四川浓香型大曲生产中酵母菌、芽孢杆菌与 工艺指标的关...
四川浓香型大曲生产中酵母菌、芽孢杆菌与 工艺指标的关联性分析向慧平1，林宜锦1，关统伟1,*，张家旭2，尚红光2，赵小林2，焦士蓉1，冯 栩1，杨 阳1
（1.西华大学微生物研究所，四川省高校食品生物技术重点实验室，四川 成都 610039；2.成都蜀之源酒业有限公司，四川 成都 611335）
摘 要：研究四川浓香型白酒制曲过程中酵母菌、芽孢杆菌类群以及工艺指标（理化因子和质量指标）的动态变化，分析大曲中酵母菌和芽孢杆菌多性及其与工艺指标的关系。根据QB/T 4257ü 2011《酿酒大曲通用分析方法》，监测制曲过程中的工艺指标，同时采用纯培养技术对11 个品中的酵母菌和芽孢杆菌进行选择性分离。纯培养获得的194 株酵母菌，归属于子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）的9 个属，其中7 个属都集中在酵母菌目（Saccharomycetales）；148 株芽孢杆菌被鉴定为8 个种，其中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为优势菌。另外，研究也验证了四川浓香型大曲在生产周期第90～180天为最佳使用期的生产经验，随着贮存期的继续延长，大曲品质出现大幅下降。冗余分析显示，温度、水分、酸度和淀粉含量与两大微生物类群以负相关为主，3 种酵母菌（Kazachstania exigua、Candida tropicalis和Wickerhamomyces anomalus）和3 种芽孢杆菌 （B. subtilis、B. horneckiae和B. megaterium）是影响大曲质量的关键微生物类群。四川浓香型大曲生产过程中具有丰富的酵母菌与芽孢杆菌多性且发生动态变化，它们既受到制曲理化因子的调控，也影响大曲品质。
关键词：浓香型大曲；酵母菌；芽孢杆菌；工艺指标；关联性分析
中国白酒独特的固态发酵技术已有数千年的历史， 而浓香型白酒以其香味谐调浓郁和口感绵甜醇厚的优良品质，占据了70%的中国白酒市场。曲为酒之骨，浓香型大曲是酿造优质浓香型白酒的关键，它属于中高温曲，55～60 ℃的顶温。常见的制曲工艺分为1 个月的曲房培菌期和3 个月的贮存期。而在实际生产中，大曲的贮存期往往会被延长，部分大曲的贮存期甚至会被延长至1 年以上。目前，国内学者对大曲的研究已经由表及里深入到大曲的特征风味、微生物类群演替及其功能表达，并取得了许多成果，研究发现栖息于大曲中的微生物决定了大曲的品质，它们不仅参与白酒的发酵，还提供丰富的酶系（如糖化酶、纤维酶、淀粉酶和酯酶等）用于底物降解和风味化合物的生产，同时制曲过程中产生的代谢物进一步转化为末端风味成分的中间体。
大曲中微生物菌系时刻在进行复杂的动态变化，其中丰度最高的微生物类群是霉菌，其次为酵母和细菌。霉菌为大曲提供了主要的糖化动力，然而其多性远低于酵母和细菌。因，研究者对大曲霉菌类群投入了更多的关注，霉菌在大曲中起到的作用和影响逐渐被剖析，其中曲霉主要为曲酒的酿造提供糖化力、液化力、蛋白质分解能力及多种有机酸等物质，以米根霉为主的根霉可产生较多的胞外酶和胞内酶，毛霉生成的分解蛋白质酶系对曲酒发酵至关重要，而青霉、犁头霉基本属于有害菌。虽然酵母菌为大曲提供了主要的发酵动力，细菌为大曲提供了主要的生香动力，但是与霉菌相比，目前对大曲酵母和细菌类群的研究仍然不够深入。
酵母作为大曲微生物区系中最重要的类群之一，不仅主导了乙醇的产生，而且大量产生酯类、醇类、酮类、烯类、酚类等挥发性化合物，对大曲品质有决定性的影响。谭崇尧等使用高通量测序法对不同地域浓香型大曲的微生物结构进行了分析，结果表明川派浓香型大曲中芽孢杆菌属的丰度远高于其他地区。另外，一些研究发现芽孢杆菌不仅能够产生大量挥发性化合物和有机酸影响大曲的微生物菌系和风味，而且还具有显著改善中国白酒的品质、安全性和风味的潜力。因，本研究通过纯培养分离技术监测四川浓香型大曲整个制曲过程中酵母菌、芽孢杆菌的动态演化以及相应的动态工艺指标，科学分析它们之间的关联特性，为优质大曲的酿造和大曲自动化制备及其改良提供科学依据。同时，明确大曲的成熟期与品质下降期，从而更好地指导酿酒生产。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大曲品来源于四川省成都蜀之源酒业有限公司，于秋季9月17日开始采。将整个大曲360 d的制作及贮存周期分为曲房培菌期（1～30 d）和曲库贮存期（31～360 d），进行分期取。曲房培菌期采取5 个品（1、3、9、15、30 d）；曲库贮存期采取6 个品（60、90、120、180、210、360 d）。每次分别从3 个曲库采集3 个平行，采方式为从曲堆的上层、中层、底层各抽取3 块曲砖，粉碎后混匀，取1 000 g曲粉于无菌密封袋，20 ℃贮存备用。
Taq DNA聚合酶、dNTP和DL2000 Marker 宝生物工程（大连）有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；实验涉及的所有缓冲液与常备试剂均为国产分析纯试剂，购于成都迪维普科技有限公司。
1.2 仪器与设备
P C R 仪、电泳仪及凝胶成像分析系统 美国 Bio-Rad公司；离心机 德国Eppendorf公司；恒温培养箱、SPX-150B-Z型生化培养箱 上海博迅实业有限公司；摇床、超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 酵母菌和芽孢杆菌的分离
准确称取不同阶段的大曲粉末1 g，加入100 mL无菌水，置于摇床上150 r/min、30 min，静置，取其上清液进行系列10 倍梯度稀释。首先采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose agar，YEPD）培养基对酵母菌进行选择性分离，形态观察用Wallerstein Laboratory（WL）培养基。其次是芽孢杆菌的分离，将不同浓度的稀释液分别接种到富集培养基中进行富集（37 ℃、 150 r/min培养24 h），随后对培养液进行菌体杀灭和富集芽孢（90 ℃，5 min），在LB培养基、乙酸钠培养基和苏氨酸液体发酵培养基上进行平板分离。
1.3.2 菌株的初步鉴定
将分离的所有菌株经过初步形态聚类，选取代表菌株用十六烷基三甲基溴化铵法提取菌株DNA，采用通用保守引物ITS1和ITS4对酵母菌株的5.8S rDNA-ITS区进行基因扩增，采用通用保守引物27f和1541r扩增芽孢杆菌的16S rRNA基因片段。扩增产物送上海生物工程技术服务有限公司（Sangon）纯化并测序，将所测得的序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，结合形态学分析和序列比对对菌株进行排重和初步鉴定。
1.3.3 工艺指标检测
使用温度计测量曲堆中心温度；制曲理化因子（水分、酸度、淀粉含量）和大曲质量指标（糖化力、液化力、发酵力、酯化力）的测定按照QB/T 4257ü 2011《酿酒大曲通用分析方法》进行。
1.3.4 相关性分析
物种多 性与工艺指标的关系用冗余分析（redundancy analysis，RDA）排序方法分析，以解释大曲生产过程中关键微生物类群、工艺指标与大曲品质的关系。RDA的所有数据均进行对数转换，其中酵母菌和芽孢杆菌物种数以及物种多性作为响应变量，工艺指标作为解释变量。先用species-sample进行趋势对应分析（detrended correspondence analysis，DCA），得出各排序轴中最大梯度为2.2 SD，故选择线性模型RDA排序方法；对变量的显著性进行蒙特卡洛置换检验，筛选出影响显著的因子，以上分析均在CANOCO 5.0软件中完成。
2 结果与分析
2.1 可培养酵母菌和芽孢杆菌的分离与动态变化
从11 个品中分离得到342 株纯培养物，其中酵母菌194 株，芽孢杆菌148 株（表1）。结合形态学和分子生物学鉴定对菌株排重。结果表明，所有的序列与数据库中已有序列的相似度都大于97%。依据分析结果将194 株酵母鉴定归属于子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）的9 个属（Candida、Pichia、Millerozyma、Saccharomyces、Kazachstania、Wickerhamomyces、Kluyveromyces、Rhodotorula、Jaminaea）。子囊菌门的7 个属（Candida、Pichia、Millerozyma、Saccharomyces、Kazachstania、Wickerhamomyces、Kluyveromyces）都集中在酵母菌目（Saccharomycetales），包含有10 个典型代表菌株（表1），即异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）、酿酒酵母（Saccharomy cecerevisia）、近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、拟郎比可假丝酵母 （C. pseudolambica）、热带假丝酵母（C. tropicalis）、膜璞毕赤酵母（Pichia membranifaciens）、Millerozyma acaciae和少孢哈萨克斯坦酵母（Kazachstania exigua）；而属于担子菌门的2 个属各自均只有一个典型菌种，分别为胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）和Jaminaea angkorensis。从酵母的整体分布上看，大曲发酵前期（0～3 d），虽然只分离得到8 株酵母，但是它们分别属于5 个不同的种，表明时酵母的多性较高而丰度不够。在发酵中期（9～15 d），酵母数量和种类相对稳定，仅分离出10 株酵母菌，而发酵前期R. mucilaginosa未被分离到，显然时期高品温对大曲酵母存在显著的抑制作用。发酵后期（30 d）酵母的多性和丰度显著增高，分别获得9 个酵母菌种，含48 株纯培养物。在贮存期前期（60～120 d），酵母的多性和丰度仍保持微弱增长趋势，而在贮存后期（180～360 d）酵母菌的多性和丰度显著下降，贮存期结束时（360 d）仅分得4 个酵母菌种的9 株纯培养物。148 株芽孢杆菌被鉴定为8 个种（表1）， 分别为枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）、弯曲芽孢杆（B. flexus）、暹罗芽孢杆菌（B. s i a m e n s i s）、蜡质芽孢杆菌（B. cereus）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）、巨大芽孢杆菌（B. megaterium）和霍内克芽孢杆菌（B. h o r n e c k i a e）。在发酵期芽孢杆菌的多性和丰度一直处于较高水平，而在贮存期时芽孢杆菌的多 性和丰度一直保持下降趋势，其中 B. licheniformis在所有品中都存在，而B. subtilis的菌株数量最多，占到31.08%。虽然在11 个品中分离的芽孢杆菌数量有较大的变化，但是芽孢杆菌类群一直保持着丰富的多性。
表 1 11 个样品中酵母菌和芽孢杆菌典型菌株的分离情况统计
Table 1 Typical species of the culturable yeast and Bacillus detected in 11 samples
2.2 大曲理化指标变化
表 2 浓香型大曲发酵过程中理化指标的动态变化
Table 2 Dynamic changes in physicochemical indexes during the fermentation of Luzhou-flavor Daqu
浓香型大曲生产过程中最重要的控制条件是堆芯温度、水分和酸度，实际生产中通常用这3 个条件控制曲房培菌期的生产状况；外，淀粉也揭示了大曲生产过程中主要的能量代谢情况。如表2所示，曲块堆芯温度在培菌期前3 d快速增加至49 ℃，并在第9天升到最高温度60 ℃，达到中高温大曲的顶温范围，随后堆芯温度缓慢降低，直至第15天仍有55 ℃。水分是大曲生产过程中另一个关键点，在培菌期前15 d快速降低至16.27%，损失了17.55%的水分，而在之后的15 d损失了3.01%的水分，培菌期结束时仅为13.26%；在贮存期水分略有降低，但是变化不显著。大曲的酸度在培菌期前3 d由0.16 mmol/10 g快速增加至1.77 mmol/10 g，酸度升高主要是由产酸微生物在大曲中进行有机酸代谢，酸度在第15天快速下降至0.96 mmol/10 g；而在培菌期稳定在1 mmol/10 g左右。淀粉作为最主要的碳源，其变化趋势直接表征了大曲生产过程中微生物的能量代谢状况。11.39%的淀粉在发酵前15 d被利用，2.70%的淀粉在发酵后15 d被利用，而整个贮存期则有9.10%的淀粉被利用。
2.3 大曲质量指标的变化
白酒酿造过程通常用糖化力和液化力衡量大曲的淀粉转化能力，用发酵力和酯化力作为评估大曲产酒产香能力的关键指标。液化力与糖化力变化趋势大致一致（图1），都在培菌前期快速增加后小幅下降，接着在培菌中后期又逐渐回升，而在贮存期总体上呈下降趋势。液化力在第9天达到最大值2.17 g/（gg h），第9～15天逐渐下降至1.09 g/（g•h），在培菌中后期又逐渐上升至1.27 g/（g•h），而在贮存期，液化力一直下降，结束时仅剩0.72 g/（g•h）。糖化力在前9 d快速增加至447.22 mg/（gg h），接着缓慢下降至 425.76 mg/（gg h）（第15天），随后缓慢增加至贮存期第180天的477.61 mg/（gg h），而在贮存期的第181～360天，大曲损失了180.84 mg/（gg h）的糖化力。发酵力反映了大曲发酵产乙醇的能力，酯化力反映了大曲微生物生产酯类物质的能力，如图2所示，培菌期前9 d酯化力和发酵力快速升高，培菌期第0天品的酯化力和发酵力分别为31.52 mg/（50 gg 7 d）和 0.2 8 g/（0.5 g g 7 2 h），第9 天分别升高至 738.58 mg/（50 gg 7 d）和1.02 g/（0.5 gg 72 h）。随后酯化力持续增加，在贮存期第9 0 天时高达 944.57 mg/（50 gg 7 d），而在贮存期的第181～360天，酯化力快速下降至475.66 mg/（50 gg 7 d）。不同的是，发酵力在培菌期第9～15天快速下降后又缓慢回升，培菌期结束时逐渐稳定在1.13 g/（0.5 gg 72 h），发酵力在贮存期呈缓慢降低的趋势，贮存期结束时为 0.69 g/（0.5 gg 72 h）。同在整个贮存期的第90～180天，4 个质量指标都趋于稳定并处于较高水平，而在贮存期的第180～360天却大幅下降，综合考虑，本研究所用大曲在生产周期第90天后品质达到稳定成熟；生产周期第90～180天为大曲最佳使用期。
图 1 浓香型大曲生产过程中糖化力、液化力的动态变化
Fig. 1 Dynamic changes in saccharifying power and liquefying power during the fermentation of Luzhou-flavor Daqu
图 2 浓香型大曲生产过程中酯化力、发酵力的动态变化
Fig. 2 Dynamic changes in esterifying power and fermenting power during the fermentation of Luzhou-flavor Daqu
2.4 浓香型大曲生产中工艺指标与酵母菌和芽孢杆菌类群的关联性分析
制曲工艺通过温度、水分和酸度的调控，筛选和富集了大量有益微生物。微生物的演替和代谢最大化积累了各种功能酶和风味物质，同时通过曲房贮存平衡微生物菌系提高大曲品质。因，了解大曲中起主要作用的酵母菌和芽孢杆菌与关键指标的关联性极其重要。RDA（图3）展示，堆芯温度、水分和淀粉含量与多种微生物类群负相关，其中与B. velezensis、 C. parapsilosis、J. angkorensis、K. marxianus和 S. cerevisiae呈现显著的负相关（P＜0.05）。酸度与B. siamensis、B. licheniformis和B. cereus显著正相关 （P＜0.05），表明这3 株芽孢杆菌可能具有良好的产酸或耐酸能力。4 个质量指标之间本身具有较强的正相关，其中B. horneckiae和B. subtilis与液化力具有显著的正相关（P＜0.05）；K. exigua和C. tropicalis与酯化力、糖化力具有显著的正相关（P＜0.05）； W. anomalus和B. megaterium与发酵力具有显著的正相关（P＜0.05），表明这6 株菌是潜在的功能菌，对大曲的品质起着重要影响。
图 3 大曲生产中工艺指标与酵母菌和芽孢杆菌类群的关联性分析Fig. 3 Correlation analysis of the communities of yeast and Bacillus with process parameters during the fermentation of Luzhou-flavor Daqu
3 讨 论
目前，对于浓香型大曲的工艺参数、微生物菌系演替及其功能作用等已经有一些研究，但是学者们往往聚焦于曲房培菌期，而对于浓香型大曲成熟期、贮存期的微生物、酶学及其工艺参数指标研究的相对较少，且不系统。本研究旨在多度系统分析四川浓香型大曲整个生产周期中酵母菌和芽孢杆菌多性变化，并结合理化指标和质量指标，探索浓香型大曲关键性微生物类群中的酵母菌和芽孢杆菌在大曲品质形成中的作用。本研究发现四川浓香型大曲在第90～180天期间品质稳定成熟，是酿酒最好的使用期。成熟后的大曲糖化力、液化力、酯化力和发酵力都达到行业标准，其中第90天时发酵力高达1.15 g/（0.5 g•72 h），而宋瑞滨等研究的优质中高温大曲的发酵力仅为0.58 g/（g•72 h）；同时酯化力在第90天时最高为944.57 mg/（50 g•7 d），也远超行业标准的最低酯化力150 mg/（50 g•7 d）。大曲在第180天后质量开始剧烈下降，其中糖化力与酯化力下降幅度最大；如果以第90天为优质大曲，那么贮存期结束时已经损失了相当于优质大曲36.89%的糖化力和49.64%的酯化力。因，贮存6 个月后的大曲由于品质的下降，应加强贮存方法的改进，延长其高品质期；同时，在未来酿酒过程中应加强与新成熟大曲的混用，弥补其不足。当然，由于贮存条件、制曲工艺和区域生态环境的差异，应实时检测大曲质量，更好地指导酿酒生产。
本研究表明四川浓香型大曲具有丰富的可培养酵母菌和芽孢杆菌多性，共分离到9 个属的酵母菌以及8 个种的芽孢杆菌。与以往研究相比，首次在浓香型大曲中分得J. angkorensis和B. velezensis。外，Yang Jiangang等同对浓香型大曲生产过程中的微生物类群进行选择性分离，发现成曲中细菌以枯草芽孢杆菌亚种为优势菌，酵母类群以扣囊复膜孢酵母（S. fibuligera）为优势菌。在本研究中枯草芽孢杆菌同为优势菌，而扣囊复膜孢酵母并未分离得到，我国白酒制曲是开放式自然制曲，存在大曲的品质与微生物群落的不稳定性，进而影响白酒的品质与稳定性。
RDA结合工艺指标对大曲酵母菌和芽孢杆菌类群类群演化进行关联性分析，发现了6 种关键微生物类群，分别是3 种酵母菌（K. exigua、C. tropicalis和 W. anomalus）和3 种芽孢杆菌（B. horneckiae、B. subtilis和B. megaterium），它们分别与4 个质量指标显著正相关，这将为未来开发纯种制曲提供科学依据。外， B. cereus、B. licheniformis和B. siamensis与酸度显著相关，有研究表明B. cereus和B. licheniformis是白酒生产中的重要产酸菌，则大曲生产过程中严格控制酸度有助于调控和平衡大曲中的微生物组成与数量，同时产生的有机酸还将与醇类化合物反应产生浓郁的白酒风味化合物。关联性分析发现4 个质量指标与堆芯温度都没有显著相关关系，而Xiao Chen等研究发现以堆芯温度为代表的生物热是影响中高温大曲微生物群落结构的关键环境因子，则制曲过程中温度对大曲品质调控可能更多的是间接作用，因在浓香型大曲生产工艺优化时应更全面了解这种间接作用。
本研究在分析大曲生产过程中酵母菌和芽孢杆菌类群演替的基础上，结合工艺指标检测，揭示了大曲生产过程中酵母菌和芽孢杆菌类群受理化因子的调控作用以及对大曲品质的影响，这将为大曲生产工艺中控温、控水、排酸，优质大曲的酿造和大曲自动化制备与改良提供很好的科学参考。然而大曲微生物类群是一个完整的共生体，酵母菌和芽孢杆菌发挥作用离不开其他微生物的存在。本研究直接将酵母菌和芽孢杆菌从大曲微生物菌系中剥离出来，不考虑与其他微生物类群的相互作用，如霉菌、醋酸菌、乳酸菌和放线菌等，是对大曲微生物类群调控和功能作用的浅层研究。采用更全面的微生物多性分析技术，研究大曲生产过程中微生物类群受理化因子的调控作用以及对大曲品质的影响，将是未来更好地理解大曲发酵原理的新思路。
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Diversities of Culturable Yeast and Bacillus and Their Relationship with Process Parameters during the Production of Sichuan Luzhou-Flavor Daqu
XIANG Huiping1, LIN Yijin1, GUAN Tongwei1,*, ZHANG Jiaxu2, SHANG Hongguang2, ZHAO Xiaolin2, JIAO Shirong1, FENG Xu1, YANG Yang1
(1. Key Laboratory of Food Biotechnology in Colleges and Universities in Sichuan Province, Institute of Microbiology, Xihua University, Chengdu 610039, China; 2. Shuzhiyuan Liquor Co. Ltd., Chengdu 611335, China)
Abstract: This study was aimed at investigating the diversities of culturable yeast and Bacillus during the production of Sichuan Luzhou-flavor Daqu and at analyzing their relationship with process parameters (physicochemical and quality indexes). The process parameters were monitored according to the national light industry standard QB/T 4257-2011, and the selective isolation of yeast and Bacillus from 11 samples was performed by using pure culture technique. A total of 194 yeast strains were obtained and after molecular biological identification, they were assigned to nine genera that belong to the phyla Ascomycota and Basidiomycota, seven of which were clustered into the order Saccharomycetales. A total of 148 strains of Bacillus were obtained and identified as 8 species, with Bacillus subtilis being the dominant one. In addition, the best usage time of Sichuan Luzhou-flavor Daqu was between day 90 and 180 of the production process, and the quality of Daqu decreased greatly with the prolongation of storage period. Redundancy (RDA) analysis showed that physicochemical indexes were mainly negatively correlated with the diversities of yeast and Bacillus. There were six key species contributing to the quality of Daqu, including Kazachstania exigua, Candida tropicalis, Wickerhamomyces anomalus, B. subtilis, B. horneckiae and B. megaterium. There were abundant species diversities of yeast and Bacillus during the production process, and they were not only regulated by the physicochemical indexes during the production process, but also affected the quality of Daqu.
Keywords: Luzhou-flavor Daqu; yeast; Bacillus; process parameters; correlation analysis
收稿日期：2018-12-17
基金项目：成都市产学研联合实验室资助项目（17205422）；成都市高校人才创新服务资助项目（2017-RC03-00014-CG）；白酒产业发展科技服务协议项目（172243）
第一作者简介：向慧平（1993ü ）（ORCID: 0000-0002-0703-8277），男，硕士研究生，研究方向为食品工程。E-mail: 2953292369@qq.com
*通信作者简介：关统伟（1978ü ）（ORCID: 0000-0002-2362-5279），男，副教授，博士，研究方向为微生物系统学、食品工程与生物技术。E-mail: guantongweily@163.com
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181217-179
中图分类号：TQ925.7
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2020）02-0196-06
引文格式：向慧平, 林宜锦, 关统伟, 等. 四川浓香型大曲生产中酵母菌、芽孢杆菌与工艺指标的关联性分析. 食品科学, 2020, 41(2): 196-201. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181217-179. http://www.spkx.net.cn
XIANG Huiping, LIN Yijin, GUAN Tongwei, et al. Diversities of culturable yeast and Bacillus and their relationship with process parameters during the production of Sichuan Luzhou-flavor Daqu. Food Science, 2020, 41(2): 196-201. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181217-179. http://www.spkx.net.cn
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