布氏乳杆菌产γ-氨基丁酸发酵条件的优化
布氏乳杆菌产γ-氨基丁酸发酵条件的优化司阔林，徐捐捐，岳田利，袁亚宏，郭春锋*
（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）
摘 要：从中国传统发酵蔬菜中分离获得2 株高产γ-氨基丁酸的布氏乳杆菌S37和布氏乳杆菌J68，为进一步提高其产γ-氨基丁酸的能力，对菌株的发酵条件进行优化。结果表明，2 株菌产γ-氨基丁酸的最优条件为：发酵时间72 h、发酵温度35 ℃、底物L-谷氨酸钠浓度400 mmol/L、初始pH 5.0。在条件下，菌株的γ-氨基丁酸产量分别为 233.9 mmol/L和159.3 mmol/L，对应的L-谷氨酸钠转化率分别为58.5%和39.8%。单因试验发现叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰的添加能显著提高菌株的γ-氨基丁酸产量，在基础上进一步通过响应面试验对其进行优化，发现对于菌株S37最优添加水平分别为8.37 mg/L、0.94 g/L和0.60 g/L，对于菌株J68其最优添加水平分别为10.16 mg/L、 0.97 g/L和0.60 g/L。在该最优条件下，2 株菌的γ-氨基丁酸产量分别达到312.6 mmol/L和251.2 mmol/L，对应的L-谷氨酸钠转化率分别为78.2%和62.8%。
关键词：γ-氨基丁酸；布氏乳杆菌；响应面法；发酵蔬菜；优化
γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种非蛋白质氨基酸，广泛存在于自然界中。GABA作为哺乳动物大脑中的主要抑制性神经递质，具有降血压、抗癫痫、抗抑郁、镇静、预防糖尿病、预防肥胖和促进睡眠等功能。由于其潜在的生物活性，富含GABA的功能性新食品的开发受到越来越多研究者的关注。生产GABA的方法主要包括化学合成法和生物合成法，由于化学合成法存在生产成本高、反应不容易控制、副产物成分复杂且有害等缺点，因化学合成的GABA很难用于食品工业，而生物合成法则具有反应条件温和、环境污染小、安全性高等优点，具有较大的生产食品级GABA的潜力。
多种微生物都可以合成GABA，包括细菌、真菌和酵母，而乳酸菌作为安全的食品微生物，已广泛用于发酵食品的生产中，其GABA产生能力研究也最为广泛。外，部分乳酸菌菌株还具有免疫调节、抑制病原菌以及控制肠道菌群平衡等生物活性。从日本传统发酵食品、韩国黑莓汁、朝鲜发酵泡菜、西班牙奶酪和意大利奶酪中分别分离出的副干酪乳杆菌NFRI 7415、短乳杆菌GABA 100、布氏乳杆菌MS、乳酸乳球菌CECT 8184和植物乳杆菌C48均已被报道可产GABA。王兴洁等从四川泡菜中筛选出1 株产GABA的植物乳杆菌W1-9，以黄瓜汁为发酵培养基，其GABA产量可达到7.62 g/L；黄德娜等从独山盐酸菜液中筛选出1 株产GABA的棉籽糖乳球菌Y-12，其GABA产量为4.06 g/L；Komatsuzaki等从日本发酵水产品分离获得了1 株产GABA的副干酪乳杆菌NFRI 7415，其在底物浓度为500 mmol/L时，GABA产量为302 mmol/L；Li Haixing等从中国泡菜中分离获得了1 株高产GABA的短乳杆菌NCL912，其在补料分批发酵之后，GABA产量高达102.78 g/L左右；Shan等从内蒙古发酵乳中分离获得了1 株产GABA的副干酪乳杆菌NDC75017，其GABA产量最高可达314.56 mg/100 g。
泡菜和酸菜作为中国传统的发酵蔬菜，其中含有多种乳酸菌，而关于中国传统发酵蔬菜来源的布氏乳杆菌产GABA的特性还鲜见报道。本研究旨在对前期从泡菜和酸菜中分离获得的2 株布氏乳杆菌产GABA的发酵条件进行优化，提高其GABA产量，为进一步开发高产GABA的功能性微生态制剂或富含GABA的发酵食品奠定理论基础和提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
布氏乳杆菌S37和布氏乳杆菌J68筛选自中国传统发酵蔬菜，经生工生物工程（上海）股份有限公司进行分子生物学鉴定，保藏于西北农林科技大学食品科学与工程学院健康食品制造与安全控制实验室。
M R S 肉汤培养基 北京陆桥技术有限公司；GABA标准品（99%）、L-谷氨酸钠（L-monosodium glutamate，L-MSG）、丹磺酰氯 美国Sigma-Aldrich 公司；甲醇、丙酮、叶酸、L-半胱氨酸、氯化锰（均为色级） 中国上海Aladdin公司；其他试剂均为分析纯，购自四川西陇化工有限公司。
1.2 仪器与设备
LC-20A型高效液相色（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、UV-2600型紫外分光光度计 日本岛津公司；ZXDP-B2160型恒温培养箱 上海智诚有限公司；HC-3018R型低温高速离心机 安徽科大中佳有限公司；DK-98IIA 型电热恒温水 浴锅 上海沪粤明科学仪器有限公司；YT-CJ-2ND型超净工作台 北京亚泰科隆仪器技术有限公司；涡旋振 荡器 美国Scientific Industries公司；YXQ-LS-70A型立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3 方法
1.3.1 菌株培养
将80 ℃甘油管中保存的菌株解冻后，取50 μL接种于含8 mL MRS肉汤培养基的试管中，于36 ℃静置培养18 h，活化3 代后，用于后续的发酵实验。
1.3.2 布氏乳杆菌产GABA发酵条件的优化
1.3.2.1 发酵时间对GABA产量和细胞生长的影响
发酵温度35 ℃，MRS肉汤培养基中L-MSG浓度400 mmol/L，初始pH 5.0，考察发酵时间（24、48 h和72 h）对GABA产量的影响。发酵结束后，通过HPLC测定发酵液中的GABA含量，同时测定发酵液在600 nm波长处的光密度（OD600 nm），记录细菌细胞的生长情况。
1.3.2.2 发酵温度对GABA产量和细胞生长的影响
发酵时间72 h，MRS肉汤培养基中L-MSG浓度400 mmol/L，初始pH 5.0，考察发酵温度（25、30、35 ℃和40 ℃）对GABA产量的影响。发酵结束后，通过HPLC测定发酵液中的GABA含量，同时测定发酵液OD600 nm，记录细菌细胞的生长情况。
1.3.2.3 L-MSG浓度对GABA产量、L-MSG转化率和细胞生长的影响
发酵时间72 h，发酵温度35 ℃，初始pH 5.0，考察底物浓度（50、100、200、400 mmol/L和600 mmol/L）对GABA产量的影响。发酵结束后，通过HPLC测定发酵液中的GABA含量，同时测定发酵液OD600 nm，记录细菌细胞的生长情况。L-MSG转化率的计公式如下：
式中：A为发酵液中GABA最终浓度；B为发酵液中L-MSG初始添加浓度。
1.3.2.4 初始pH值对GABA产量和细胞生长的影响
发酵时间72 h，发酵温度35 ℃，MRS肉汤培养基中L-MSG浓度400 mmol/L，考察初始pH值（4.5、5.0、5.5和6.0）对GABA产量的影响。发酵结束后，通过HPLC测定发酵液中的GABA含量，同时测定发酵液OD600 nm，记录细菌细胞的生长情况。
1.3.3 影响GABA产量的响应面试验优化
在布氏乳杆菌产GABA最优发酵条件的基础上，根据不同的营养成分对2 株布氏乳杆菌产GABA影响的单因试验结果，筛选出影响合成GABA的主要因，即叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰添加量，并确定了其合适的水平范围。以GABA产量为评价指标，以叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰添加量为考察因，进行3因3水平 Box-Behnken响应面试验，因与水平见表1。
表 1 Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Coded values and corresponding actual values of independent variables use for Box-Behnken design
1.3.4 GABA含量测定
参照Liu Sijin等HPLC法测定发酵液中GABA含量。首先对发酵液进行前处理，发酵液于8 000h g离心10 min，取上清液，进行适当稀释，取50 μL品，与0.5 mL 20 g/L碳酸氢钠溶液和0.5 mL 5 g/L丹磺酰氯丙酮溶液混合，涡旋混匀30 s，60 ℃避光温育30 min，然后向反应混合物中加入100 µL氨水以除去过量的衍生试剂，最后添加甲醇将体积调至2 mL，过0.22 µm有机滤膜，取20 µL品进行HPLC分析。空白对照为不接菌的含有50 mmol/L L-MSG的MRS肉汤培养基。
色条件：色柱为Agilent TC-C18反相色柱（250 mmh 4.6 mm，5 µm）；检测器为紫外检测器，检测波长254 nm；流动相A为含50 mmol/L乙酸钠的四氢呋喃-甲醇-水溶液（1∶15∶84，V/V），用磷酸调节pH 6.2；流动相B为甲醇。梯度洗脱条件为流动相B 在0～25 min内，从10%线性升至45%，维持2 min，27～28 min升至90%，维持5 min，然后在1 min内降到10%，维持7 min，整个梯度洗脱程序持续41 min。柱温35 ℃；流速1 mL/min；进量20 μL。
1.4 数据处理
实验重复3 次，数据表示为f s。利用SPSS 19.0软件进行统计学分析，采用一维方差分析统计组间的显著性差异，组间多重比较采用Tukey法，P＜0.05，差异显著。使用Design-Expert V8.0.6软件进行响应面试验设计并进行相关数据分析。
2 结果与分析
2.1 HPLC分析
图 1 GABA标准品（A）和发酵液样品（B）的HPLC分析图谱
Fig. 1 HPLC chromatograms of GABA standard (A) and fermentation broth sample (B)
标准品浓度为50 mmo/L，上量为20 µL。
如图1所示，在本实验色条件下GABA色形尖锐和对称，无拖尾现象，与品基质色达到了有效分离。
2.2 发酵条件的优化
2.2.1 发酵时间对GABA产量和细胞生长的影响
图 2 发酵时间对GABA产量（A）和细胞生长（B）的影响
Fig. 2 Effect of fermentation time on GABA yield (A) and cell growth (B)
同一株菌字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
由图2A可知，在24～72 h内，随着发酵时间的延长，2 株布氏乳杆菌的GABA产量均逐渐增加。发酵时间在前48 h内，GABA产量增加迅速，在48～72 h之间产量增加缓慢，但增长仍显著（P＜0.05）。由图2B可知，布氏乳杆菌J68在发酵48 h后依然显著增长，而布氏乳杆菌S37在发酵第48小时已经进入了稳定生长期，但依然可以将培养基中剩余的L-MSG缓慢转化为GABA。由可知，布氏乳杆菌产GABA可能并不是严格依赖于细菌细胞的生长，并且选择72 h作为后续产GABA的发酵时间。
2.2.2 发酵温度对GABA产量和细胞生长的影响
温度对布氏乳杆菌GABA产量和细胞生物量有较大影响。由图3可知，2 株布氏乳杆菌的GABA产量和菌体量的变化趋势基本一致，即在25～35 ℃之间，随着温度的升高而增加，并且在35 ℃达到最高值，随后随着温度的升高而降低。对于S37，在不同的发酵温度（30、35、40 ℃）下，GABA产量未发现显著差异，且菌体量有着较小的差异，并且发酵温度为35 ℃时，GABA产量达到最高。对于J68，尽管菌体量在30 ℃和35 ℃之间没有显著差别，且超过35 ℃时菌体量开始缓慢下降，而其GABA产量在35 ℃略高于40 ℃，明显高于30 ℃。这些结果表明，GABA产量在一定情况下取决于菌株的生物量，后续选择35 ℃作为最适发酵温度。这与之前的研究结果基本一致，李海星优化从中国泡菜分离的短乳杆菌NCL912发酵条件之后的最适温度为32 ℃，Lu Xiaoxue等优化从中国传统卷心菜泡菜分离的乳酸乳球菌发酵条件发现最适温度是34 ℃，而且Dhakal等 也报道称乳酸菌生长细胞产GABA的最适发酵温度在30～40 ℃之间。
图 3 发酵温度对GABA产量（A）和细胞生长（B）的影响
Fig. 3 Effect of fermentation temperature on GABA yield (A) and cell growth (B)
2.2.3 L-MSG浓度对GABA产量、L-MSG转化率和细胞生长的影响
在一些乳酸菌中，L-谷氨酸或其钠盐可在谷氨酸脱羧酶（EC 4.1.1.15）作用下发生不可逆的脱羧反应从而合成GABA。由图4A可知，L-MSG浓度在50～400 mmol/L时，2 株布氏乳杆菌的GABA产量逐渐增加，底物浓度为400 mmol/L时，GABA产量达到最高，分别为233.9 mmol/L 和159.3 mmol/L，对应的L-MSG转化率分别为58.5%和39.8%，当L-MSG浓度在400～600 mmol/L时，GABA产量及L-MSG转化率均显著降低。由图4B可知，随着L-MSG浓度的增加，对应的L-MSG转化率会持续降低。由图4C可知，当L-MSG浓度超过100 mmol/L时，菌体量开始减少。因GABA产量的降低可能是由于高浓度的L-MSG抑制了细菌生长和谷氨酸脱羧酶活性。上述结果表明，将底物高效转化为GABA不仅需要高菌体量，还需要适当的初始L-MSG浓度，所以综合考虑，布氏乳杆菌产GABA的最佳L-MSG浓度为400 mmol/L。
图 4 L-MSG浓度对GABA产量（A）、L-MSG转化率（B）和 细胞生长（C）的影响
Fig. 4 Effect of L-MSG concentration on GABA yield (A), L-MSG conversion rate (B) and cell growth (C)
2.2.4 初始pH值对GABA产量和细胞生长的影响
微生物生物合成 GABA受到严格的pH值调控，而且在发酵过程中具有显著作用，保持乳酸菌谷氨酸脱羧酶活性的最佳pH值在4.5～6.0之间。由图5可知，初始pH值对GABA产量和细胞生长具有显著影响。当pH值低于或高于5.0时，GABA产量和细胞生物量均迅速下降，即布氏乳杆菌产GABA的最佳初始pH值为5.0，这与先前关于乳酸菌生长细胞生产GABA的最佳初始pH值的报道一致。然而由于在通过特异性转运蛋白摄取底物后，细胞质脱羧会导致细胞内质子的消耗以及细胞外谷氨酸交换到GABA等更为碱性的底物，发酵液的pH值会随着发酵先下降后略有增加。因，通过控制发酵过程中pH值，GABA生产效率将会更大提高。
图 5 初始pH值对GABA产量（A）和细胞生长（B）的影响
Fig. 5 Effect of initial pH on GABA yield (A) and cell growth (B)
2.3 重要营养成分优化
2.3.1 关键因及其合适添加量范围的确定
表 2 叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰添加量对菌株GABA产量的影响
Table 2 Effects of addition of folic acid, L-cysteine and manganese chloride on GABA yield
注：同一因同列字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
在确定最优的发酵条件之后，通过筛选确定了叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰为促进菌株GABA产生的关键化学添加物。将其按照不同水平添加到发酵培养基中，然后在确定的最优发酵条件下进行发酵实验。如表2所示，叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰在适当质量浓度范围下均能显著提高菌株GABA产量。当叶酸添加量低于10 mg/L 时，GABA产量随添加量增加而升高，当添加量超过10 mg/L时，GABA产量开始下降；当L-半胱氨酸添加量低于1.4 g/L时，菌株的GABA产量随添加量增加而升高，当添加量超过1.4 g/L时，GABA产量保持稳定不变；当氯化锰添加量低于0.6 g/L时，菌株GABA产量随添加量增加而升高，当添加量超过0.6 g/L时，GABA产量开始下降。
2.3.2 响应面优化
2.3.2.1 Box-Behnken设计方案及结果
利用响应面法考察3 个因的交互作用，并利用模型预测GABA产量最高时各因的水平。以叶酸添加量（A）、L-半胱氨酸添加量（B）和氯化锰添加量（C）作为自变量，GABA产量（Y）为响应值，根据 Box-Behnken设计进行了17 组试验，其中5 组中心点重复，试验结果见表3。
表 3 Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Box-Behnken design with experiment results
2.3.2.2 模型的建立与方差分析
利用Design-Expert V8.0.6软件对表3中数据分别进行回归拟合分析，结果如表4、5所示。两个模型的P值均小于0.000 1，失拟项P值均大于0.05，表明回归模型极显著。预测值与试验值之间有很好的相关性，R2值分别为0.990 5和0.992 8。由F值可知，各因对菌株S37产GABA的影响大小为：氯化锰添加量（C）＞叶酸添加 量（A）＞L-半胱氨酸添加量（B）；而对菌株J68产GABA的影响大小为：氯化锰添加量（C）＞L-半胱氨酸添加量（B）＞叶酸添加量（A）。经回归拟合，分别得到2 株菌Y1和Y2的次多元回归方程：
表 4 菌株S37 Box-Behnken试验方差分析
Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial model for GABA yield of strain S37
注：*.差异显著（P＜0.05）；**.差异极显著（P＜0.01）。下同。
表 5 菌株J68 Box-Behnken试验方差分析
Table 5 Analysis of variance of quadratic polynomial model for GABA yield of strain J68
2.3.2.3 最优因水平确定及验证
利用Design-Expert V8.0.6软件对回归模型进行极值求取分析，发现对于菌株S37，叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰的最优添加量分别为8.37 mg/L、0.94 g/L和 0.60 g/L，对于菌株J68，叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰最优添加量分别为10.16 mg/L、0.97 g/L和0.60 g/L。模型预测的最高产量分别为323.3 mmol/L和261.4 mmol/L。在最佳水平下进行验证实验，发现菌株S37和J68的实际GABA产量分别为312.6 mmol/L和251.2 mmol/L，对应的L-MSG转化率分别为78.2%和62.8%，与预测值基本一致，表明响应面试验建立的模型具有较高的准确度。与未添加上述物质的对照培养基相比，2 株菌的GABA产量分别提高了34%和58%。尽管在发酵过程中未使用发酵罐控制发酵系统的pH值，也未采用分批补料发酵模式，但2 株菌的GABA产量也高于大多数文献报道的乳酸菌的GABA产量。由于优化后布氏乳杆菌S37的GABA产量显著高于氏乳杆菌J68，因布氏乳杆菌S37更具有潜在的工业应用价值。
3 结 论
本研究以中国传统发酵蔬菜来源的2 株布氏乳杆菌为研究对象，研究不同发酵条件对布氏乳杆菌GABA产量和菌株生长的影响，结果表明2 株菌S37和J68具有相似的变化趋势，且其产GABA的最优发酵条件一致：发酵时间72 h、发酵温度35 ℃、底物L-MSG浓度 400 mmol/L、初始pH 5.0。培养基中添加叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰能显著提高2 株菌的GABA产量，通过响应面试验优化其添加量后，其GABA产量分别为 312.6 mmol/L和251.2 mmol/L，对应的L-MSG转化率分别为78.2%和62.8%。布氏乳杆菌S37具有更高的GABA产量，具有进一步开发利用的潜力。
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Optimization of Fermentation Conditions for γ-Aminobutyric Acid Production by Lactobacillus buchneri
SI Kuolin, XU Juanjuan, YUE Tianli, YUAN Yahong, GUO Chunfeng*
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)
Abstract: Two Lactobacillus buchneri strains, S37 and J68, with great ability to produce γ-aminobutyric acid (GABA) had been isolated from Chinese traditional fermentable vegetables in our previous study. In this study, in order to further improve their GABA production ability, the fermentation conditions were optimized. The results showed that the optimal fermentation conditions for the two strains were as follows: time of 72 h, temperature of 35 ℃, L-monosodium glutamate (L-MSG) concentration of 400 mmol/L, and initial pH of 5.0. Under these conditions, the GABA yields for the two strains were 233.9 and 159.3 mmol/L, respectively, and the L-MSG conversion rates were 58.5% and 39.8%, respectively. The onefactor-at-a-time experiments demonstrated that folic acid, L-cysteine and manganese chloride significantly enhanced the GABA production of the two strains. The addition levels of these compounds were optimized to be 8.37 mg/L, 0.94 g/L and 0.60 g/L for strain S37, and 10.16 mg/L, 0.97 g/L and 0.60 g/L for strain J68, respectively by response surface methodology, resulting in GABA yields of 312.6 and 251.2 mmol/L and L-MSG conversion rates of 78.2% and 62.8%, respectively.
Keywords: γ-aminobutyric acid; Lactobacillus buchneri; response surface methodology; fermented vegetable; optimization
收稿日期：2018-12-18
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31301444）
第一作者简介：司阔林（1994ü ）（ORCID: 0000-0001-5320-6713），男，硕士研究生，研究方向为益生菌科学。E-mail: 987114391@qq.com
*通信作者简介：郭春锋（1978ü ）（ORCID: 0000-0001-7609-9454），男，副教授，博士，研究方向为益生菌科学与技术、乳品科学与技术。E-mail: gcf@nwafu.edu.cn
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181218-210
中图分类号：TS201.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2020）02-0087-07
引文格式：司阔林, 徐捐捐, 岳田利, 等. 布氏乳杆菌产γ-氨基丁酸发酵条件的优化. 食品科学, 2020, 41(2): 87-93. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181218-210. http://www.spkx.net.cn
SI Kuolin, XU Juanjuan, YUE Tianli, et al. Optimization of fermentation conditions for γ-aminobutyric acid production by Lactobacillus buchneri. Food Science, 2020, 41(2): 87-93. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181218-210. http://www.spkx.net.cn
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