二苯乙烯苷对冈田酸致NG108-15细胞Tau蛋白磷酸化的影响
二苯乙烯苷对冈田酸致NG108-15细胞Tau蛋白磷酸化的影响Δ摘 要 目的：观察二苯乙烯苷（TSG）对冈田酸（OA）诱导致NG108-15细胞Tau蛋白磷酸化的影响，探讨该化合物抗阿尔茨海默病（AD）的可能机制。方法：以OA诱导NG108-15细胞复制AD细胞模型，采用MTT法检测经TSG低、中、高剂量（50、100、200 μmol/L）预处理后的细胞存活率，采用吖啶橙/溴乙锭双染色法检测细胞凋亡情况，采用Western blotting法和逆转录-聚合酶链反应法检测细胞周期蛋白依赖性激酶5（CDK5）、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）蛋白及其mRNA以及Tau、磷酸化Tau（p-Tau）蛋白的表达情况，采用免疫荧光法检测CDK5、GSK3β、Tau蛋白的分布情况。结果：正常对照组细胞形态正常，未见或少见CDK5、GSK3β、Tau蛋白分布。模型组可见固缩或圆珠状的早期凋亡细胞，且CDK5、GSK3β、Tau蛋白分布明显增多，其细胞存活率显著降低，CDK5、GSK3β蛋白及其mRNA的相对表达量以及p-Tau与Tau相对表达量的比值（p-Tau/Tau）均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。经TSG预处理后，各给药组早期凋亡细胞和CDK5、GSK3β、Tau蛋白分布均有所减少，其细胞存活率均显著升高，中、高剂量组细胞CDK5蛋白、p-Tau/Tau以及各剂量组细胞CDK5 mRNA、GSK3β蛋白及其mRNA的相对表达量均显著降低（P＜0.05）。结论：TSG对AD模型细胞具有一定的保护作用，这种作用与其提高细胞存活率，下调磷酸激酶CDK5、GSK3β的蛋白表达和基因转录水平，抑制Tau蛋白的磷酸化有关。
关键词 二苯乙烯苷；NG108-15细胞；阿尔茨海默病；Tau蛋白；磷酸化；周期蛋白依赖性激酶5；糖原合成酶激酶3β
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）亦称老年性痴呆，是一种以近期记忆障碍为主要临床症状，β淀粉样蛋白沉积致老年斑、Tau蛋白过度磷酸化致神经元纤维缠结以及神经元丢失伴胶质细胞增生为特征性病理改变的一种进行性神经退行性疾病。其中，Tau蛋白为一种磷酸蛋白，其磷酸化程度是体内多种磷酸化特异性蛋白激酶和脱磷酸化蛋白磷酸酶相互作用平衡的结果。在正常情况下，大部分Tau蛋白是不会被磷酸化的，但在AD或其他Tau病变（如进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病等）患者大脑中，Tau蛋白被过度磷酸化。由此可见，Tau蛋白磷酸化异常在AD的发病机制中发挥了重要的作用，调节Tau蛋白表达及其磷酸化水平可能成为干预AD进展的有效手段之一。
2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷是一种多羟基酚类化合物，简称二苯乙烯苷（TSG）。该化合物分子式为C20H22O9，分子量为406.39，是中药何首乌的主要生物活性成分。有研究指出，TSG具有保护神经、提高学习记忆力、抗衰老、防治AD、舒张血管、保护肝脏、降血脂、抗炎、抗肿瘤等药理活性。本研究通过冈田酸（OA）诱导致NG108-15细胞Tau蛋白异常磷酸化，模拟AD的发病机制以建立AD细胞模型，考察了TSG对AD发病关键物质Tau蛋白及其磷酸化水平的影响，以期揭示该化合物抗AD的作用机制，为其临床应用提供实验依据和理论支持。
1 材料
1.1 仪器
3111型CO2细胞培养箱、Nanodrop3000型微量核酸蛋白分析仪、Micro17R型高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Spectra Max Plus 384型连续光谱扫描式酶标仪（香港分子仪器公司）；7300型实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪（美国ABI公司）；CKX-41型荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）；Odyssey SA型双色红外荧光扫描成像系统（美国LI-COR公司）。
1.2 药品与试剂
TSG对照品（批号：#017M4703V，纯度：≥98%）、OA（批号：#SLBS1501V）均购自美国Sigma公司；DMEM高糖培养基（美国Gibco公司，批号：8116486）；胎牛血清（澳大利亚AusGenex公司，批号：FBSSA00418-2）；MTT试剂（合肥白鲨生物科技有限公司，批号：2016106）；兔源Tau多克隆抗体（批号：00036062）、兔抗小鼠周期蛋白依赖性激酶5（CDK5）单克隆抗体（批号：00032730）、兔抗小鼠糖原合成酶激酶3β（GSK3β）单克隆抗体（批号：00041503）、兔抗小鼠β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（批号：00057922）均购自美国Proteinech Group公司；兔抗小鼠磷酸化Tau（p-Tau）单克隆抗体（美国Cell Signaling公司，批号：1）；山羊抗兔IgG二抗（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：C70620-05）；Western一抗稀释液（批号：082118180821）、Western二抗稀释液（批号：061418180703）均购自碧云天生物技术公司；Trizol试剂（批号：AA7101-1）、PCR试剂盒（含TBⅡ®Premix Ex TaqⅡ、ROX Reference Dye等试剂，批号：AI1777A）、逆转录试剂盒（批号：AI12361A）均购自宝生物工程（大连）有限公司，CDK5、GSK3β、甘油醛-3-硫酸脱氢酶（GAPDH）扩增引物均由宝生物工程（大连）有限公司设计、合成；十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）蛋白上样缓冲液（上海雅酶生物科技有限公司，批号：2017042415）；磷酸酶抑制剂（北京康为世纪生物科技公司，批号：20351）；抗荧光淬灭封片剂[生工生物工程（上海）股份有限公司，批号：D105FA0005]；青链霉素混合液（批号：20170929）、胰蛋白酶消化液（批号：20181109）、RIPA高效快速裂解液（批号：20171021）、苯甲基磺酰氟（PMSF）（批号：20161025）、吖啶橙/溴乙锭（AO/EB）染色试剂（AO、EB试剂体积比为1∶1，批号：20161029）、Triton X-100试剂（批号：524A0510）、封闭用山羊血清（BSA，批号：1206C052）、4′，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）试剂（批号：20170927）均购自北京索莱宝科技有限公司；其余试剂均为分析纯，水为纯化水。
1.3 细胞
大、小鼠神经瘤混合细胞NG108-15购自广州新晋生物科技有限公司。
2 方法
2.1 细胞培养与传代
将NG108-15细胞用含10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的DMEM高糖培养基（以下简称“完全培养基”）于37℃、5%CO2培养箱中培养（培养条件下同），每天观察细胞生长状态。待细胞融合至85%后，用胰蛋白酶消化、吹打，以800 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀加入完全培养基适量，反复吹打使之成为单细胞悬液，并分装至2～3个培养瓶中，继续培养。
2.2 AD细胞模型复制
采用OA诱导。取对数生长期的NG108-15细胞适量，以适宜密度接种至培养板中，培养24 h。吸弃上清液，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，下同）清洗3次后，加入以完全培养基配制的80 nmol/L OA溶液（浓度根据本课题组前期预试验结果确定），继续培养24 h以复制AD细胞模型。
2.3 细胞增殖情况检测
采用MTT法检测。取对数生长期的NG108-15细胞适量，以6×104个/孔接种于96孔板中，培养24 h。将细胞随机分为正常对照组、模型组和TSG低、中、高剂量组（50、100、200 μmol/L，剂量设置参考本课题组前期预试验结果），每组设5个复孔。吸弃各孔上清液，正常对照组加入完全培养基1 mL，各给药组加入含相应药物的完全培养基1 mL，继续培养24 h。除正常对照组外，其余各组均按“2.2”项下方法复制AD细胞模型。随后每孔加入5 mg/L的MTT溶液10 μL，避光孵育4 h，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜100 μL，室温振荡10 min，使用连续光谱扫描式酶标仪于490 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值，并计算细胞生存率，生存率（%）＝（试验组细胞平均OD值/正常对照组细胞平均OD值）×100%。上述试验重复3次。
2.4 细胞凋亡情况检测
采用AO/EB双染色法检测。取对数生长期的NG108-15细胞适量，以4×105个/孔接种于6孔板中，培养24 h。按“2.3”项下方法分组，每组设3个复孔。正常对照组加入完全培养基5 mL，各含药组加入含相应药物的完全培养基5 mL，继续培养24 h。除正常对照组外，其余各组均按“2.2”项下方法复制AD细胞模型。随后用PBS清洗2次，每孔加入AO/EB染色试剂20 μL和PBS 1 mL，混匀，避光孵育2～5 min后，使用荧光倒置显微镜观察细胞凋亡情况，并拍照[活细胞（VE）：核染色质着绿色，且结构正常；早期凋亡细胞（VA）：核染色质着绿色，呈固缩或圆珠状]。
2.5 CDK5、GSK3β、Tau、p-Tau蛋白表达情况检测
采用Western blotting法检测。取对数生长期的NG108-15细胞适量，以6×105个/孔接种于6孔板中，培养24 h。按“2.3”项下方法分组，每组设5个复孔。正常对照组加入完全培养基1 mL，各含药组加入含相应药物的完全培养基1 mL，继续培养24 h。除正常对照组外，其余各组均按“2.2”项下方法复制AD细胞模型。随后吸弃上清液，用PBS清洗2次，加入蛋白裂解液（RIPA高效快速裂解液、PMSF、磷酸酶抑制剂按体积比100∶1∶1配制）150 μL，于冰上裂解30 min，收集上清液，于4 ℃下以12 000 r/min离心15 min，取上清液，使用微量核酸蛋白分析仪测定蛋白浓度。蛋白经5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液稀释后，于95～100℃变性5 min。取变性蛋白适量行SDS-PAGE，电泳结束后湿法转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，用TBST溶液清洗5 min×3次，加入相应一抗[内参（β-actin）的稀释度为1∶5 000，其余蛋白的稀释度均为1∶1 000]，4℃孵育过夜；用TBST溶液清洗5 min×3次，加入二抗（稀释度为1∶10 000），37℃摇床避光孵育2 h，用TBST溶液清洗5 min×3次后，采用双色红外荧光扫描成像系统成像并使用ImageJ V1.48u软件进行定量分析，以相应蛋白与内参条带的灰度值比值表示该蛋白的相对表达量。上述试验重复3次。
2.6 CDK5、GSK3β mRNA表达情况检测
采用逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测。取对数生长期的NG108-15细胞适量，以6×105个/孔接种于6孔板中，培养24 h。按“2.3”项下方法分组，每组设3个复孔。正常对照组加入完全培养基1 mL，各含药组加入含相应药物的完全培养基1 mL，继续培养24 h。除正常对照组外，其余各组均按“2.2”项下方法复制AD细胞模型。随后采用Trizol法抽提细胞总RNA，使用微量核酸蛋白分析仪检测RNA浓度及纯度（即A260 nm/A280 nm；当A260 nm/A280 nm为1.8～2.1，表明RNA的纯度较高），将提取的RNA按试剂盒步骤进行去DNA和逆转录后，采用两步法以实时荧光定量PCR仪进行扩增。反应体系（共20 μL）：上/下引物（引物序列见表1）各0.8µL、模板cDNA 2µL、2×TBⅡ®Premix Ex TaqⅡ 10µL、50×ROX Reference Dye 0.4µL、无酶水6µL。反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃延伸31 s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2－ΔΔCt法计算各目的mRNA的相对表达量（Ct表示每个反应管内荧光信号强度达到设定阈值时所经历的循环数）。上述试验重复3次。
表1 引物序列
Tab 1 Primer sequence
2.7 CDK5、GSK3β、Tau蛋白分布情况检测
采用免疫荧光法检测。取对数生长期的NG108-15细胞适量，以4×105个/孔接种于6孔板中（培养板中有玻片），培养24 h。按“2.3”项下方法分组，每组设3个复孔。正常对照组加入完全培养基1 mL，各含药组加入含相应药物的完全培养基1 mL，继续培养24 h。除正常对照组外，其余各组均按“2.2”项下方法复制AD细胞模型。随后吸弃各孔上清液，用PBS清洗5 min×3次。将细胞置于4%多聚甲醛溶液中固定20 min，用PBS清洗5 min×3次，于0.2%Triton X-100试剂中静置5 min，用PBS清洗5 min×3次，用5%BSA-PBS混合溶液封闭30 min，把装有玻片的培养板放于自制湿盒中，室温孵育1 h后，吸弃多余液体。在玻片上滴加相应一抗（CDK5、GSK3β、Tau的稀释度分别为1∶500、1∶300、1∶200），4℃孵育过夜，用PBS清洗5 min×3次，加入二抗（稀释度为1∶1 000），室温避光孵育1 h，用PBS清洗5 min×3次，加入DAPI试剂50 μL，室温避光孵育5 min。取出玻片，晾干，加入抗荧光淬灭封片剂适量，于荧光倒置显微镜下观察目标蛋白的分布情况（目标蛋白呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光）。
2.8 统计学方法
采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。P＜0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 TSG对AD模型细胞存活情况的影响
与正常对照组比较，模型组细胞的存活率显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，TSG各剂量组细胞的存活率均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），详见表2。
3.2 TSG对AD模型细胞凋亡情况的影响
正常对照组可见大量VE，呈绿色，且形态未见异常。模型组可见部分VA，呈固缩或圆珠状；经TSG预处理后，各给药组VA均有所减少，详见图1（图中，“圆圈”表示VE，“箭头”表示VA）。
表2 TSG对AD模型细胞存活率的影响（±s，n＝3）
Tab 2 Effects of TSG on survival rate of AD model cells（±s，n＝3）
注：与正常对照组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05
Note：vs.normal control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05
图1 TSG对AD模型细胞凋亡情况影响的显微图（AO/EB双染色，×200）
Fig 1 Micrographs of the effects of TSG on the apoptosis of AD model cells（AO/EB double fluorescence staining，×200）
3.3 TSG对AD模型细胞CDK5、GSK3β、Tau、p-Tau蛋白表达的影响
与正常对照组比较，模型组细胞CDK5、GSK3β的相对表达量以及p-Tau与Tau相对表达量的比值（p-Tau/Tau）均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，TSG中、高剂量组细胞CDK5的相对表达量和p-Tau/Tau以及各剂量组细胞GSK3β的相对表达量均显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），详见图2、表3。
3.4 TSG对AD模型细胞CDK5、GSK3β mRNA表达的影响
与正常对照组比较，模型组细胞CDK5、GSK3β mRNA的相对表达量均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，TSG各剂量组细胞CDK5、GSK3β mRNA的相对表达量均显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），详见表4。
图2 TSG对AD模型细胞CDK5、GSK3β、Tau、p-Tau蛋白表达影响的电泳图
Fig 2 Electrophoresis of the effects of TSG on the protein expression of CDK5，GSK3β，Tau and p-Tau inAD model cells
表3 TSG对AD模型细胞CDK5、GSK3β、Tau、p-Tau蛋白表达的影响（±s，n＝3）
Tab 3 Effects of TSG on the expression of CDK5，GSK3β，Tau and p-Tau in AD model cells（±s，n＝3）
注：与正常对照组比较，＊P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05
Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05
表4 TSG对AD模型细胞CDK5、GSK3β mRNA表达的影响（±s，n＝3）
Tab 4 Effects of TSG on mRNA expression of CDK5
and GSK3β inAD model cells（±s，n＝3）
注：与正常对照组比较，＊P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05
Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05
3.5 TSG对AD模型细胞CDK5、GSK3β、Tau分布的影响
正常对照组细胞中，未见或少见CDK5、GSK3β、Tau蛋白分布。模型组细胞中，CDK5、GSK3β、Tau蛋白分布明显增多。经TSG预处理后，各给药组细胞中CDK5、GSK3β、Tau蛋白的分布均有不同程度的减少，详见图3～图5（图中，“箭头”表示目标蛋白）。
4 讨论
AD作为一种进行性神经退行性疾病，其主要的神经病理性特征包括β淀粉样蛋白沉积所导致的老年斑、Tau蛋白过度磷酸化造成的神经元纤维缠结以及神经元丢失伴胶质细胞增生。现有研究证实，AD的发生与β淀粉样蛋白、Tau蛋白有关，且后者的异常磷酸化可导致AD患者的认知障碍。因此，抑制和调控Tau蛋白的磷酸化可能是预防和治疗AD的关键。
TSG是我国传统中药何首乌的主要活性成分。研究表明，该化合物具有抗氧化、抗衰老、防治AD、提高DNA修复功能等作用。本课题组前期以淀粉样前体蛋白（APP）/早老蛋白1（PS1）双转基因AD模型小鼠为对象，发现TSG能有效改善其学习记忆功能，但具体机制尚不清楚。NG108-15细胞是神经瘤细胞，具有与神经元细胞相似的生理结构和形态特点，能较好地模拟AD的病理过程。因此，本研究通过OA诱导NG108-15细胞Tau蛋白异常磷酸化以建立AD模型，初步探讨TSG对Tau蛋白磷酸化水平的影响及可能机制。
图3 TSG对AD模型细胞CDK5蛋白分布的影响（免疫荧光法，×400）
Fig 3 Effects of TSG on the distribution of CDK5 protein in AD model cells（immunofluorescence，×400）
图4 TSG对AD模型细胞GSK3β蛋白分布的影响（免疫荧光法，×400）
Fig 4 Effects of TSG on the distribution of GSK3β protein in AD model cells（immunofluorescence，×400
图5 TSG对AD模型细胞Tau蛋白分布的影响（免疫荧光法，×400）
Fig 5 Effects of TSG on the distribution of Tau protein in AD model cells（immunofluorescence，×400）
Tau蛋白的异常磷酸化是AD的重要病理特征之一，可引发神经毒性反应，从而破坏神经元细胞骨架的正常生理功能。在病理状态下，Tau聚集可导致神经元死亡进而造成认知障碍。本研究结果显示，模型组可见固缩或圆珠状的VA和聚集的Tau蛋白，其细胞存活率较正常对照组显著降低，p-Tau/Tau较正常对照组显著升高，提示OA可导致神经细胞Tau蛋白的异常磷酸化，增加Tau蛋白的聚集，最终造成细胞凋亡。经TSG预处理后，各给药组VA和Tau蛋白均有不同程度的减少，各剂量组细胞的存活率均较模型组显著升高，中、高剂量组细胞p-Tau/Tau均较模型组显著降低，提示TSG可抑制OA诱导的Tau磷酸化，并减少Tau蛋白的聚集和细胞的凋亡。
CDK5和GSK3β已被确定为引发神经退行性疾病Tau蛋白异常磷酸化的主要蛋白激酶。其中，CDK5是调控Tau蛋白磷酸化的重要激酶，可引起Tau蛋白11个磷酸化位点的磷酸化，与神经元迁移、细胞黏附、突触活化、多巴胺传递等信号通路底物作用有关，是神经系统发育及功能维持的必需蛋白之一；GSK3β可加重神经系统炎症反应，增加β淀粉样蛋白的生成，并降低AD患者体内乙酰胆碱的合成，造成神经元丢失，与Tau蛋白磷酸化过程、细胞凋亡及患者记忆障碍密切相关。本研究结果显示，正常对照组细胞未见或少见CDK5、GSK3β蛋白分布。经OA诱导后，模型组细胞CDK5、GSK3β蛋白分布明显增多，CDK5、GSK3β蛋白及其mRNA的相对表达量均较正常对照组显著升高，提示细胞Tau磷酸化异常可能与CDK5、GSK3β蛋白表达增强有关。经TSG预处理后，各给药组细胞CDK5、GSK3β蛋白分布有所减少，中、高剂量组细胞CDK5蛋白以及各剂量组CDK5 mRNA、GSK3β蛋白及其mRNA的相对表达量均较模型组显著降低，提示TSG对Tau磷酸化的调控作用可能是通过抑制CDK5、GSK3β蛋白的表达及其mRNA的转录来实现的。
综上所述，TSG可下调相关磷酸激酶的蛋白表达和基因转录水平，抑制Tau蛋白的磷酸化，提高细胞存活率，对AD模型细胞具有一定的保护作用。但TSG与Tau蛋白磷酸化相关蛋白磷酸激酶间的相互作用机制尚有待后续研究进一步完善。
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