，0.86%（质量分数，下同）蛋氨酸+4%脂肪）和高脂饮食组（HF组，n＝180，0.86%蛋氨酸+20%脂肪）。10 周后，HF组有120 只小鼠成功建立肥胖模型（肥胖度大于20%）。将成功建立肥胖模型的小鼠按照体质量随机分成4 组：1）高脂饮食组（HF组，n＝30）；2）高脂+MR饮食组（HF+MR组，n＝30，0.17%蛋氨酸+20%脂肪）；3）恢复正常饮食组（C*组，n＝30，0.86%蛋氨酸+4%脂肪）；4）恢复正常+MR饮食组（C*+MR组，n＝30，0.17%蛋氨酸+4%脂肪）。实验小鼠饲养于SPF级动物房，12 h/12 h昼夜循环光照，环境温度（22f2）℃、相对湿度（50f10）%，保持饲养环境卫生。所有实验小鼠均自由饮水采食，每周称体质量并记录，采食量分别在造模成功分组后第8、16、24周采用综合实验动物监测系统测定。饲料配方如表1所示。
1.3.2 口服糖耐量测定
造模成功后，小鼠隔夜禁食不禁水12 h，尾部采血测0 min血糖浓度；质量分数50%葡萄糖溶液以2 g/kg mb灌胃后，分别在15、30、60、90、120 min测血糖浓度，并计算血糖曲线下面积（area under curve，AUC）。
1.3.3 血液、胰腺样品的采集
饲养结束后，小鼠宰杀前禁食不禁水12 h，称体质量，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，心脏取血，放入肝素钠抗凝管中，其余血液放置30 min后4 ℃、4 000 r/min离心10 min，取上层血浆，-80 ℃保存备用。断颈处死，冰上迅速取胰腺，其中取0.1 g左右胰腺组织置于TRIzol试剂中，剪碎，-80 ℃保存用于总RNA的提取；取约0.1 g胰腺组织浸入体积分数4%中性甲醛溶液中固定，4 ℃保存用于石蜡切片观察组织形态。
1.3.4 血浆及胰腺指标测定
空腹胰岛素以及血浆和胰腺T-AOC、MDA、GSH、GSSG、GSH-Px水平均按照试剂盒说明书测定。胰岛素抵抗指数（insulin resistance index，HOMA-IR）按下式计算。
1.3.5 血浆和胰腺H2S水平测定
取100 μL样品，加入0.25 mL质量分数15%醋酸锌溶液和0.45 mL双蒸水，室温放置10 min；加入质量分数10%三氯乙酸溶液0.25 mL，4 ℃、14 000hg离心10 min；取上清液600 μL，加入对苯二胺盐酸盐溶液（20 mmol/L）133 μL以及FeCl3（30 mmol/L）133 μL，充分混匀；室温静置20 min，于670 nm波长处测吸光度。用Na2S标准溶液制作标准曲线。
1.3.6 胰腺HE染色
胰腺在甲醛中固定后进行乙醇梯度脱水，二甲苯透明，在包埋机中将样品浸入石蜡包埋；预冷后将蜡块固定在切片机上切成5 μm薄片，温水展开后平贴于载玻片上；HE染色严格遵循试剂盒说明书进行，滴少许中性树脂封片，自然通风晾干；置于显微镜下200 倍放大观察胰腺切片并采集图片。
1.3.7 胰腺总RNA提取及反转录
用TRIzol法提取胰腺中的总RNA，通过测定溶液中吸光度比值（A260 nm/A280 nm）确定所得RNA的纯度，测得吸光度比值在1.8～2.0之间可用于下一步实验。加入适量DEPC水稀释至1 μg/mL，取2.0 μg模板RNA进行扩增，扩增条件为：37 ℃，1.5 h；95 ℃，5 min；4 ℃冷却。反转录所得cDNA存于-80 ℃备用。
1.3.8 实时荧光定量PCR分析
参照试剂盒说明书，以β-actin为内标，测定B细胞淋巴瘤基因2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bcl-2同源促凋亡基因（Bcl-2 associated protein X，Bax）、转录因子X盒结合蛋白-1（X-box binding protein-1，Xbp-1）、胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CSE）、胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase，CBS）、葡萄糖转运载体2（glucose transporter 2，GLUT2）、肌腱膜纤维肉瘤肿瘤基因同系物A（v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue A，MafA）、十二指肠同源框因子-1（pancreatic duodenal homeobox-1，Pdx-1）、CHOP、IRE1-α和Bip mRNA的表达量，引物序列如表2所示。使用实时荧光定量PCR仪检测各模板的Ct值，通过2-ΔΔCt法进行相对定量。反应体系如下：0.4 μL上游引物（10 μmol/L）、0.4 μL下游引物（10 μmol/L）、5.4 μL SYBR Green Master Mix、3.7 μL无菌水和0.5 μL cDNA模板，形成10 μL体系。扩增条件如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性20 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循环40 次；72 ℃终末延伸2 min；4 ℃冷却。
表 2 实时荧光定量PCR引物序列
Table 2 Sequences of primers used for quantitative real-time PCR
1.4 数据统计与分析
采用SPSS 17.0软件进行数据分析，各组间的比较采用单因素方差分析，对满足方差齐性的结果用Tukey检验进行多重比较，方差不齐时采用Tamhane检验。结果以平均值±标准差表示。当P＜0.05时认为差异显著。
2 结果与分析
2.1 MR对肥胖小鼠体质量、采食量和能量摄入的影响
由图1可知，与CON组小鼠相比，HF组小鼠体质量显著增加（P＜0.05）；HF+MR组小鼠体质量显著低于HF组小鼠（P＜0.05）；C*组小鼠体质量停止增长，并在16 周后出现下降趋势；与C*组小鼠相比，C*+MR组小鼠体质量显著降低（P＜0.05）。
图 1 MR对肥胖小鼠体质量的影响
Fig. 1 Effect of dietary MR on body mass of obese mice
表 3 MR对肥胖小鼠采食量和能量摄入的影响
Table 3 Effect of dietary MR on food intake and energy intake
注：同行肩标小写字母不同代表差异显著（P＜0.05），表4同。
由表3可知，在8、16 周和24 周，与CON组小鼠相比，HF组小鼠采食量显著下降，能量摄入显著增加（P＜0.05）；与HF组小鼠相比，HF+MR组小鼠以及C*组小鼠采食量和能量摄入均显著增加（P＜0.05）；与C*组小鼠相比，C*+MR组小鼠采食量和能量摄入量均显著增加。
2.2 MR对肥胖小鼠血糖、胰岛素水平、HOMA-IR和口服糖耐量的影响
由表4可知，8～24 周，与CON组小鼠相比，HF组小鼠空腹血糖水平显著增加（P＜0.05）；与HF组小鼠相比，HF+MR组小鼠以及C*组小鼠空腹血糖水平显著降低（P＜0.05）；与C*组小鼠相比，C*+MR组小鼠空腹血糖水平显著下降（P＜0.05）；尽管HF+MR组小鼠血糖水平高于C*+MR组，但在8 周后无显著性差异。同CON组小鼠相比，HF组小鼠空腹胰岛素水平在8、16 周和24 周显著上升（P＜0.05）；与HF组小鼠相比，HF+MR组小鼠空腹胰岛素水平在8、16 周和24 周均显著下降（P＜0.05）；C*组小鼠与C*+MR组小鼠空腹胰岛素水平无显著性差异；此外，24 周时，HF+MR组小鼠与C*+MR组小鼠空腹胰岛素水平无显著性差异。HOMA-IR及口服糖耐量实验结果（图2）显示，HF组小鼠显著高于CON组；HF+MR组小鼠显著低于HF组（P＜0.05），且与C*+MR组小鼠无显著性差异。
表 4 MR对肥胖小鼠空腹血糖、空腹胰岛素水平和HOMA-IR的影响Table 4 Effect of dietary MR on fasting blood glucose and plasma insulin levels and insulin resistance index
图 2 MR对肥胖小鼠24 周时糖耐量（A）和AUC（B）的影响
Fig. 2 Effect of dietary MR on glucose tolerance test (A) and area under curve (B) at 24 weeks
2.3 MR对肥胖小鼠胰腺组织形态的影响
图 3 胰腺HE染色结果（200×）
Fig. 3 Pancreatic hematoxylin eosin staining (200 ×)
如图3所示，CON组小鼠胰岛呈圆形，胞浆界限清晰，胰岛β细胞大小一致，核染色质清晰；与CON组相比，HF组胰岛β细胞形态不一，胞浆界限不清晰；与HF组小鼠相比，HF+MR组、C*组以及C*+MR组小鼠胰岛胞浆略有不均匀，但胞浆界限清晰。
2.4 MR对肥胖小鼠血浆氧化还原状态的影响
表 5 饮食MR对肥胖小鼠血浆氧化还原状态的影响
Table 5 Effect of MR on plasma redox status in obese mice
注：同一指标同一时间肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。表6同。
由表5可知，在16 周和24 周，HF组小鼠较CON组血浆GSH-Px水平显著下降（P＜0.05），HF+MR组小鼠血浆GSH-Px水平较HF组小鼠显著增加（P＜0.05）；C*、HF+MR组与C*+MR组小鼠GSH-Px水平无显著性差异。HF+MR组小鼠血浆GSH/GSSG较HF组小鼠在8、16 周和24 周时显著增加（P＜0.05）；C*+MR组小鼠较C*组小鼠GSH/GSSG在8 周显著增加（P＜0.05），16 周和24 周无显著性差异。3 个周期的实验结果显示，HF组小鼠较CON组小鼠血浆T-AOC显著降低（P＜0.05），HF+MR组小鼠较HF组小鼠血浆T-AOC显著增加（P＜0.05）；16 周及24 周时，C*+MR组小鼠较C*组小鼠血浆T-AOC显著增加（P＜0.05），C*+MR组与HF+MR组小鼠相比无显著性差异。3 个周期中，与CON组相比，HF组小鼠MDA水平显著增加（P＜0.05）；HF+MR组小鼠较HF组小鼠MDA水平显著下降（P＜0.05）；C*+MR组小鼠较C*组小鼠MDA水平显著下降（P＜0.05）；C*+MR组与HF+MR组小鼠无显著性差异。
2.5 MR对肥胖小鼠胰腺氧化还原状态的影响
由表6可知，CON组、HF组、HF+MR组小鼠胰腺GSH水平3 个周期均无显著性差异；16 周及24 周时，C*+MR组小鼠GSH水平比C*组小鼠显著下降（P＜0.05）。与CON组小鼠相比，HF组小鼠胰腺GSH/GSSG从16 周开始显著下降（P＜0.05）；HF+MR组小鼠胰腺GSH/GSSG较HF组小鼠在24 周显著增加（P＜0.05），且与C*+MR组小鼠无显著性差异。16 周及24 周时，HF组小鼠较CON组小鼠胰腺T-AOC显著降低（P＜0.05），HF+MR组小鼠较HF组小鼠胰腺T-AOC显著增加（P＜0.05）；8 周时，C*+MR组小鼠较C*组小鼠胰腺T-AOC显著增加（P＜0.05），16 周及24 周时无显著性差异。3 个周期中，与CON组相比，HF组小鼠MDA水平呈增加趋势，8 周和16 周显著增加（P＜0.05）；与HF组小鼠相比，HF+MR组小鼠3 个周期的MDA水平均显著下降（P＜0.05）；C*+MR组小鼠与C*组小鼠MDA水平无显著性差异；HF+MR组与C*+MR组小鼠相比呈下降趋势，3 个周期均有显著性差异（P＜0.05）。
表 6 饮食MR对肥胖小鼠胰腺氧化还原状态的影响
Table 6 Effect of MR on pancreas redox status in obese mice
2.6 MR对肥胖小鼠血浆和胰腺H2S水平以及胰腺H2S合成相关基因表达的影响
如图4所示，16 周及24 周，HF组小鼠血浆以及胰腺H2S水平较CON组小鼠显著下降（P＜0.05），HF+MR组小鼠血浆以及胰腺H2S水平较HF组小鼠显著增加（P＜0.05）；C*组、HF+MR组与C*+MR组小鼠血浆H2S水平无显著差异；8 周时，C*+MR组比C*组小鼠胰腺H2S水平显著上升（P＜0.05），16 周及24 周无显著性差异。16 周及24 周，HF组小鼠胰腺CBS mRNA表达量较CON组小鼠显著下降（P＜0.05）；8 周和16 周HF+MR组小鼠胰腺CBS mRNA表达量较HF组显著增加（P＜0.05）；8 周及24 周，C*+MR组较C*组小鼠CBS mRNA表达量显著增加（P＜0.05）。与CON组相比，HF组CSE mRNA表达量显著下降（P＜0.05）；8 周和16 周HF+MR组小鼠CSE mRNA表达量较HF组小鼠显著增加（P＜0.05）；24 周时，C*+MR组小鼠胰腺CSE mRNA表达量较C*组显著增加（P＜0.05）。
图 4 MR对肥胖小鼠血浆（A）、胰腺H2S含量（B）、胰腺CBS（C）和胰腺CSE（D）mRNA相对表达量的影响
Fig. 4 Effect of dietary MR on H2S levels in plasma (A) and pancreas (B), CBS (C) and CSE (D) mRNA expression level in pancreas of obese mice
2.7 MR对肥胖小鼠胰腺内质网应激相关基因表达的影响
如图5所示，HF组小鼠较CON组小鼠CHOP、IRE1-α和Xbp-1 mRNA表达量呈上升趋势，其中CHOP基因表达量在3 个周期均显著增加（P＜0.05），IRE1-α和Xbp-1表达量均在16 周及24 周显著增加（P＜0.05）；HF+MR组小鼠较HF组小鼠CHOP、IRE1-α和Xbp-1表达量呈下降趋势，其中CHOP基因表达量在3 个周期均显著降低（P＜0.05），IRE1-α和Xbp-1表达量均在16 周及24 周显著降低（P＜0.05）；与C*组、HF+MR组小鼠相比，C*+MR组小鼠CHOP、IRE1-α和Xbp-1 mRNA表达量无显著性差异；Bip mRNA表达量在不同组小鼠中均无显著性差异。
图 5 MR对肥胖小鼠胰腺CHOP（A）、IRE1-α（B）、Bip（C）和Xbp-1（D）mRNA相对表达量的影响
Fig. 5 Effect of dietary MR on CHOP (A), IRE1-α (B), Bip (C) and Xbp-1 (D) mRNA expression level in pancreas of obese mice
2.8 MR对肥胖小鼠胰腺组织细胞凋亡相关基因表达的影响
如图6所示，与CON组小鼠相比，HF组小鼠Bax mRNA表达量上升，其中24 周差异显著；Bcl-2 mRNA表达量下降，其中16 周及24 周差异显著（P＜0.05）；与HF组小鼠相比，HF+MR组小鼠Bax mRNA表达量3 个周期均显著下降（P＜0.05），Bcl-2 mRNA表达量在16 周和24 周显著上升（P＜0.05）；与C*组小鼠相比，C*+MR组小鼠Bax mRNA表达量下降，Bcl-2 mRNA表达量上升，均在第8周有显著差异（P＜0.05）；C*+MR组小鼠同HF+MR组小鼠Bax mRNA表达量无显著性差异；24 周时C*+MR组小鼠同HF+MR组小鼠Bcl-2 mRNA表达量无显著性差异。
图 6 MR对肥胖小鼠胰腺Bax（A）和Bcl-2（B）mRNA相对表达量的影响
Fig. 6 Effect of dietary MR on Bax (A) and Bcl-2 (B) mRNA expression level in pancreas of obese mice
2.9 MR对肥胖小鼠胰腺胰岛素分泌相关基因表达的影响
图 7 MR对肥胖小鼠胰腺MafA（A）、Pdx-1（B）和GLUT2（C）mRNA相对表达量的影响
Fig. 7 Effect of dietary MR on MafA (A), Pdx-1 (B) and GLUT2 (C)mRNA expression level in pancreas of obese mice
如图7所示，3 个不同实验周期中，HF组小鼠较CON组小鼠MafA和Pdx-1 mRNA表达量显著降低（P＜0.05）；HF+MR组小鼠较HF组小鼠MafA和Pdx-1 mRNA表达量显著增加（P＜0.05）；C*+MR组小鼠与C*组小鼠相比MafA和Pdx-1 mRNA表达量均上升，其中8 周和24 周时差异显著（P＜0.05）；8 周和24 周时C*+MR组小鼠同HF+MR组小鼠相比无显著性差异。GLUT2 mRNA在不同周期及不同组小鼠胰腺中的表达量均无显著差异。
3 讨 论
本研究结果发现，MR在增加肥胖小鼠采食量和能量摄入的条件下，能够降低肥胖小鼠的体质量，说明MR具有非常有效的减肥降脂作用，这与本课题组之前的研究结果一致。另外，MR也能够改善IR，使得肥胖小鼠的血糖维持在正常水平。过去的研究也报道MR能够改善IR，增加胰岛素敏感性。胰岛β细胞在分泌胰岛素、维持机体血糖稳态中发挥了重要的作用，肥胖引起的氧化应激可损伤胰岛β细胞结构。本研究的胰腺组织HE染色切片结果显示，HF+MR和C*+MR组小鼠均有较为均匀的胰岛胞浆，胞浆界限较为清楚，说明MR能够有效改善高脂诱导的小鼠胰腺组织损伤。许多研究表明，胰岛β细胞对内质网应激十分敏感。内质网应激时，CHOP表达增加，Bip与IRE1-α等蛋白相解离，激活的IRE1-α特异性剪切Xbp-1，促进Xbp-1s转录。长期高脂饮食可以破坏机体氧化还原体系，进一步造成内质网应激，损伤胰腺。本研究结果发现MR可显著降低肥胖小鼠胰腺CHOP、IRE1-α和Xbp-1基因的表达水平，说明MR能够改善肥胖诱导的小鼠胰腺内质网应激，进而改善胰岛β细胞功能。
机体的氧化还原体系同胰腺功能密切相关，但胰岛β细胞的抗氧化酶水平较低，极易产生脂质过氧化产物。功能正常的抗氧化防御系统可有效调节机体的氧还原状态，其中T-AOC是反映机体抗氧化功能的综合性指标；GSH-Px是过氧化物分解酶，可分解体内的脂质过氧化物；GSH可与活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）结合被氧化成GSSG，因此，GSH/GSSG可有效反映机体氧化还原状态；MDA是脂质过氧化的最终产物，其可以间接反映细胞遭受ROS损伤的程度。本研究结果显示，MR可有效降低胰腺和血浆中MDA水平，增加T-AOC、GSH-Px水平和GSH/GSSG，表明MR可能通过增加胰腺的抗氧化酶活性，从而增加胰腺抗氧化能力，减少ROS的产生，改善由肥胖造成的氧化应激，进而实现对胰岛β细胞的保护作用。
有研究发现MR可增加机体H2S水平，H2S作为重要的气体信号分子，在保护胰岛β细胞中发挥着重要作用，其在机体中主要通过CSE和CBS作用产生。有研究指出，在高脂饮食条件下，CSE基因敲除小鼠同正常小鼠相比，胰岛细胞更易受到糖脂毒性的危害。体外实验表明，将胰岛细胞长期暴露在H2S供体NaHS中可显著减少细胞凋亡，其与H2S改善了胰岛细胞氧化应激相关。本研究发现MR显著增加了血浆和胰腺中H2S水平，不同程度上调了CBS及CSE mRNA表达水平，提示MR可能通过增加H2S的水平改善机体氧化还原状态，从而保护胰腺组织。此外，有研究表明，氧化应激和内质网应激相互作用，互为因果。机体抗氧化水平降低，脂质过氧化物过度累积可导致内质网氧化还原状态失衡，蛋白错误折叠增加；而蛋白质错误折叠增加可导致ROS的产生，进一步导致机体的氧化应激。因此，MR可能通过同时改善肥胖小鼠胰腺内质网应激和氧化还原状态，维持胰岛β细胞正常功能。
此外，内质网应激与胰岛β细胞凋亡和胰岛素分泌相关。CHOP表达增加会导致促凋亡基因表达增加，抗凋亡基因表达减少，因此细胞凋亡通路被激活，胰岛β细胞凋亡增加。本研究发现，MR显著降低了Bax mRNA表达水平，增加了Bcl-2 mRNA表达水平，说明MR减少了胰岛细胞凋亡。Pdx-1以及MafA对胰岛细胞发育和胰岛素分泌至关重要，Johnson等的研究表明Pdx-1+/-小鼠糖耐量下降、胰岛素分泌减少、胰岛细胞凋亡增加；Allagnat等的研究表明长期内质网应激持续产生的XBP-1抑制了Pdx-1以及MafA的表达。本研究结果显示，MR显著上调了胰腺中Pdx-1以及MafA mRNA表达水平，表明MR改善了肥胖小鼠胰腺的功能，促进了其胰岛素的分泌。GLUT2也在内质网上合成，其作为胰腺中葡萄糖的主要转运载体，在葡萄糖刺激促进胰岛素分泌过程中十分重要。本研究结果显示，HF组GLUT2 mRNA表达水平下降，HF+MR组GLUT2 mRNA表达水平增加，但均无显著差异。提示MR促进胰岛素的分泌并非通过促进GLUT2表达实现。
本研究发现在小鼠肥胖后，MR的减重效果在恢复正常饮食模式下效果更为显著，其可能与饮食结构和能量来源不同相关，而无论在高脂饮食还是恢复到正常脂肪饮食的条件下，中长期饮食MR无需限制能量摄入，均能够改善肥胖小鼠IR。而且MR限制能够使得肥胖小鼠在两种饮食模式下，胰腺氧化还原状态、H2S水平、内质网应激、细胞凋亡和胰岛素分泌相关基因表达水平基本一致，暗示了MR饮食在改善肥胖诱导的胰腺损伤时可以不需要控制能量的摄入。
综上，饮食MR能够改善高脂饮食诱导的肥胖小鼠胰腺组织内质网应激和氧化还原状态失衡，减少胰腺组织细胞凋亡，进而缓解胰腺组织损伤，促进胰腺胰岛素分泌，从而起到改善肥胖小鼠IR和血糖水平的作用。本研究从饮食的角度为改善长期肥胖诱导的IR以及胰腺损伤提供了新的思路。
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Effect of Dietary Methionine Restriction on Islet Function Injury in Obese Mice Induced by High-Fat Diet
LUO Tingyu1,2, YANG Yuhui1,2, XU Yuncong1,2, GAO Qiuli2, SHI Yonghui1,2, WU Guoqing1,2, LE Guowei1,2,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)
Abstract: Purpose: To evaluate the protective effect of dietary methionine restriction (MR) on the pancreas of obese mice induced by high-fat diet. Methods: Totally 210 male C57BL/6J mice were divided into a control group (CON: 0.86%methionine + 4% fat; n = 30) and a high-fat diet group (HF: 0.86% methionine + 20% fat; n = 180). Obesity was successfully induced in 120 of the HF diet fed mice, and the obese mice were further randomly divided into an HF group, an HF + MR group (0.17% methionine + 20% fat), a control diet group (C*: 0.86% methionine + 4% fat) and a C* + MR group ( 0.17%methionine + 4% fat). A subset of animals in each of the four groups were euthanized at 8, 16 and 24 weeks. Glucose tolerance was determined at 24 weeks. Fasting blood glucose and plasma insulin levels, hydrogen sulfide (H2S) levels and redox indicators in plasma and pancreas were investigated. Quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) was used to determine the expression of genes related to insulin secretion and endoplasmic reticulum stress. Results: MR significantly reduced body mass and increased feed and energy intakes in mice (P < 0.05); decreased fasting blood glucose and plasma insulin levels, glucose tolerance and insulin resistance index (P < 0.05); increased H2S levels in plasma and pancreas and improved redox status (P < 0.05); up-regulated the mRNA expression of cystathionine-caseo-lyase (CSE), cystathie-basesynthase (CBS), v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue (MafA), pancreatic duodenal homeobox-1(Pdx-1) and B-cell lymphoma 2 (Bcl-2), and down-regulated the mRNA expression of Bcl-2 associated protein X (Bax),X-box binding protein-1 (Xbp-1), C/EBP homologous protein (CHOP), and inositol requiring enzyme 1α (IRE1α) (P < 0.05).Interestingly, the HF + MR and C* + MR groups showed similar trends in all the above indicators. Conclusion: MR can protect the pancreas and promote insulin secretion by improving endoplasmic reticulum stress and redox status in pancreatic tissue of obese mice.
Keywords: methionine restriction; pancreas; obesity; insulin resistance; endoplasmic reticulum stress
引文格式：2018-11-01
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31571841）；江南大学食品科学与技术国家重点实验室基金项目（SKLF-ZZB-201609）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD33B05）
第一作者简介：罗婷玉（1994—）（ORCID: 0000-0003-1595-3923），女，硕士，研究方向为食品营养与功能因子。E-mail: tingyuluo@163.com
*通信作者简介：乐国伟（1956—）（ORCID: 0000-0001-7343-8589），男，教授，博士，研究方向为食品营养与功能因子。E-mail: lgw@jiangnan.edu.cn
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181101-010
中图分类号：R151.2
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2020）03-0111-09
引文格式：罗婷玉, 杨玉辉, 许云聪, 等. 蛋氨酸限制对高脂饮食诱导的肥胖小鼠胰岛功能损伤的改善作用. 食品科学, 2020,41(3): 111-119. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181101-010. http://www.spkx.net.cn
LUO Tingyu, YANG Yuhui, XU Yuncong, et al. Effect of dietary methionine restriction on islet function injury in obese mice induced by high-fat diet. Food Science, 2020, 41(3): 111-119. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181101-010. http://www.spkx.net.cn
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