不同热处理方式的α-乳白蛋白对正常人肠道 上皮细胞株增...
不同热处理方式的α-乳白蛋白对正常人肠道 上皮细胞株增殖、周期及凋亡的影响盛 雪，张居典，李梦寒，崔东影，席恩泽，许晓曦*
（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）
摘 要：以经过巴氏杀菌方式（63 ℃加热30 min、72 ℃加热15 s、85 ℃加热15 s、95 ℃加热10 min）处理的α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）为对象，研究其对正常人肠道上皮细胞株（human intestinal epithelial cells，HIEC）增殖、周期及凋亡的影响，并比较不同热处理对HIEC作用效果的差异性。在通过圆二色光谱测定α-LA二级结构、分析不同热处理方式对α-LA二级结构影响的基础上，模拟婴儿肠道条件对α-LA进行体外消化，采用CCK-8法和流式细胞术检测热处理消化后α-LA作用HIEC 48 h后，对细胞增殖、细胞周期以及细胞凋亡的影响。结果显示：经不同加热处理及未经热处理的消化后α-LA均对HIEC增殖具有促进作用，且在一定范围内促进效果随α-LA质量浓度升高而加强，在α-LA质量浓度为0.10 mg/mL、72 ℃加热15 s时促进效果最为显著（P＜0.05）；经不同加热处理及未经热处理的消化后α-LA在质量浓度为0.10 mg/mL、作用HIEC 48 h后，G0/G1期细胞比例显著降低 （P＜0.05），S期和G2/M期细胞比例显著升高（P＜0.05），细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）。综上，热处理α-LA可以明显促进HIEC增殖，其作用机制可能与分裂细胞的比例增加从而抑制细胞凋亡有关。α-LA应用于婴儿配方产品中或可提高婴儿免疫能力，推荐添加量为0.10 mg/mL，推荐热处理方式为72 ℃加热15 s，但仍需进一步研究。
关键词：α-乳白蛋白；正常人肠道上皮细胞株；二级结构；肠道免疫
α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）是一种由乳腺腺泡上皮合成的特殊蛋白质，广泛存在于人、牛、山羊、骆驼、马等哺乳动物的乳汁中。α-LA由123 个氨基酸残基组成，其分子质量约为14.2 kDa。α-LA在牛乳中的质量浓度为1.0～1.5 g/L，约占总蛋白的3.4%；在人乳中质量浓度为2～3 g/L，占总蛋白的25%～35%。研究发现，α-LA具有合成乳糖、抑菌、抗病毒、免疫调节、抗氧化、抗癌等多种生物学功能。我国每年有大量新生儿需要以配方奶粉为主食，由于α-LA是人乳中的主要蛋白质，因此在婴儿配方奶粉中强化α-LA可以缩小牛乳喂养与母乳喂养的差距。Davis等研究发现与喂养标准配方奶粉的婴儿相比，α-LA强化配方奶粉喂养婴儿与母乳喂养婴儿的胃肠道耐受性更为相似，便秘或返流问题的发生率也随之降低。
从食品安全和婴儿健康的角度考虑，工厂会在乳粉生产时对其进行一定程度的加热，而在加工过程中所采用的加工工艺对于婴儿配方奶粉的营养、感官等都有影响，高热处理会对牛乳成分造成较大的热损伤，乳中乳糖异构化和降解、乳清蛋白变性、美拉德反应也更为严重。α-LA作为一种热敏性成分，巴氏杀菌是否影响其生物活性尚不明确。目前我国对α-LA在婴儿配方奶粉中的添加量没有具体规定，巴氏杀菌后的α-LA对肠道免疫机制方面的研究也鲜见报道。
本研究以α-LA为原料，探究经巴氏杀菌方式热处理后的α-LA对正常人肠道上皮细胞株（human intestinal epithelial cells，HIEC）免疫活性的影响变化，探讨巴氏杀菌后的α-LA对人肠道免疫作用可能的机制，从而掌握α-LA在婴儿配方奶粉中适宜添加的剂量范围，以及充分保持其免疫调节活性的热加工工艺技术参数，为进一步对新型α-LA强化婴儿配方奶粉加工工艺提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牛α-LA（纯度99%） 美国HILMAR公司；HIEC 北纳生物细胞公司；RPMI-1640完全培养基、胰酶、0.25%乙二胺四乙酸 美国GIBCO公司；胎牛血清 以色列B I 公司；H a n k’s 液、二甲基亚砜 北京BioTopped公司；青霉素-链霉素溶液（100×）、胃蛋白酶、胰蛋白酶（≥250 U/mg） 北京Solarbio生物科技有限公司；细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期试剂盒、Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒 南京建成生物科技有限公司；其余化学试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
HF90型CO2培养箱 北京市六一仪器厂；BPG-9070A 型鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；AE-31型 倒置显微镜 麦克奥迪实业集团有限公司；DSX-280B型 高压灭菌锅 上海申安公司； 血球计数板 上海求精生化试剂仪器有限公司；3K15型高速冷冻离心机 德国Sigma公司；BSA224S型分析天平 德国Sartorius公司；Airall流式细胞仪 美国BD公司；圆二色光谱仪 日本JASCO公司。
1.3 方法
1.3.1 α-LA的加热处理
以工厂常用的杀菌方式为依据，确定本实验所用的热处理方式为63 ℃处理30 min、72 ℃处理15 s、85 ℃处理15 s、95 ℃处理10 min。准确称量5 份α-LA，每份各1 g，加入去离子水10 mL并将其充分混合均匀，分别于63 ℃处理30 min、72 ℃处理15 s、85 ℃处理15 s、95 ℃处理10 min，另一份不做任何加热处理。热处理后所有α-LA样品保存于4 ℃备用。
1.3.2 模拟婴儿肠道消化α-LA
配制人工胃液：取稀盐酸用pH计调节至pH 4，每100 mL添加胃蛋白酶0.8 g（按每毫克蛋白消耗22.75 U计）； 将上述4 种经不同热处理与未经热处理的α-LA溶液分别与100 mL人工胃液混合，于37 ℃恒温摇床上以135 r/min消化水解1.5 h；经胃蛋白酶消化后的蛋白液用pH计调节至pH 6.5。
配制人工肠液：取磷酸二氢钾0.68 g加入到上述消化液中，混合均匀后再添加胆盐0.12 g、胰蛋白酶1 g（按每毫克蛋白消耗3.45 U计），不断振荡使其均匀混合；37 ℃恒温摇床上以135 r/min消化水解2 h，然后沸水浴5 min灭活，最后用0.22 μm滤器过滤除菌备用。得到的蛋白消化液通过真空冷冻干燥处理后，置于4 ℃保存备用。
1.3.3 不同热处理方式的α-LA二级结构的测定
将63 ℃处理30 min、72 ℃处理15 s、85 ℃处理15 s、95 ℃处理10 min组与未经热处理的α-LA分别配制为蛋白质量浓度0.2 g/L的溶液，取2 mL。圆二色光谱仪扫描范围为190～250 nm，实验温度为20 ℃，样品池光程为2 mm，灵敏度为100 mdeg/cm，取8 次扫描的平均值。利用圆二色光谱仪测定α-LA的二级结构，采用曲线拟合软件计算α-LA的二级结构中α-螺旋、β-折叠、 β-转角和无规卷曲的相对含量。
1.3.4 细胞培养和试剂配制
将HIEC复苏后，培养于含10%（质量分数，下同）胎牛血清以及1%青霉素-链霉素溶液（100×）的 RPMI-1640完全培养液中，并将细胞置于37 ℃含5% CO2的培养箱中，每2 d更换1 次培养液，待贴壁细胞达到80%左右时，按照25 cm2的培养瓶加入1 mL胰酶的比例加入适量胰酶消化，进行传代培养或细胞冻存。分别将63 ℃处理30 min、72 ℃处理15 s、85 ℃处理15 s、95 ℃处理10 min组与未经热处理的消化后α-LA用含有3%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液（100×）的RPMI-1640培养液配制成0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL溶液，置于4 ℃保存备用。
1.3.5 不同热处理方式的α-LA对HIEC增殖的影响
将100 μL（1h 105 个/mL）处于对数生长期的HIEC接种到96 孔板中，培养24 h后，弃原培养液，分别将100 μL 0、0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL不同热处理及不经热处理的α-LA加入含3%胎牛血清的培养基中，每组设6 个复孔，培养48 h后，在避光状态下，向每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，将培养板放回培养箱中再培养2 h后立即使用酶标仪测定在450 nm波长处的吸光度。计算不同质量浓度、不同热处理方式的α-LA作用HIEC后其增殖率的变化，从而筛选出效果较佳的两个样品质量浓度用于后续实验。以正常细胞为对照。细胞增殖率计算公式如下。
1.3.6 不同热处理方式的α-LA对HIEC周期的影响
用质量浓度为0.10、0.20 mg/mL不同热处理及不经热处理的α-LA分别处理HIEC 48 h后，按照细胞周期试剂盒说明书收集漂浮及贴壁细胞，用4 ℃磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤细胞后，加入4 ℃预冷的体积分数70%乙醇溶液，置于4 ℃固定24 h后，再用PBS洗涤细胞，向每组细胞样品中加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液0.5 mL，重悬，37 ℃避光温浴30 min，在488 nm波长处采用流式细胞仪检测，数据采用ModFit LT软件进行分析。
1.3.7 不同热处理方式的α-LA对HIEC凋亡的影响
在6 孔细胞培养板上每孔接种5h 105 个对数生长期的HIEC，铺板24 h后，分别加入质量浓度为0.1、 0.2 mg/mL不同热处理及不经热处理的α-LA，48 h后按照细胞凋亡试剂盒说明书收集漂浮及贴壁细胞，用PBS洗涤1 次，随后向细胞样品中加入Annexin V-FITC结合液195 μL、Annexin V-FITC 5 μL，轻轻混匀，避光于室温下孵育15 min；加入PI染色液10 μL，混匀，避光染色5 min，1 h内采用流式细胞仪检测。
1.4 数据统计与分析
每组实验重复3 次。数据均使用Statistix 8软件进行分析，并用Origin 8.5软件作图，结果以平均值±标准差表示。P＜0.05为差异显著。
2 结果与分析
2.1 不同热处理方式对α-LA二级结构的影响
圆二色光谱法广泛应用于蛋白质二级结构的测定，因具备测定快速、简便以及对构象变化灵敏等特点，成为目前蛋白质构象研究的主要手段之一。通过圆二色光谱测定不同热处理方式的α-LA二级结构相对含量结果见表1。
表 1 不同热处理方式的α-LA二级结构相对含量
Table 1 Secondary structure relative contents of α-LA treated by different heating methods
由表1可知，未经加热处理的α-LA二级结构主要为β-折叠和无规卷曲，分别占41.5%和44.9%，经不同加热方式处理后，α-LA的二级结构相对含量在一定范围内发生了变化，其中，经72 ℃加热15 s的α-LA变化最明显。与未经加热处理组相比，经72 ℃加热15 s的α-LA的α-螺旋相对含量减少了5.9%，β-折叠和无规卷曲相对含量分别增加10.3%和1.3%，β-转角完全消失。经85 ℃加热15 s的α-LA的二级结构也发生明显改变。与未经加热处理组相比，经85 ℃加热15 s的α-LA α-螺旋相对含量减少了3.3%，β-折叠和无规卷曲相对含量分别增加5.7%和3.4%，β-转角完全消失。综上所述，在经72 ℃加热15 s和85 ℃加热15 s的α-LA中，全部β-转角以及部分α-螺旋转化为β-折叠和无规卷曲。经95 ℃加热10 min的α-LA各二级结构相对含量又恢复至未经加热处理组水平的趋势，这有待进一步研究。
2.2 不同热处理方式的α-LA对HIEC增殖的影响
细胞增殖是经过细胞生长、DNA复制和细胞分裂使细胞数目增加的过程。通过CCK-8法检测不同热处理方式及未经热处理的α-LA作用HIEC 48 h后的细胞增殖情况，结果如图1所示。
图 1 不同热处理方式的α-LA对HIEC增殖作用的影响
Fig. 1 Effect of α-LA with different heat treatments on the proliferation of HIEC
从图1可以看出，与未经加热处理组相比，经不同热处理方式及未经热处理的α-LA在0.01～0.20 mg/mL范围内作用HIEC 48 h后，对HIEC的增殖能力均有促进作用。在0.01～0.10 mg/mL质量浓度范围，细胞增殖率随着α-LA质量浓度的增加而逐渐上升，并且相同条件处理样品在不同质量浓度下细胞增殖率存在明显差异。在0.10～0.20 mg/mL质量浓度范围，随着α-LA质量浓度的增加，细胞增殖率反而逐渐降低，这可能是由于在高质量浓度下，一部分α-LA水解物结合在一起，不能完全发挥促进增殖的作用，这有待进一步的研究。不同热处理方式及未经热处理的α-LA均在质量浓度为0.10 mg/mL时达到最大增殖促进效果，其中，经过72 ℃处理15 s的α-LA对HIEC的增殖促进效果最佳，与未经加热处理的α-LA相比差异显著（P＜0.05）。结果表明，HIEC数量的增加与α-LA质量浓度呈现出一定的剂量效应关系，达到最大增殖效果时，α-LA的质量浓度 为0.10 mg/mL，加热方式为72 ℃处理15 s。而通过分析不同加热方式对α-LA二级结构的变化结果可知，经72 ℃处理15 s的α-LA二级结构相对含量变化最明显，这可能是由于加热使α-LA促进细胞增殖的活性基团暴露，这有待进一步研究。
Izumi等研究证实，α-LA的水解产物可以促进哺乳期大鼠的肠上皮隐窝细胞增殖，增加肠道长度，促进肠道生长和成熟。Lin等研究发现低质量浓度α-LA可使小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7细胞活力增强。 Sternhagen等也得出类似的结果，即Caco-2细胞的增殖率可在低质量浓度的α-LA刺激下呈现上升趋势。
本研究为了进一步探讨α-LA促进HIEC增殖的机制是否与细胞周期、细胞凋亡相关，利用流式细胞术检测α-LA质量浓度为0.10、0.20 mg/mL时细胞周期与凋亡率的变化。
2.3 不同热处理方式的α-LA对HIEC周期的影响
细胞周期指细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成的过程，分为DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和有丝分裂期（M期），长期停滞在G1期的细胞又称为G0期。通过流式细胞术检测不同热处理方式的α-LA作用HIEC 48 h后对细胞周期的影响，结果如图2所示。
图 2 0.10 mg/mL α-LA对HIEC周期的影响
Fig. 2 Effect of α-LA at 0.10 mg/mL on HIEC cell cycle
表 2 0.10 mg/mL α-LA作用HIEC 48 h的细胞周期分布
Table 2 Cell cycle distribution of HIEC treated with α-LA at 0.10 mg/mL for 48 h
注：同列肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
当质量浓度为0.10 mg/mL时，经不同热处理及未加热处理的α-LA作用HIEC 48 h后，细胞周期中 G0/G1、S＋G2/M期的细胞分布情况如图2、表2所示。与对照组相比，5 个给药组G0/G1期的细胞比例均显著减少（P＜0.05），S期和G2/M期的细胞比例均显著增加 （P＜0.05）。结果表明，0.10 mg/mL α-LA可以促进细胞进入S期和G2/M期，从而增加进行正常分裂的细胞比例，达到促进细胞增殖的效果；不同加热方式处理的α-LA与未经热处理的α-LA相比，HIEC的周期分布变化无显著性差异，说明本实验选择的加热方式对HIEC的细胞周期影响不明显。
图 3 0.20 mg/mL α-LA对HIEC周期的影响
Fig. 3 Effect of α-LA at 0.20 mg/mL on HIEC cell cycle
表 3 0.20 mg/mL α-LA作用HIEC 48 h的细胞周期分布
Table 3 Cell cycle distribution of HIEC treated with α-LA at 0.20 mg/mL for 48 h
当质量浓度为0.20 mg/mL时，经不同热处理及未加热处理的α-LA作用HIEC 48 h后，细胞周期中G0/G1、 S＋G2/M期的细胞分布情况如图3、表3所示。与对照组相比，5 个给药组的G0/G1期的细胞比例均有所降低， S＋G2/M期的细胞比例增加，但差异不显著。结果表明，0.20 mg/mL α-LA对HIEC的细胞周期影响不大；α-LA对HIEC周期的影响具有一定的剂量依赖性，与细胞增殖的结果一致。
2.4 不同热处理方式的α-LA对HIEC凋亡的影响
细胞凋亡指由基因控制的细胞自主有序的死亡。通过流式细胞术检测不同热处理方式的α-LA作用HIEC 48 h后对细胞凋亡率的影响，结果如图4所示。
图 4 0.10 mg/mL α-LA对HIEC凋亡的影响
Fig. 4 Effect of α-LA at 0.10 mg/mL on apoptosis of HIEC
表 4 0.10 mg/mL的α-LA作用HIEC 48 h的细胞凋亡率
Table 4 Apoptosis rates of HIEC treated with α-LA at 0.10 mg/mL for 48 h
当质量浓度为0.10 mg/mL时，经不同热处理及未经加热处理的α-LA作用HIEC 48 h后，细胞凋亡情况如图4、 表4所示。与对照组相比，5 个给药组的细胞晚期凋亡率以及总凋亡率均显著降低（P＜0.05）。结果表明，0.10 mg/mL α-LA对HIEC凋亡有明显抑制作用，并且这种作用不受本实验中加热方式的影响。
图 5 0.20 mg/mL α-LA对HIEC凋亡的影响
Fig. 5 Effect of α-LA at 0.20 mg/mL on apoptosis of HIEC
表 5 0.20 mg/mL α-LA作用HIEC 48 h的细胞凋亡率
Table 5 Apoptosis rates of HIEC treated with α-LA at 0.20 mg/mL for 48 h
当质量浓度为0.20 mg/mL时，经不同热处理及未经加热处理的α-LA作用HIEC 48 h后，HIEC凋亡情况如 图5、表5所示。5 个给药组细胞总凋亡率与对照组相比均有所降低，但差异不显著。说明0.20 mg/mL α-LA对HIEC凋亡率影响不大；α-LA抑制HIEC凋亡的作用效果具有一定剂量依赖性，与细胞增殖和细胞周期的结果一致。
3 结 论
不同热处理α-LA对HIEC增殖的作用效果具有一定的剂量依赖性，其作用机制与细胞周期、细胞凋亡相关。根据HIEC的来源和特性，本研究结果表明，优化的热处理牛α-LA在适宜的添加量下应用于婴儿配方奶粉中，可能发挥促进婴儿肠道上皮细胞生长，进而调节婴幼儿免疫的能力。推荐热处理α-LA的添加量为0.10 mg/mL，与乳粉加工巴氏杀菌方式结合的最佳热处理工艺条件为72 ℃、15 s，以保持α-LA的生物活性。其具体应用与产品开发需进一步研究。
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Effect of α-Lactalbumin with Different Heat Treatments on Proliferation, Cell Cycle and Apoptosis of Human Intestinal Epithelial Cells
SHENG Xue, ZHANG Judian, LI Menghan, CUI Dongying, XI Enze, XU Xiaoxi*
(School of Food Science, Northeast Agriculture University, Harbin 150030, China)
Abstract: The effects of α-lactalbumin (α-LA) treated by pasteurization (63 ℃/30 min, 72 ℃/15 s, 85 ℃/15 s, or 95℃/10 min) on the proliferation, cell cycle and apoptosis of normal human intestinal epithelial cells (HIEC) were studied and compared. The secondary structure of α-LA with different pasteurization treatments was determined by circular dichroism spectroscopy. Then, the pasteurized α-LA was digested in vitro under simulated infant intestinal conditions and the effect of the resulting α-LA hydrolysates on the proliferation, cell cycle and apoptosis of HIEC cells at 48 h of culture was detected by cell counting kit-8 (CCK-8) assay and flow cytometry. The results showed that both raw and pasteurized α-LAs could significantly promote the proliferation of HIEC cells in a concentration-dependent manner in a certain range, and the most significant (P < 0.05) effect was achieved under the conditions of pasteurization at 72 ℃ for 15 s and 0.10 mg/mL concentration. Flow cytometry showed that both digested pasteurized α-LA and digested α-LA at a concentration of 0.10 mg/mL significantly reduced the percentage of HIEC cells in the G0/G1 phase (P < 0.05), increased the percentage of HIEC cells in the G2/M and S phase (P < 0.05), and decreased cell apoptosis (P < 0.05). These results indicated that pasteurized α-LA could significantly promote the proliferation of HIEC cells, and its mechanism may be related to the increase of the proportion of dividing cells and the consequent inhibition of apoptosis. The supplementation of α-LA pasteurized at 72 ℃ for 15 s at a recommended concentration of 0.10 mg/mL to infant formulas may improve immune function in infants, which needs to be further explored.
Keywords: α-lactalbumin; normal human intestinal epithelial cells; secondary structure; intestinal immunity
收稿日期：2018-11-19
基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目（2013BAD18B00）
第一作者简介：盛雪（1994—）（ORCID: 0000-0003-0789-5313），女，硕士研究生，研究方向为乳品科学与技术、乳品安全与质量管理。E-mail: 734702301@qq.com
*通信作者简介：许晓曦（1968—）（ORCID: 0000-0002-4350-0094），女，教授，博士，研究方向为乳品科学与技术、乳品安全与质量管理。E-mail: xiaoxi_xu01@163.com
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181119-211
中图分类号：TS252.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2020）01-0139-08
引文格式：
盛雪, 张居典, 李梦寒, 等. 不同热处理方式的α-乳白蛋白对正常人肠道上皮细胞株增殖、周期及凋亡的影响. 食品科学, 2020, 41(1): 139-146. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181119-211. http://www.spkx.net.cn
SHENG Xue, ZHANG Judian, LI Menghan, et al. Effect of α-lactalbumin with different heat treatments on proliferation, cell cycle and apoptosis of human intestinal epithelial cells. Food Science, 2020, 41(1): 139-146. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181119-211. http://www.spkx.net.cn
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