面向规模化应用的竹荪多糖液态深层 发酵工艺优化
面向规模化应用的竹荪多糖液态深层 发酵工艺优化冯 杰，冯 娜，刘艳芳，唐庆九，周 帅，刘 方，张劲松，杨 焱*
（农业部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心，上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海市农业科学院食用菌研究所，上海 201403）
摘 要：利用规模化生产工艺提高竹荪菌丝体胞内多糖得率，通过对竹荪菌丝体液态深层发酵培养基组分的筛选，采用单因试验与Box-Behnken响应面法确定竹荪菌丝体液态深层发酵的最佳培养基配方为：葡萄糖32.3 g/L，酵母粉4.5 g/L，磷酸氢钾2.1 g/L，硫酸镁2.5 g/L。在条件下竹荪胞内多糖得率的预测值为1.23 g/L，摇瓶实验验证胞内多糖得率为1.19 g/L，与预测值相当。在5、30 L和50 L发酵罐中验证胞内多糖得率分别达到1.43、1.28 g/L和1.26 g/L，分别高于预测值16.26%、4.06%和2.43%。本研究优化获得的竹荪菌丝体液态深层发酵工艺有效促进了竹荪胞内多糖的高产，该工艺可为竹荪多糖的规模化生产应用提供较好的参考。
关键词：竹荪多糖；菌丝体；发酵工艺；优化；规模化生产
竹荪又名竹笙、竹参，在真菌分类学上隶属于真菌界（Eumycotina）、担子菌亚门（Basidiomycotina）、腹菌纲（Gasteromycetes）、鬼笔目（Phallales）、鬼笔科（Phallaceae）、竹荪属（Dictyophora）。竹荪具有一定的防腐作用，具有较高的营养保健价值，被人们誉为“真菌皇后”，是一种集营养、保健、理疗于一身的绿色食品。竹荪子实体中富含蛋白质、氨基酸、多糖、维生、微量元等，具有抗肿瘤、抗菌、抗血栓、降血脂、增强人体免疫力等生物活性。
竹荪多糖是竹荪中的主要生物活性成分之一，目前关于竹荪多糖结构的研究，多数还都只是停留在竹荪多糖组成上，对其分子结构及构象的研究报道较少，有研究者做过竹荪多糖链的一级结构研究。赵凯等研究了竹荪多糖提取物，得到的竹荪多糖化学结构主要是β-甘露糖；而连宾等从竹荪中提取的多糖化学结构为半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖杂多糖。王家堂等所用的方法则与上述有所不同，其采用衍生化后通过气相分析、红外图分析和核磁共振分析方法证明出：竹荪多糖以葡萄糖为主，并同时含有半乳糖和甘露糖，为均一的多糖组分，分子构型为β型，且竹荪多糖也是以β-(1,3)-D-葡聚糖为主链，带有(1,6)葡萄糖支链的化学结构。
竹荪子实体人工栽培周期长且容易污染杂菌，受病虫害侵蚀，耗费人力多、场地大，栽培环境受海拔与温度影响十分明显，生产规模受到一定限制。 而深层发酵技术是较为先进的技术，其特点是发酵周期短、劳动生产率高、劳动强度低、占地面积少等。采用深层发酵技术直接生产竹荪营养菌丝体，可以克服上述不足，不仅可将获得的菌丝体作为液体菌种或食品添加剂，还可从中提取生理活性物质，这为竹荪生产及深加工开创了新路。
目前国内外关于深层发酵竹荪菌丝体及发酵液多糖的研究报道较少，较多为对其抗氧化性能与抗菌性的检测，或是对其氨基酸含量的分析与自由基清除能力的检验。国内外也有少量研究者对竹荪的深层发酵进行研究，但其主要侧重点是如何获取更高的生物量。只有少部分研究者关注竹荪的功效成分多糖，但往往都仅局限于小试的摇瓶实验，属于基础研究阶段，并且其生物量和活性产物多糖得率比较低，生产成本高，其工艺需进一步提升，若要达到规模化和产业化的生产竹荪多糖还需进行大量的研究。
基于，本研究拟通过培养基种类筛选，单因试验获得影响竹荪菌丝体液态深层发酵胞内多糖得率的各营养因子的参数，进一步采用Box-Behnken法对各营养因子参数及其交互作用进行研究，以期获得竹荪胞内多糖得率最优的培养基组成，并分别在摇瓶和5、30、50 L规模发酵罐上进行验证，为竹荪多糖规模化生产提供理论依据和参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
供试菌株Dictyophora indusiata ZS03，由中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心上海食用菌分中心提供。
1.1.2 培养基
斜面和平板培养基（马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基）购自美国BD公司，按照39 g溶于1 000 mL蒸馏水的比例配制，121 ℃灭菌20 min 后备用。
种子培养基：葡萄糖30 g/L，酵母粉1.5 g/L，磷酸氢钾2 g/L，硫酸镁2 g/L，121 ℃条件下灭菌30 min后备用。
发酵基础培养基：葡萄糖30 g/L，酵母粉1.5 g/L，磷酸氢钾2 g/L，硫酸镁2 g/L，121 ℃条件下灭菌30 min后备用。
1.2 仪器与设备
ZWY-2102双层恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；BIOTECH-5BGZ-50JS 5 L和50 L发 酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司；Synergy HT多功能酶标仪 美国BioTek公司。
1.3 方法
1.3.1 培养条件
菌株活化：将配制好的平板培养基于121 ℃条件下灭菌20 min后倒入9 cm平板冷却备用。在无菌条件下挑取冷冻管保藏菌种于平板培养基中，在26 ℃恒温箱中培养，待菌丝长满平板后备用。
种子液培养：将平板活化后的菌株取3 块约0.2 cm2大小的菌块接种于装有100 mL液体种子培养基的250 mL三瓶中，在摇床上于26 ℃、150 r/min培养7 d得种子液。
发酵罐培养：将制备好的液体菌种分别转接至5、30 L和50 L发酵罐中进行培养，发酵罐装液量为总体积的70%，接种量10%（V/V），搅拌转速100 r/min，培养温度26 ℃，通气比1.0 L/（Lg min），培养至144 h 结束发酵。
1.3.2 指标测定
菌丝体干质量的测定：取发酵液50 mL，15 000h g离心20 min后弃上清液，沉淀的菌丝体用去离子水洗涤 3 次，收集菌丝体后放在60 ℃的烘箱中烘干至质量恒定，精确称质量，以g/L计。每组实验设定3 个平行，测定平均值。
总糖的测定：将烘干后的竹荪菌丝体研磨成粉末，称取100 mg加入100 mL蒸馏水，沸水浴提取3 h。冷却后定容至100 mL，将溶液15 000h g离心15 min后取上清液备用。取稀释一定倍数的上清液品1 mL到试管中（设3 个重复），加入5%苯酚（重蒸苯酚）0.5 mL，混匀，再加入2.5 mL浓硫酸，振荡，沸水浴中加热15 min后在冷水下迅速冷却，用酶标仪在490 nm波长处检测吸光度，根据标准曲线计出总糖含量，总糖含量以占干菌丝质量分数计（%）。
还原糖的测定：将总糖测定时制备的上清液稀释一定倍数，取稀释后的品液2 mL到试管中（设3 个重复），加入3 mL 3,5-硝基水杨酸试剂，混匀，沸水浴中加热5 min，流动水冷却后用蒸馏水定容至25 mL，摇匀后用酶标仪在520 nm波长处检测吸光度，根据标准曲线计出还原糖含量，还原糖含量以占干菌丝质量分数计（%）。
胞内多糖质量分数和多糖得率的计如式（1）、（2）所示：
1.3.3 工艺优化
1.3.3.1 竹荪多糖发酵培养基中碳源和氮源种类的筛选
碳源的筛选：在供试基础液体培养基中分别添加 30 g/L葡萄糖、30 g/L蔗糖和30 g/L麦芽糖为碳源。基础培养基选用酵母粉1.5 g/L、磷酸氢钾2 g/L、硫酸镁2 g/L，研究不同碳源对竹荪胞内多糖发酵的影响。各实验设3 个重复。
氮源的筛选：在供试基础液体培养基中分别添加1.5 g/L酵母粉、1.5 g/L玉米粉和1.5 g/L黄豆粉为氮源。基础培养基选用葡萄糖30 g/L、磷酸氢钾2 g/L、硫酸镁2 g/L，研究不同氮源对竹荪胞内多糖发酵的影响。各实验设3 个重复。
1.3.3.2 竹荪多糖发酵碳源和氮源单因试验设计
根据上述培养基中碳源和氮源种类筛选结果，选择最佳碳源中的葡萄糖和氮源中的酵母粉用量2 个因，分别考察每种因在4 个水平下的竹荪胞内多糖得率，因与水平设计如表1所示。
表 1 竹荪多糖培养基中碳源和氮源单因素筛选
Table 1 Levels of carbon and nitrogen sources used in one-factor-at-a-time design
1.3.3.3 Box-Behnken法优化竹荪多糖发酵培养基设计
根据单因试验结果，选择对竹荪胞内多糖得率有显著影响的因，综合单因试验结果和基础培养基配方，选取葡萄糖、酵母粉、磷酸氢钾和硫酸镁用量4 个因，采用Box-Behnken试验设计方法，因及水平如 表2所示。利用Design Expert 8.0.6进行数据分析，用F检验评价数学模型方程的显著性，方程的拟合性由决定系数R2确定。
表 2 Box-Behnken法优化竹荪多糖发酵培养基的因素与水平
Table 2 Codes and levels of independent variables used in Box-Behnken design
1.4 数据与图像处理
数据采用Excel 2013软件进行处理，应用Origin 8.5软件进行绘图，应用DPS v7.05软件进行显著性分析，利用Design Expert V8.0.6软件对数据进行回归分析。
2 结果与分析
2.1 竹荪多糖发酵培养基中碳源和氮源种类的筛选
图 1 发酵培养基中碳源和氮源种类对竹荪菌丝体和胞内多糖发酵的影响
Fig. 1 Effects of carbon and nitrogen sources on mycelial biomass and
polysaccharide production by D. indusiata
同一指标大写字母不同表示差异极显著，P＜0.01。
由图1可以看出，碳源种类对竹荪菌丝体液态深层发酵菌丝体和胞内多糖得率有明显影响，其影响由高到低依次为葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，差异极显 著（P＜0.01）。实验结果表明葡萄糖是最适合菌丝体生长产生胞内多糖的碳源。在不同种类的氮源实验中，竹荪菌丝体干质量由高到低的氮源依次为酵母粉、黄豆粉和玉米粉（P＜0.01），竹荪胞内多糖得率由高到低的氮源依次为酵母粉、玉米粉和黄豆粉（P＜0.01）。实验结果表明酵母粉是最适合菌丝体生长产生胞内多糖的氮源。
2.2 竹荪多糖发酵培养基中碳源和氮源用量的单因优化
图 2 发酵培养基中葡萄糖（A）和酵母粉（B）用量对竹荪菌丝体和 胞内多糖发酵的影响
Fig. 2 Effects of glucose (A) and yeast power (B) concentration on mycelial biomass and polysaccharide of D. indusiata
如图2A所示，葡萄糖用量由15 g/L增加到60 g/L时，竹荪菌丝体干质量和胞内多糖得率有大幅度提升。葡萄糖用量为30 g/L时，竹荪菌丝体干质量和胞内多糖得率最高，分别为9.72 g/L和0.89 g/L，葡萄糖用量继续增加时，其菌丝体干质量和胞内多糖得率反而有小幅度减少。分析原因可能是过高的葡萄糖用量会抑制竹荪菌丝体的生长，进而影响胞内多糖的合成，因，合适的葡萄糖用量对竹荪胞内多糖的合成影响较大。从单因试验结果可知，30 g/L是竹荪菌丝体液体发酵胞内多糖最佳葡萄糖用量。
如图2B所示，当酵母粉用量为4.5 g/L时，竹荪菌丝体干质量和胞内多糖得率最高，分别为9.95 g/L和 0.88 g/L。当酵母粉用量增加至6.0 g/L时，其多糖得率开始降低。这可能是由于高用量的酵母粉对菌丝体的生长产生了抑制作用。根据单因试验结果，4.5 g/L是竹荪菌丝体液态深层发酵胞内多糖最佳酵母粉用量。
2.3 Box-Behnken法优化竹荪多糖的发酵培养基组成
2.3.1 模型建立和显著性检验
根据单因试验结果和原基础培养基配方，以葡萄糖（X1）、酵母粉（X2）、磷酸氢钾（X3）和硫酸镁（X4）4 个因为自变量，以竹荪菌丝体胞内多糖得率（Y）为响应值，利用Box-Behnken试验设计，进行响应面分析，试验设计及结果如表3所示。
表 3 Box-Behnken法优化竹荪多糖的发酵培养基组成
Table 3 Box-Behnken design with experimental results
利用Design Expert V8.0.6软件对数据进行次多元回归拟合，得到竹荪菌丝体液态深层发酵胞内多糖得率（Y）对编码自变量之间的次多项回归方程为：
Y=1.180.097X10.048X20.16X30.15X4 0.068X1X20.028X1X30.17X1X40.12X2X30.073X2X4 0.26X3X40.37X120.30X220.15X320.18X42
方差分析检验多项式方程对试验数据拟合的显著性，如表4所示。次方程模型的F值为12.59，表明该模型显著，可以有效拟合试验数据，该模型F值由于噪音因影响发生的P值小于0.01。从表4可以看出，X1、X3、X4、X1X4、X3X4、X12、X22、X32和X42是显著项。整个模型的拟合度R2为0.926 4，表明该次方程模型可以解释和预测92.64%的变量响应，在本研究中可以很好地拟合试验数据。
表 4 Box-Behnken法优化竹荪多糖的发酵培养基组成方差分析
Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial model
注：P＜0.05，影响显著；P＜0.01，影响极显著。R2=0.926 4；R2Adj =0.852 8。
2.3.2 验证实验
对拟合出的次多项式回归方程分别求X1、X2、X3和X4的偏导数，求得各个因的极值点：X1=32.3，X2=4.5，X3=2.1，X4=2.5。即竹荪菌丝体发酵培养基组成的配比为葡萄糖32.3 g/L、酵母粉4.5 g/L、磷酸氢钾2.1 g/L和硫酸镁2.5 g/L时，竹荪菌丝体合成胞内多糖的最高理论值为1.23 g/L。
2.3.2.1 摇瓶验证实验
为验证模型的可行性，分别对实验初始条件、单因试验最优条件、响应面中心组合模型得出的最佳条件进行检验和验证。如表5所示，模型得出的最佳条件即验证组的胞内多糖得率为1.19 g/L，与理论值1.23 g/L接近。验证组胞内多糖得率分别是初始组、单因试验最优组/中心组的1.38、1.25 倍，采用响应面法优化后显著提高了竹荪菌丝体胞内多糖得率。
表 5 Box-Behnken法优化竹荪多糖的发酵培养基组成摇瓶 实验验证结果
Table 5 Results of confirmation using shake flask experiments
2.3.2.2 发酵罐验证实验
为更好地将上述响应面的优化结果应用于实际生产，对响应面模型得出的最佳条件结合发酵罐的最佳控制条件（本研究团队前期研究基础）分别在5、30 L和50 L规模发酵罐中进行逐步扩大实验。由图3A可知，在5 L发酵罐上，竹荪菌丝体在0～48 h增加较少，之后进入对数期，大幅度增加，在第144小时达到最大值16.11 g/L；胞内多糖在稳定期合成较少，进入对数期后稳定增多，在第144小时达到最大值1.43 g/L。由图3B可知，在30 L发酵罐上，竹荪菌丝体在0～24 h增加较少，之后进入对数期，大幅度增加，在第144小时达到最大值12.10 g/L；胞内多糖在稳定期合成较少，进入对数期后稳定增多，在第144小时达到最大值1.28 g/L。由图3C可知，在50 L发酵罐上，竹荪菌丝体在0～24 h增加较少，之后进入对数期，大幅度增加，在第144小时达到最大值13.69 g/L；胞内多糖在稳定期合成较少，进入对数期后稳定增多，在第144小时达到最大值1.26 g/L。综合图3分析可知，在不同发酵规模下，竹荪菌丝体的生长较为一致，随着菌丝体生长进入对数期后，胞内多糖的合成也进入快速增长阶段，当菌丝体生长进入稳定期后，胞内多糖的合成也基本达到最大值。在发酵罐控制条件一致时，不同发酵规模下的竹荪菌丝体生长基本一致，胞内多糖的含量也很稳定，因，本研究获得的发酵条件可以考虑进一步继续放大以应用于工业化生产。
图 3 在5 L（A）、30 L（B）和50 L（C）发酵罐中优化培养基条件下竹荪多糖发酵过程曲线
Fig. 3 Time-course curves of mycelial biomass and polysaccharide production by D. indusiata using the optimized medium in 5 L (A), 30 L (B) and 50 L (C) fermentors
2.4 不同发酵规模下竹荪多糖的发酵参数比较
为更好地比较不同发酵规模下竹荪胞内多糖的发酵结果，将实验数据进一步整理，得到5、30 L和50 L发酵罐条件下竹荪菌丝体液态深层发酵过程参数，如表6所示。结合Box-Behnken法优化结果，竹荪菌丝体液态深层发酵过程参数比对照组有显著提高。5、30 L和50 L发酵罐验证实验中的菌丝体干质量、菌丝体对葡萄糖得率、胞内多糖得率、胞内多糖质量分数、胞内多糖生产强度和胞内多糖对葡萄糖得率均优于对照组结果，且在不同规模下的发酵结果也很稳定，没有较大的波动，可见优化后的培养条件有助于提高竹荪菌丝体中的胞内多糖，且随着发酵规模的逐步扩大结果也很稳定。
表 6 在不同规模发酵罐中优化培养基条件下竹荪多糖发酵参数比较
Table 6 Comparison of fermentation parameters for production of D. indusiata polysaccharides using the optimized medium in 5-, 30- and 50-L fermentors
注：胞内多糖生产强度=胞内多糖得率/发酵时间；胞内多糖对葡萄糖得率=胞内多糖得率/（初始葡萄糖质量浓度终葡萄糖质量浓度）；菌丝体对葡萄糖得率=菌丝体干质量/（初始葡萄糖质量浓度终葡萄糖质量浓度）。
3 讨 论
竹荪提取物的有效成分主要为多糖、多种氨基酸及微量元等，其中多糖是所有生命有机体的重要组成部分，能增强机体免疫能力，具有抗肿瘤、降血脂、抗菌、抑菌等作用。也有研究表明，竹荪发酵菌丝体有特殊的抑菌防腐功能，这可能与菌丝体中的多糖有关。目前关于竹荪菌丝体液态发酵胞内多糖的研究则鲜见报道。何慧通过探索长裙竹荪液态发酵菌丝多糖的最佳提取条件和纯化方法后使得多糖得率为13.40 mg/g（以干菌粉计）。涂国云等通过酶法提取竹荪深层发酵菌丝体多糖，使得竹荪多糖的得率达到48.89 mg/g（以干菌粉计）。较多的关于竹荪菌丝体液体发酵的研究主要集中在以提高菌丝体量和产物氨基酸含量的研究为主。
本研究通过培养基中碳源和氮源的筛选、单因试验和Box-Behnken法优化，获得竹荪菌丝体液态深层发酵胞内多糖的最佳培养基配方为：葡萄糖32.3 g/L、酵母粉4.5 g/L、磷酸氢钾2.1 g/L、硫酸镁2.5 g/L。在条件下胞内多糖的理论得率为1.23 g/L。在摇瓶水平下验证竹荪胞内多糖得率为1.19 g/L，与理论预测结果相当。为将优化的实验结果向工业化应用推广，后分别在5、30 L和50 L发酵罐规模下对优化获得的培养基进行不同规模下的验证实验。结果表明在不同规模下竹荪菌丝体的生长稳定，胞内多糖得率稳定，为更大规模化的竹荪菌丝体及其胞内多糖生产提供了很好的实验参考。
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Optimization of Medium Components for Large-Scale Production of Intracellular Polysaccharides from Dictyophora indusiata in Submerged Fermentation
FENG Jie, FENG Na, LIU Yanfang, TANG Qingjiu, ZHOU Shuai, LIU Fang, ZHANG Jingsong, YANG Yan*
(Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization (South), Ministry of Agriculture, National Engineering Research Center of Edible Fungi, Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding of Shanghai, Institute of Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China)
Abstract: The main purpose of this study was to increase the yield of mycelial polysaccharides from Dictyophora indusiata using a large-scale production process. Using a combination of one-factor-at-a-time method and response surface methodology with Box-Behnken design, the optimum medium formulation for the submerged fermentation of D. indusiata was determined as follows: glucose 32.3 g/L, yeast powder 4.5 g/L, potassium dihydrogen phosphate 2.1 g/L, and magnesium sulfate 2.5 g/L. The predicted yield of intracellular polysaccharides was 1.23 g/L, which was close to the experimental value from shake flask fermentation (1.19 g/L). The yields of intracellular polysaccharides in 5-, 30- and 50-L fermentors were 1.43, 1.28 and 1.26 g/L, respectively, which were 16.26%, 4.06% and 2.43% higher than the predicted values, respectively. In this study, the optimized fermentation process gave a high yield of intracellular polysaccharides. Thus, this process provides a good basis for the large-scale production of D. indusiata mycelial polysaccharides.
Keywords: Dictyophora indusiata polysaccharide; mycelium; fermentation process; optimization; large-scale production DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181101-014
收稿日期：2018-11-01
基金项目：2016年度上海市农业领军人才项目；2014年度上海闵行高层次人才科研项目；上海市农业科学院卓越团队建设计划项目（农科创2017（A-06））
第一作者简介：冯杰（1983ü ）（ORCID: 0000-0001-7579-0439），男，副研究员，博士，研究方向为药用真菌发酵调控。E-mail: sytufengjie@163.com
*通信作者简介：杨焱（1970ü ）（ORCID: 0000-0003-1421-8003），女，研究员，博士，研究方向为食药用真菌生物活性物质提取分离及活性研究、食用菌新资源食品开发利用。E-mail: yangyan@saas.sh.cn
中图分类号：TQ920.6
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2020）02-0181-07
引文格式：冯杰, 冯娜, 刘艳芳, 等. 面向规模化应用的竹荪多糖液态深层发酵工艺优化. 食品科学, 2020, 41(2): 181-187. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181101-014. http://www.spkx.net.cn
FENG Jie, FENG Na, LIU Yanfang, et al. Optimization of medium components for large-scale production of intracellular polysaccharides from Dictyophora indusiata in submerged fermentation. Food Science, 2020, 41(2): 181-187. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181101-014. http://www.spkx.net.cn
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